骨髓间充质干细胞输注对再生障碍性贫血模型小鼠骨髓造血功能的影响
结 果
MSC对再生障碍性贫血小鼠存活率的影响
照射组于照射后2-3天、2周体重轻微下降，3周左右恢复正常，至28天时均存活。模型组于制模后3-7天体重明显下降，第9天略有回升，12天再次明显下降，苍白、活动明显减少，弓背，松毛，9只于12-19天死亡，解剖发现各脏器苍白，胸腺、脾脏、淋巴结萎缩，部分小鼠小肠有出血点，另2只于3周后体重回升，活动渐增多，毛光滑，模型组小鼠28天存活率为18.2%。MSC组体重变化与照射组相似，2只于16天死亡，其28天存活率为80%。各组KaplanMeier生存函数曲线如图1所示，MSC组与模型组生存曲线比较差别具有极显著意义（LogRank统计量=7.33，p=0.0068）。
MSC对外周血象的影响
结果见附表。如表所示，模型组小鼠于制模后7天WBC明显下降，与MSC组及照射组比较差异均具有显著意义（p
MSC对骨髓造血的影响
再生障碍性贫血模型小鼠濒死前单测骨髓有核细胞数为0.03×107，存活至28天的2只小鼠骨髓有核细胞数均为0.3×107，造血集落培养在实验中均无集落形成；制模后28天 MSC组骨髓有核细胞数平均为1.3×107，显著高于模型组（p
讨 论
再生障碍性贫血模型小鼠经亚致死量射线照射后，造血干细胞和骨髓微环境均受到严重损伤，当输入次要组织相容性抗原不合的小鼠胸腺淋巴结细胞后，可进一步诱导免疫性骨髓造血功能损伤。再生障碍性贫血小鼠的病理改变与人类再生障碍性贫血相似，是目前筛选治疗药物较理想的再生障碍性贫血模型［6］。姚军等采用的照射剂量是6Gy，再生障碍性贫血发生率为96.2%，死亡时间集中在制模后8-14天。我们在预实验中采用6Gy照射剂量，4只照射小鼠于照射后2周左右均死亡，6只模型小鼠于制模后7-8天全部死亡，照射剂量偏大。本研究将照射剂量调整为5 Gy，照射组小鼠均出现一过性全血细胞减少，3周左右血象基本恢复正常，而模型组小鼠于制模后1周出现血象下降，81.8%于3周内因造血功能衰竭死亡，病理检查符合再生障碍性贫血表现。
MSC具有高增殖和多向分化潜能，易于采集、分离纯化和体外扩增，不表达或仅表达可忽略水平的MHCⅡ及T细胞共刺激分子B71、B72、CD40、CD40L，免疫原性弱［7］，在细胞治疗、基因治疗中具有广泛的应用前景。近年来证实，MSC除具有促进体内造血重建外，还具有抑制同种异基因免疫反应、降低移植物抗宿主病的作用［1,2］。本研究结果显示，于制模后3天静脉输注MSC可减慢再生障碍性贫血模型小鼠白细胞下降速度，促进骨髓造血恢复，明显降低死亡率。骨髓病理切片结果进一步证实，MSC静脉输注对再生障碍性贫血小鼠骨髓造血恢复具有积极作用。MSC促进再生障碍性贫血小鼠骨髓造血恢复的机制尚不清楚，可能与下列因素有关：①免疫负调节作用：体外实验证实，MSC具有抑制异基因淋巴细胞增殖作用，且有剂量依赖性，但其作用机制尚不十分清楚。陆晓茜等［2］认为，MSC可能是通过细胞间相互作用及诱导T淋巴细胞亚群由Th1、Tc1向Th2、Tc2极化有关；宁红梅等［8］体外实验研究提示，MSC的免疫负调节作用可能与诱导CD4+CD25+免疫调节性T细胞增高有关。本研究于制模后3天输入一定剂量的MSC，在一定程度上可以抑制胸腺淋巴结细胞介导的针对造血系统的免疫反应，从而减轻免疫介导性骨髓损伤。MSC组小鼠外周血象和骨髓病理改变与单照射组小鼠结果基本一致，这些高度提示MSC主要是通过免疫负调节作用抑制再生障碍性贫血小鼠体内免疫反应，从而改善再生障碍性贫血小鼠预后。②修复造血微环境，促进骨髓造血：射线照射可严重损伤骨髓造血细胞和造血微环境，MSC有向损伤组织处及炎症反应部位迁移的特性，给再生障碍性贫血小鼠静脉输注MSC可使MSC主要归巢至骨髓，并通过细胞间直接接触或通过分泌转化生长因子β1、造血生长因子等间接方式发挥造血支持、组织修复和局部免疫调节作用。
绝大多数儿童再生障碍性贫血是T淋巴细胞介导的免疫性骨髓损伤，免疫抑制治疗有效率达79%［9］，但其中部分患儿血象恢复不完全或复发，且仍有少部分患儿对免疫抑制治疗无效。除同胞HLA全相合骨髓移植外，目前对免疫抑制治疗无效或复发的患儿尚缺乏有效治疗方法，临床上亟待探索新的治疗手段。MSC因具有免疫负调节及支持造血双重作用，且具有可移植性，在再生障碍性贫血细胞治疗中可能发挥重要作用。
【参考文献】
1Novelli E, Buyaner D, Chopra R, et al. Human mesenchymal stem cellscan enhance human CD34+ cells repopulation of NOD/SCID mice.Blood,1998; 92:116a
2陆晓茜，刘霆，孟文彤等.人骨髓间充质干细胞对淋巴细胞的免疫调节作用. 中国实验血液学杂志，2005;13：651-655
3黄永兰，黄绍良，包蓉等. 再生障碍性贫血儿童TCR Vβ 亚家族T细胞克隆性增殖及其与HLADRB1*15的关系. 中山大学学报·医学科学版， 2006; 27：161-168，172
4黄永兰，黄绍良，魏菁等. 再生障碍性贫血患儿骨髓造血干/祖细胞缺陷与细胞免疫功能异常的关系. 中华血液学杂志，2006;27：129-131
5陈静，王茜，施英唐等. 再生障碍性贫血患儿骨髓间充质干细胞的生物学特点. 中国实验血液学杂志，2005；13：832-838
6姚军，李树浓.淋巴细胞与再生障碍性贫血关系的实验研究.中华血液学杂志，1991;12：229-231
7周敦华，黄绍良，吴燕峰等.人间充质干细胞体外扩增及生物学特性的研究.中华儿科杂志，2003;41：607-610
8宁红梅，金建刚，扈江伟等. 人骨髓间充质干细胞体外对异基因T淋巴细胞表型的影响. 中国实验血液学杂志，2005;3：43-49
9FangJP, Xu HG, Huang SL, et al. Immunosuppressive treatment of aplasticanemia in chinese children with antithymocyte globulin andcyclosporine. Pediatri Hematol Oncol, 2006; 23:45-50
骨髓间充质干细胞输注对再生障碍性贫血模型小鼠骨髓造血功能的影响
结 果
MSC对再生障碍性贫血小鼠存活率的影响
照射组于照射后2-3天、2周体重轻微下降，3周左右恢复正常，至28天时均存活。模型组于制模后3-7天体重明显下降，第9天略有回升，12天再次明显下降，苍白、活动明显减少，弓背，松毛，9只于12-19天死亡，解剖发现各脏器苍白，胸腺、脾脏、淋巴结萎缩，部分小鼠小肠有出血点，另2只于3周后体重回升，活动渐增多，毛光滑，模型组小鼠28天存活率为18.2%。MSC组体重变化与照射组相似，2只于16天死亡，其28天存活率为80%。各组KaplanMeier生存函数曲线如图1所示，MSC组与模型组生存曲线比较差别具有极显著意义（LogRank统计量=7.33，p=0.0068）。
MSC对外周血象的影响
结果见附表。如表所示，模型组小鼠于制模后7天WBC明显下降，与MSC组及照射组比较差异均具有显著意义（p
MSC对骨髓造血的影响
再生障碍性贫血模型小鼠濒死前单测骨髓有核细胞数为0.03×107，存活至28天的2只小鼠骨髓有核细胞数均为0.3×107，造血集落培养在实验中均无集落形成；制模后28天 MSC组骨髓有核细胞数平均为1.3×107，显著高于模型组（p
讨 论
再生障碍性贫血模型小鼠经亚致死量射线照射后，造血干细胞和骨髓微环境均受到严重损伤，当输入次要组织相容性抗原不合的小鼠胸腺淋巴结细胞后，可进一步诱导免疫性骨髓造血功能损伤。再生障碍性贫血小鼠的病理改变与人类再生障碍性贫血相似，是目前筛选治疗药物较理想的再生障碍性贫血模型［6］。姚军等采用的照射剂量是6Gy，再生障碍性贫血发生率为96.2%，死亡时间集中在制模后8-14天。我们在预实验中采用6Gy照射剂量，4只照射小鼠于照射后2周左右均死亡，6只模型小鼠于制模后7-8天全部死亡，照射剂量偏大。本研究将照射剂量调整为5 Gy，照射组小鼠均出现一过性全血细胞减少，3周左右血象基本恢复正常，而模型组小鼠于制模后1周出现血象下降，81.8%于3周内因造血功能衰竭死亡，病理检查符合再生障碍性贫血表现。
MSC具有高增殖和多向分化潜能，易于采集、分离纯化和体外扩增，不表达或仅表达可忽略水平的MHCⅡ及T细胞共刺激分子B71、B72、CD40、CD40L，免疫原性弱［7］，在细胞治疗、基因治疗中具有广泛的应用前景。近年来证实，MSC除具有促进体内造血重建外，还具有抑制同种异基因免疫反应、降低移植物抗宿主病的作用［1,2］。本研究结果显示，于制模后3天静脉输注MSC可减慢再生障碍性贫血模型小鼠白细胞下降速度，促进骨髓造血恢复，明显降低死亡率。骨髓病理切片结果进一步证实，MSC静脉输注对再生障碍性贫血小鼠骨髓造血恢复具有积极作用。MSC促进再生障碍性贫血小鼠骨髓造血恢复的机制尚不清楚，可能与下列因素有关：①免疫负调节作用：体外实验证实，MSC具有抑制异基因淋巴细胞增殖作用，且有剂量依赖性，但其作用机制尚不十分清楚。陆晓茜等［2］认为，MSC可能是通过细胞间相互作用及诱导T淋巴细胞亚群由Th1、Tc1向Th2、Tc2极化有关；宁红梅等［8］体外实验研究提示，MSC的免疫负调节作用可能与诱导CD4+CD25+免疫调节性T细胞增高有关。本研究于制模后3天输入一定剂量的MSC，在一定程度上可以抑制胸腺淋巴结细胞介导的针对造血系统的免疫反应，从而减轻免疫介导性骨髓损伤。MSC组小鼠外周血象和骨髓病理改变与单照射组小鼠结果基本一致，这些高度提示MSC主要是通过免疫负调节作用抑制再生障碍性贫血小鼠体内免疫反应，从而改善再生障碍性贫血小鼠预后。②修复造血微环境，促进骨髓造血：射线照射可严重损伤骨髓造血细胞和造血微环境，MSC有向损伤组织处及炎症反应部位迁移的特性，给再生障碍性贫血小鼠静脉输注MSC可使MSC主要归巢至骨髓，并通过细胞间直接接触或通过分泌转化生长因子β1、造血生长因子等间接方式发挥造血支持、组织修复和局部免疫调节作用。
绝大多数儿童再生障碍性贫血是T淋巴细胞介导的免疫性骨髓损伤，免疫抑制治疗有效率达79%［9］，但其中部分患儿血象恢复不完全或复发，且仍有少部分患儿对免疫抑制治疗无效。除同胞HLA全相合骨髓移植外，目前对免疫抑制治疗无效或复发的患儿尚缺乏有效治疗方法，临床上亟待探索新的治疗手段。MSC因具有免疫负调节及支持造血双重作用，且具有可移植性，在再生障碍性贫血细胞治疗中可能发挥重要作用。
【参考文献】
1Novelli E, Buyaner D, Chopra R, et al. Human mesenchymal stem cellscan enhance human CD34+ cells repopulation of NOD/SCID mice.Blood,1998; 92:116a
2陆晓茜，刘霆，孟文彤等.人骨髓间充质干细胞对淋巴细胞的免疫调节作用. 中国实验血液学杂志，2005;13：651-655
3黄永兰，黄绍良，包蓉等. 再生障碍性贫血儿童TCR Vβ 亚家族T细胞克隆性增殖及其与HLADRB1*15的关系. 中山大学学报·医学科学版， 2006; 27：161-168，172
4黄永兰，黄绍良，魏菁等. 再生障碍性贫血患儿骨髓造血干/祖细胞缺陷与细胞免疫功能异常的关系. 中华血液学杂志，2006;27：129-131
5陈静，王茜，施英唐等. 再生障碍性贫血患儿骨髓间充质干细胞的生物学特点. 中国实验血液学杂志，2005；13：832-838
6姚军，李树浓.淋巴细胞与再生障碍性贫血关系的实验研究.中华血液学杂志，1991;12：229-231
7周敦华，黄绍良，吴燕峰等.人间充质干细胞体外扩增及生物学特性的研究.中华儿科杂志，2003;41：607-610
8宁红梅，金建刚，扈江伟等. 人骨髓间充质干细胞体外对异基因T淋巴细胞表型的影响. 中国实验血液学杂志，2005;3：43-49
9FangJP, Xu HG, Huang SL, et al. Immunosuppressive treatment of aplasticanemia in chinese children with antithymocyte globulin andcyclosporine. Pediatri Hematol Oncol, 2006; 23:45-50