微生物工程实验报告
题 目： 乳酸菌的分离及酸奶的发酵
专业名称： 生物技术
班 级： 2012级8班
学生姓名： 黄雨
学 号： [1**********]6
2014年 11 月 25 日
乳酸菌的分离及酸奶的发酵
生物技术专业2012级 学生：黄雨
摘要
本实验让市售酸奶经梯度稀释后稀释至10-10，然后划线法接种于pH值为7.0和5.5的改良BCP试管培养基中，在培养箱中37℃培养72h。再经富集培养后对菌形态特征进行观察。在酸奶发酵时，用市售鲜奶作为原料，经均质、热处理，冷却等步骤后，将分离出的乳酸菌接种于其中，再经发酵（包括主发酵、后发酵）后，对成品进行品评，以表格形式表现出来。
关键词：分离、乳酸菌、酸奶发酵、品评
Separation Of Lactic Acid Bacteria And Yogurt Fermentation
Professional:Biotechnology Grade:2012 Instructor:Huangyu
Abstract：
In this experiment, we will dilute the the market yogurt to 10-10,then,we will make it inoculate into the BCP medium modified tube that the PH is 7.0 and 5.5 in Scribing methods,then make it In an incubator at 37℃ 72h,then after enrichment culture of bacteria,the morphology were observed.When yoghurt after fermentation, using a commercially available milk as a raw material, after homogenization, heat treatment, cooling step, the isolated lactic acid bacteria were inoculated thereto, and then the fermentation (including primary fermentation, after fermentation), on the
finished product tasting in tabular forms.
Key words:
Separation, lactic acid bacteria, yogurt fermentation, tasting
1 引言：
酸奶是一种风味独特,营养价值高,并具有整肠、健胃、助消化以及增强人体免疫力的凝乳状发酵乳制品，保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌是酸奶发酵中常用的乳酸菌菌种，乳酸菌是兼性厌氧菌。酸奶历史非常悠久, 自从20 世纪初俄国著名科学家梅奇尼科夫提出了“酸奶长寿说”以后, 酸奶的保健、长寿、美容等功效不断为现代医学所揭示, 致使酸奶发展迅速, 产量及质量不断提高。
2 实验目的、内容、步骤
一 基本原理
酸奶中乳酸菌的产生来源于乳糖发酵，大部分乳酸菌都进行同型发酵，即乳糖磷酸化为6-磷酸乳糖，再降解为葡萄糖和6-磷酸半乳糖，葡萄糖经过EMP途径降解为乳酸；6-磷酸半乳糖转化为6-磷酸葡萄糖后，才能生成乳酸。保加利亚乳杆菌中的β-半乳糖苷酶活性较高。大部分乳糖直接经过β-半乳糖苷酶降解为葡萄糖和半乳糖。然后，葡萄糖经过EMP途径降解为乳酸。 二 实验准备
人员安排：全班一起实验，前三张桌子，分三个大组（附上名单）每组摆放的物品（主要的准备工作） 1、市售酸奶 1，3组共3瓶。 2、试管架，1，共3
3、2ml无菌移液管1，共3
4、50ml梯度稀释三角瓶（内装18ml无菌水，其中1个含玻璃珠），10（9+1），共30个
5、吸耳球，1，共3 6、接种环，1，共3
7、BCP试管培养基（15mm×150mm试管），pH值为7. 0和5. 5的培养基各18，共54+54，再次转接时还需要54+54，总共108支 8、记号笔，1，共3
9、MRS液体培养基：50ml三角瓶中装10ml，pH值为7. 0和5. 5的培养基各18，共54+54，共108瓶 10、酒精灯，6，共18 11、精密pH试纸
12、BCP平板培养基，54皿。
13、种子培养基：6瓶，250ml三角瓶装液150ml（选优良种子作），共18瓶
14、电炉，1，共3 15、铝锅，1，共3
16、100ml量筒，1，共3；500ml量筒，1，共3
17、1000ml搪瓷缸，4，共12（发酵完毕保证每人分装200ml，后熟） 18、250ml纸杯（装200ml），18，共54
19、脱脂奶粉1.5kg，固形物12%，每人200ml，约需1.4kg。 20 白砂糖 5%配量，每人200ml×5%=10g, 54人，540克，买1 kg。
三 实验方法 (一) 乳酸菌的分离 1 材料与方法
1.1 样品来源 市售酸奶。 1.2 实验药品 1.3 实验仪器
培养箱，灭菌锅，试管架，无菌水，pH试纸，接种环，酒精灯，三角瓶，玻璃珠，不干胶标签，15mm×150mm试管，棉花，橡皮塞（单独灭菌后代替棉塞），
1.4 培养基
1.4.1 分离用培养基: 改良的BCP 培养基(牛肉膏0.3% ,蛋白胨0.5% ,葡萄糖0.3% , 碳酸钙1%(单独消毒后加入),琼脂2%, 调pH7.0和5.5, 121℃灭菌15 分钟, 备用。
1.4.2 液体富集培养基:MRS 培养基(蛋白胨 10g, 牛肉膏10g,酵母膏 5g, K2HPO4 2g,柠檬酸二铵2g，乙酸钠 2g, 葡萄糖20g,吐温80 1mL,7水硫酸镁 0.58g，7水硫酸锰 0.25g), 用于纯菌株增殖培养。调pH值至7. 0 和5. 5, 分别培养乳酸球菌和乳酸杆菌。
1.4.3 菌种保存培养基：改良的BCP 培养基。
1. 4.4 种子培养基：牛肉膏5g/L，蛋白胨10g/L，酵母膏5g/L，番茄汁100g/L，pH 6.5，120℃灭菌15 min。 1. 5 操作方法
菌种分离：将酸乳梯度稀释至10-10,（或稍粘点直接划线） 摇动待分离菌种的稀释液，以接种环沾取一环菌液，划线法分别接种于pH值为7.0和5.5的改良
BCP试管培养基中，试管用灭菌的橡皮塞代替棉塞封口。接好种后，置培养箱中, 37℃培养72h。
富集培养：将初次分离的菌种1环接种入MRS中(pH值分别为7. 0和5. 5)，摇瓶过夜。次日再回接入改良的BCP试管培养基中(球菌、杆菌各1支)。
形态特征观察：对分离到的菌显微观察，杆菌呈杆状, 单在、双在或呈链状; 球菌呈球形或卵圆形, 多成双, 也呈长链。
发酵性能初试：取1环分离得到的乳酸杆菌和球菌, 点种入改良的BCP平板上（共4个点，球菌、杆菌，各两点，以记号笔标号记录），以透明圈直径与菌落直径之比，表示菌株产生乳酸的能力。
(二) 酸奶的发酵
1 种子的制备:
将获得的2株菌各1环，接种入150ml的种子培养基（250ml三角瓶），37℃培养过夜。
2 生产工艺流程:
原料配方→均质→热处理→冷却→接种→发酵→冷藏→包装→贮藏→成品 3 操作流程: (1)原料配方
市售鲜奶(比重1.028)100%或相当于此质量的纯奶粉稀释液（固体含量在12%左右），蔗糖5%（相当于鲜奶量）
注：配料的多少，按生产量计。如每生产200ml，则20人的配料体积为4000ml。
(2)均质：160kg/cm2,50-70℃
(3)热处理：95℃，5min (4)冷却至45℃ (5)接种 3% (1:1) (6)发酵
主发酵：温度42℃，接种后，1h分装完毕。2.5h-4h,pH即可降到4.5-4.3，产生凝乳，可停止发酵。
后发酵：主发酵结束后，要装入小容器内转移至冷室中放置过夜，进行后熟，这就是后发酵。 后熟过程中冷却的速度相当重要，冷却过快，会引起乳清分离；冷却太慢，会使酸度继续升高而超标，一般认为在1h左右温度降至10-15℃为好。冷却放置过夜后（可于冰箱中冷藏）就可以作为产品上市。
(7)品评 5℃品评，以表的形式反映。
品评指标：凝乳组织状态；洁白程度；细腻程度；有无沙感；爽口性，香气；甜度；酸度。 四 结果与分析 实验结果：
不同奶粉所制酸奶感官品质、脱水收缩度
奶粉试样 酸奶感官性状 脱水收缩度(ml/100ml料样) A 凝块凝固均匀,有光泽,乳香味浓厚,无乳清析出 59 B 凝块凝固良好,有光泽,乳香味一般,少量乳清析出 61 C 凝块浓稠状,不坚实,乳香味浓厚,无乳清析出 54 D 凝块凝结状态一般,微有芳香味,乳清析出较多 66 E 凝块稠密坚实均匀,无光泽,微香,无乳清析出 41
脱水收缩度: 室温下用定量滤纸过滤100ml 散碎的酸奶凝块3h分离出的乳清量(ml)。
实验讨论及分析：
1接种菌含量少，凝固时间长----增加接种量。
2 以牛肉膏等原料种子繁殖后，从颜色气味看有点糟糕，是否用牛奶或奶粉加糖繁殖，学生才会喝。
3 没有充分比较两种菌所产酸奶的质量---单独发酵、混合发酵比较试验，试验室提前准备两株菌扩大，学生分离的不纯。
4 是否可以对一些指标进行检测，比如酸度、氨基酸、多肽等
5 由于本实验是分组实验，在实验过程中应尽量做到让每个人都参与到实验中，实验全程都应该尽量严谨认真，特别是在菌种分离及培养上，切勿染上其它细菌。
参考文献
[1]马辉文，张甲耀.微生物工程（第二版）[M].曹军卫主编.食品和饮料发酵.北京：科学出版社，2007.367~400
[2]王杰;余碧玉.酸奶中主要挥发性风味成分的分析.食品科学.[M].1989.51-53
微生物工程实验报告
题 目： 乳酸菌的分离及酸奶的发酵
专业名称： 生物技术
班 级： 2012级8班
学生姓名： 黄雨
学 号： [1**********]6
2014年 11 月 25 日
乳酸菌的分离及酸奶的发酵
生物技术专业2012级 学生：黄雨
摘要
本实验让市售酸奶经梯度稀释后稀释至10-10，然后划线法接种于pH值为7.0和5.5的改良BCP试管培养基中，在培养箱中37℃培养72h。再经富集培养后对菌形态特征进行观察。在酸奶发酵时，用市售鲜奶作为原料，经均质、热处理，冷却等步骤后，将分离出的乳酸菌接种于其中，再经发酵（包括主发酵、后发酵）后，对成品进行品评，以表格形式表现出来。
关键词：分离、乳酸菌、酸奶发酵、品评
Separation Of Lactic Acid Bacteria And Yogurt Fermentation
Professional:Biotechnology Grade:2012 Instructor:Huangyu
Abstract：
In this experiment, we will dilute the the market yogurt to 10-10,then,we will make it inoculate into the BCP medium modified tube that the PH is 7.0 and 5.5 in Scribing methods,then make it In an incubator at 37℃ 72h,then after enrichment culture of bacteria,the morphology were observed.When yoghurt after fermentation, using a commercially available milk as a raw material, after homogenization, heat treatment, cooling step, the isolated lactic acid bacteria were inoculated thereto, and then the fermentation (including primary fermentation, after fermentation), on the
finished product tasting in tabular forms.
Key words:
Separation, lactic acid bacteria, yogurt fermentation, tasting
1 引言：
酸奶是一种风味独特,营养价值高,并具有整肠、健胃、助消化以及增强人体免疫力的凝乳状发酵乳制品，保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌是酸奶发酵中常用的乳酸菌菌种，乳酸菌是兼性厌氧菌。酸奶历史非常悠久, 自从20 世纪初俄国著名科学家梅奇尼科夫提出了“酸奶长寿说”以后, 酸奶的保健、长寿、美容等功效不断为现代医学所揭示, 致使酸奶发展迅速, 产量及质量不断提高。
2 实验目的、内容、步骤
一 基本原理
酸奶中乳酸菌的产生来源于乳糖发酵，大部分乳酸菌都进行同型发酵，即乳糖磷酸化为6-磷酸乳糖，再降解为葡萄糖和6-磷酸半乳糖，葡萄糖经过EMP途径降解为乳酸；6-磷酸半乳糖转化为6-磷酸葡萄糖后，才能生成乳酸。保加利亚乳杆菌中的β-半乳糖苷酶活性较高。大部分乳糖直接经过β-半乳糖苷酶降解为葡萄糖和半乳糖。然后，葡萄糖经过EMP途径降解为乳酸。 二 实验准备
人员安排：全班一起实验，前三张桌子，分三个大组（附上名单）每组摆放的物品（主要的准备工作） 1、市售酸奶 1，3组共3瓶。 2、试管架，1，共3
3、2ml无菌移液管1，共3
4、50ml梯度稀释三角瓶（内装18ml无菌水，其中1个含玻璃珠），10（9+1），共30个
5、吸耳球，1，共3 6、接种环，1，共3
7、BCP试管培养基（15mm×150mm试管），pH值为7. 0和5. 5的培养基各18，共54+54，再次转接时还需要54+54，总共108支 8、记号笔，1，共3
9、MRS液体培养基：50ml三角瓶中装10ml，pH值为7. 0和5. 5的培养基各18，共54+54，共108瓶 10、酒精灯，6，共18 11、精密pH试纸
12、BCP平板培养基，54皿。
13、种子培养基：6瓶，250ml三角瓶装液150ml（选优良种子作），共18瓶
14、电炉，1，共3 15、铝锅，1，共3
16、100ml量筒，1，共3；500ml量筒，1，共3
17、1000ml搪瓷缸，4，共12（发酵完毕保证每人分装200ml，后熟） 18、250ml纸杯（装200ml），18，共54
19、脱脂奶粉1.5kg，固形物12%，每人200ml，约需1.4kg。 20 白砂糖 5%配量，每人200ml×5%=10g, 54人，540克，买1 kg。
三 实验方法 (一) 乳酸菌的分离 1 材料与方法
1.1 样品来源 市售酸奶。 1.2 实验药品 1.3 实验仪器
培养箱，灭菌锅，试管架，无菌水，pH试纸，接种环，酒精灯，三角瓶，玻璃珠，不干胶标签，15mm×150mm试管，棉花，橡皮塞（单独灭菌后代替棉塞），
1.4 培养基
1.4.1 分离用培养基: 改良的BCP 培养基(牛肉膏0.3% ,蛋白胨0.5% ,葡萄糖0.3% , 碳酸钙1%(单独消毒后加入),琼脂2%, 调pH7.0和5.5, 121℃灭菌15 分钟, 备用。
1.4.2 液体富集培养基:MRS 培养基(蛋白胨 10g, 牛肉膏10g,酵母膏 5g, K2HPO4 2g,柠檬酸二铵2g，乙酸钠 2g, 葡萄糖20g,吐温80 1mL,7水硫酸镁 0.58g，7水硫酸锰 0.25g), 用于纯菌株增殖培养。调pH值至7. 0 和5. 5, 分别培养乳酸球菌和乳酸杆菌。
1.4.3 菌种保存培养基：改良的BCP 培养基。
1. 4.4 种子培养基：牛肉膏5g/L，蛋白胨10g/L，酵母膏5g/L，番茄汁100g/L，pH 6.5，120℃灭菌15 min。 1. 5 操作方法
菌种分离：将酸乳梯度稀释至10-10,（或稍粘点直接划线） 摇动待分离菌种的稀释液，以接种环沾取一环菌液，划线法分别接种于pH值为7.0和5.5的改良
BCP试管培养基中，试管用灭菌的橡皮塞代替棉塞封口。接好种后，置培养箱中, 37℃培养72h。
富集培养：将初次分离的菌种1环接种入MRS中(pH值分别为7. 0和5. 5)，摇瓶过夜。次日再回接入改良的BCP试管培养基中(球菌、杆菌各1支)。
形态特征观察：对分离到的菌显微观察，杆菌呈杆状, 单在、双在或呈链状; 球菌呈球形或卵圆形, 多成双, 也呈长链。
发酵性能初试：取1环分离得到的乳酸杆菌和球菌, 点种入改良的BCP平板上（共4个点，球菌、杆菌，各两点，以记号笔标号记录），以透明圈直径与菌落直径之比，表示菌株产生乳酸的能力。
(二) 酸奶的发酵
1 种子的制备:
将获得的2株菌各1环，接种入150ml的种子培养基（250ml三角瓶），37℃培养过夜。
2 生产工艺流程:
原料配方→均质→热处理→冷却→接种→发酵→冷藏→包装→贮藏→成品 3 操作流程: (1)原料配方
市售鲜奶(比重1.028)100%或相当于此质量的纯奶粉稀释液（固体含量在12%左右），蔗糖5%（相当于鲜奶量）
注：配料的多少，按生产量计。如每生产200ml，则20人的配料体积为4000ml。
(2)均质：160kg/cm2,50-70℃
(3)热处理：95℃，5min (4)冷却至45℃ (5)接种 3% (1:1) (6)发酵
主发酵：温度42℃，接种后，1h分装完毕。2.5h-4h,pH即可降到4.5-4.3，产生凝乳，可停止发酵。
后发酵：主发酵结束后，要装入小容器内转移至冷室中放置过夜，进行后熟，这就是后发酵。 后熟过程中冷却的速度相当重要，冷却过快，会引起乳清分离；冷却太慢，会使酸度继续升高而超标，一般认为在1h左右温度降至10-15℃为好。冷却放置过夜后（可于冰箱中冷藏）就可以作为产品上市。
(7)品评 5℃品评，以表的形式反映。
品评指标：凝乳组织状态；洁白程度；细腻程度；有无沙感；爽口性，香气；甜度；酸度。 四 结果与分析 实验结果：
不同奶粉所制酸奶感官品质、脱水收缩度
奶粉试样 酸奶感官性状 脱水收缩度(ml/100ml料样) A 凝块凝固均匀,有光泽,乳香味浓厚,无乳清析出 59 B 凝块凝固良好,有光泽,乳香味一般,少量乳清析出 61 C 凝块浓稠状,不坚实,乳香味浓厚,无乳清析出 54 D 凝块凝结状态一般,微有芳香味,乳清析出较多 66 E 凝块稠密坚实均匀,无光泽,微香,无乳清析出 41
脱水收缩度: 室温下用定量滤纸过滤100ml 散碎的酸奶凝块3h分离出的乳清量(ml)。
实验讨论及分析：
1接种菌含量少，凝固时间长----增加接种量。
2 以牛肉膏等原料种子繁殖后，从颜色气味看有点糟糕，是否用牛奶或奶粉加糖繁殖，学生才会喝。
3 没有充分比较两种菌所产酸奶的质量---单独发酵、混合发酵比较试验，试验室提前准备两株菌扩大，学生分离的不纯。
4 是否可以对一些指标进行检测，比如酸度、氨基酸、多肽等
5 由于本实验是分组实验，在实验过程中应尽量做到让每个人都参与到实验中，实验全程都应该尽量严谨认真，特别是在菌种分离及培养上，切勿染上其它细菌。
参考文献
[1]马辉文，张甲耀.微生物工程（第二版）[M].曹军卫主编.食品和饮料发酵.北京：科学出版社，2007.367~400
[2]王杰;余碧玉.酸奶中主要挥发性风味成分的分析.食品科学.[M].1989.51-53