升麻炮制前后有效成分的比较研究
周保琪 2009级中药传承班
河南中医学院 河南郑州 450008
[摘要] 目的:建立测定升麻中有效成分阿魏酸和异阿魏酸含量的方法, 并比较炮制前后阿魏酸、异阿魏酸和272脱氧升麻亭的含量差异。方法:阿魏酸和异阿魏酸测定方法:色谱柱为YMC 2Pack ODS2C18柱(4. 6 mm ×150 mm, 5μm) ,乙腈2水2乙酸(15 ∶85 ∶0. 25)为流动相, 流速0. 6 mL /min,柱温26 °C, 紫外检测波长320 nm; 272脱氧升麻亭测定方法:色谱柱为YMC 2Pack ODS2C18柱(4. 6 mm ×150 mm, 5μm) ,乙腈2水2乙酸(40 ∶60 ∶1) 为流动相, 流速0. 6 mL /min,柱温26 °C, 示差检测器。结果:测定阿魏酸线性范围( r ) ,加样回收率为(RSD ) ;异阿魏酸线性范围( r ) , 加样回收率为 (RSD ) 。结论该方法简便、快捷、准确, 重复性好, 适合于升麻药材和饮片的质量控制。
[关键词] 升麻; 阿魏酸; 异阿魏酸; 272脱氧升麻亭; 炮制
升麻为常用中药, 具有发表透疹、清热解毒、升举阳气等功能, 2010年版《中国药典》收载其原植物有大三叶升麻Cim icifuga heracleifolia Kom. 、兴安升麻C. dahuricaMaxim. 和升麻C. foetida L. 3种。升麻根茎主要含三萜皂苷、有机酸和色原酮类化合物。一般认为升麻有机酸是其有效成分, 并以所含的阿魏酸、异阿魏酸为指标控制质量[ 1～4 ] 。近年来研究发现升麻所含的环菠萝蜜烷型三萜皂苷具有抗肿瘤、抑制核苷运转、调节内分泌等多种生理活性, 也是其活性成分之一。升麻的临床应用以生片和蜜制片为主, 有关升麻炮制研究非常少, 本实验将以RP 2HPLC 法对升麻炮制前后有效成分阿魏酸、异阿魏酸和三萜皂苷272脱氧升麻亭(272deoxyactein) 的含量进行测定, 并探讨升麻炮制前后有效成分变化规律。
1 升麻炮制前后阿魏酸和异阿魏酸的含量测定
1. 1 仪器与试药
日本Jasco 系列HPLC 色谱仪: Jasco pump21580, Jasco UV21575
检测器, Jasco 工作站; 湘仪天平厂生产TG332A 微量分析天平, 昆山市超声仪器有限公司生产KQ 2250B 型超声波振动仪。乙腈色谱纯( Fisher 公司出品) , 重蒸馏水自制, 阿魏酸对照品由中国药品生物制品检定所提供(批号077329910) , 异阿魏酸和272脱氧升麻亭为本课题组分离和结构鉴定, 经HPLC 法检测含量达98 。
1. 2 实验方法
1. 2. 1 色谱条件
色谱柱为YMC 2Pack ODS 2C18柱(4. 6 mm ×150mm, 5μm) ; 乙腈2水2乙酸(15 ∶85 ∶0. 25)为流动相, 流速0. 6 mL /min,柱温26 °C, 紫外检测波长320nm, 进样量20μL, 外标法定量。理论塔板数按阿酸峰计算, 应不低于4 000。
1. 2. 2 溶液制备
对照品溶液制备 准确称取干燥至恒重的对照品阿魏酸2. 12 mg置2 mL 量瓶中, 用80 甲醇溶解并稀释至刻度, 摇匀即得1. 06 mg/mL 阿魏酸贮备溶液; 另再准确称取干燥至恒重的对照品异阿魏酸2. 08 mg 置2 mL 量瓶中, 用80 甲醇溶解并稀释至刻度, 摇匀即得1. 04 mg/mL 异阿魏酸贮备溶液。供试品溶液的制备 精密称取干燥的升麻样品粉末0. 5 g, 置三角瓶中, 加入50 mL 甲醇, 摇匀, 于80 °C 水浴上回流提取40min, 过滤, 滤渣用20 mL 甲醇洗涤3次, 合并滤液, 回收甲醇, 提取物用80甲醇定容至2 mL量瓶, 摇匀, 即得。
1. 2. 3 测定法
精密吸取阿魏酸和异阿魏酸贮备液80 μL 和160μL 置2 mL量瓶, 用80 甲醇定容至刻度, 即为阿魏酸和异阿魏酸稀释溶液。用微量进样器精密吸取供试品溶液和对照品稀释溶液各20 μL 注入HPLC 仪, 外标法定量，得到对照品、样品HPLC 色谱图, 测定结果见表1。
表1 升麻炮制前后有效成分含量测定
药名 产地 类别 阿魏酸含量 异阿魏酸含量 27脱氧升麻亭含量 （㎎／g ） (㎎／g ） (㎎／g ） 升 甘肃 生药
切片
蜜制片
麻
四川开源 生药
切片
蜜制片
兴安升麻炮制前后有效成分含量测定
药名 产地 类别 阿魏酸含量 异阿魏酸含量 27脱氧升麻亭含量 （㎎／g ） (㎎／g ） (㎎／g ） 兴 内蒙 生药
安 切片
升 蜜制片
麻 牡丹江 生药
切片
蜜制片
河北承德 生药
切片
蜜制片
1. 3 方法学考察
1. 3. 1 稳定性试验
取同一供试品溶液按上述色谱条件分别于0,1, 2, 4, 6, 10 h进样测定, 预测结果表明含量在10 h内基本不变。
1. 3. 2 线性关系考察
分别精密吸取阿魏酸贮备溶液20, 40, 80, 120,160μL 置1 mL量瓶, 加80 甲醇稀释至刻度, 按上述色谱条件进行HPLC 分析。以峰面积对进样量进行回归处理, 得阿魏酸线性回归方程 , r , 线性范围; 另精密吸取异阿魏酸贮备液20, 40, 60,80, 100μL 置1 mL 量瓶, 加80 甲醇稀释至刻度, 按上述色谱条件进行HPLC 分析。以峰面积对进样量进行回归处理, 得异阿魏酸线性回归方程 , r , 线性范围。
1. 3. 3 重复性试验
取同一批药材5份, 按供试液制备并测定。计算结果阿魏酸和异阿魏酸的RSD 。
1. 3. 4 精密度试验
取阿魏酸和异阿魏酸贮备液各40μL 置1 mL 量瓶, 加80 甲醇稀释至刻度, 按上述色谱条件进行HPLC 分析, 连续测定5次, 每次进样20μL, 计算阿魏酸峰面积的RSD , 异阿魏酸RSD 。
1. 3. 5 回收率试验
精密称取已知含量生药样品(四川开源产) 约0. 25 g 共5份, 分别加入阿魏酸(1. 02 mg/mL)和异阿魏酸( 1. 05 mg/mL)对照品溶液40, 80 μL, 待溶剂挥干后, 按供试液制备并测定。取5次测定的平均值计算回收率( n = 5) ,计算结果阿魏酸和异阿魏酸加样回收率(RSD ) 。 2 升麻炮制前后272脱氧升麻亭的含量测定
2. 1 仪器与试药
日本Jasco 系列HPLC 色谱仪: Jasco pump21580, Jasco Ri21575示差检测器, Jasco 工作站; 湘仪天平厂生产TG332A 微量分析天平, 昆山市超声仪器有限公司生产KQ 2250B 型超声波振动仪。乙腈色谱纯( Fisher 公司出品) , 水为重蒸馏水, 对照品272脱氧升麻亭由作者分离, 经红外、质谱和核磁共振鉴定结构, HPLC 法进行纯度检查, 面积归一法大于98 。升麻样品由作者采集并鉴定学名。
2. 2 方法
2. 2. 1 色谱条件
色谱柱为YMC 2Pack ODS 2C18柱(4. 6 mm ×150mm, 5μm) ; 乙腈2水2乙酸(40 ∶60 ∶1) 为流动相, 流速0. 6 mL /min,柱温26 °C, 示差检测器, 进样量20μL, 外标法定量。理论塔板数按272脱氧升麻峰亭计算, 应不低于3 500。
2. 2. 2 试液的制备
供试液制备 精密称取样品粉末2 g, 置磨口圆底瓶中, 加入甲醇80 mL 于水浴中加热回流, 提取60 min, 滤出提取液, 残渣同法再提取1次, 将滤液合并, 回收溶剂。将此提取物以甲醇(色谱纯) 溶解, 并定容至5 mL 量瓶, 摇匀, 即得。过0. 45 μm 的微孔滤膜, 作供试品溶液。对照品溶液制备精密称取干燥至恒重对照品2. 07 mg 置2 mL 量瓶, 加甲醇溶解并定容至刻度, 摇匀即得1. 035 mg/mL对照品溶液。
2. 2. 3 样品测定
精密吸取对照品溶液10, 20μL 和供试品溶液20μL, 分别注入HPLC 仪, 外标法定量对，得到照品、样品HPLC 色谱图。测定结果见表1。
3 讨论
3. 1 检测波长和检测器的确定
对阿魏酸和异阿魏酸甲醇溶液在200～400 nm 范围内进行紫外光谱扫描, 阿魏酸和异阿魏酸的最大吸收波长分别为313和320 nm, 故选择320 nm作检测波长。由于272deoxyactein 无紫外吸收, 只能用示差或蒸发光散射检测器进行测定, 本研究选择示差检测器。
3. 2 供试液制备方法的确定
测定阿魏酸和异阿魏酸的含量时, 考察了不同提取溶剂(甲醇、50 甲醇和水) 、不同提取方法(超声波提取和加热回流提取) 及不同提取次数, 预测结果表明, 以甲醇作溶剂, 加热回流提取阿魏酸和异阿魏酸的含量较高。
3. 3 升麻炮制后阿魏酸和异阿魏酸变化的探讨
预测结果：
升麻切制和蜜制以后, 阿魏酸和异阿魏酸含量均有所增高, 且蜜制片比切片含量增加更多。从HPLC 色谱图上, 可看出升麻炮制前后色谱图差异较大, 有些色谱峰面积增大, 而有些色谱峰面积减小。我们在作
升麻化学成分研究时, 发现升麻酚酸类化合物多以酸酯的形式存在, 可能在炮制过程中, 其酸酯类成分水解生成有机酸和醇类, 使阿魏酸和异阿魏酸含量增加。
3. 4 升麻炮制后272脱氧升麻亭变化的探讨
预测结果：升麻炮制前后272deoxyactein 的含量略有降低, 可能是炮制后, 样品中含有一定量的蜂蜜, 使272de 2oxyactein 的含量相对降低, 但炮制前后的色谱指纹图无变化, 说明升麻炮制对其三萜类成分影响不大。
预测结论：该方法简便、快捷、准确, 重复性好, 适合于升麻药材和饮片的质量控制
[参考文献]
[ 1 ] 中国药典2010年版一部[ S]. 2010: 50.
[ 2 ] 潘瑞乐, 陈迪华, 沈连钢, 等. 高效液相色谱法测定升麻中阿魏酸和异阿魏酸的含量[ J ]. 药物分析杂志, 2000, 20 ( 6) : 3962398.
[ 3 ] 张 涛. HPLC 测定升麻中阿魏酸的含量[ J ]. 中国药品标准,2002, 3 (4) : 41242.
[ 4 ] 刘 颖, 张小茜. 升麻质量标准的研究[ J ]. 中草药, 2005, 36(9) : 140221404.13372007,9(29)第9期。
升麻炮制前后有效成分的比较研究
周保琪 2009级中药传承班
河南中医学院 河南郑州 450008
[摘要] 目的:建立测定升麻中有效成分阿魏酸和异阿魏酸含量的方法, 并比较炮制前后阿魏酸、异阿魏酸和272脱氧升麻亭的含量差异。方法:阿魏酸和异阿魏酸测定方法:色谱柱为YMC 2Pack ODS2C18柱(4. 6 mm ×150 mm, 5μm) ,乙腈2水2乙酸(15 ∶85 ∶0. 25)为流动相, 流速0. 6 mL /min,柱温26 °C, 紫外检测波长320 nm; 272脱氧升麻亭测定方法:色谱柱为YMC 2Pack ODS2C18柱(4. 6 mm ×150 mm, 5μm) ,乙腈2水2乙酸(40 ∶60 ∶1) 为流动相, 流速0. 6 mL /min,柱温26 °C, 示差检测器。结果:测定阿魏酸线性范围( r ) ,加样回收率为(RSD ) ;异阿魏酸线性范围( r ) , 加样回收率为 (RSD ) 。结论该方法简便、快捷、准确, 重复性好, 适合于升麻药材和饮片的质量控制。
[关键词] 升麻; 阿魏酸; 异阿魏酸; 272脱氧升麻亭; 炮制
升麻为常用中药, 具有发表透疹、清热解毒、升举阳气等功能, 2010年版《中国药典》收载其原植物有大三叶升麻Cim icifuga heracleifolia Kom. 、兴安升麻C. dahuricaMaxim. 和升麻C. foetida L. 3种。升麻根茎主要含三萜皂苷、有机酸和色原酮类化合物。一般认为升麻有机酸是其有效成分, 并以所含的阿魏酸、异阿魏酸为指标控制质量[ 1～4 ] 。近年来研究发现升麻所含的环菠萝蜜烷型三萜皂苷具有抗肿瘤、抑制核苷运转、调节内分泌等多种生理活性, 也是其活性成分之一。升麻的临床应用以生片和蜜制片为主, 有关升麻炮制研究非常少, 本实验将以RP 2HPLC 法对升麻炮制前后有效成分阿魏酸、异阿魏酸和三萜皂苷272脱氧升麻亭(272deoxyactein) 的含量进行测定, 并探讨升麻炮制前后有效成分变化规律。
1 升麻炮制前后阿魏酸和异阿魏酸的含量测定
1. 1 仪器与试药
日本Jasco 系列HPLC 色谱仪: Jasco pump21580, Jasco UV21575
检测器, Jasco 工作站; 湘仪天平厂生产TG332A 微量分析天平, 昆山市超声仪器有限公司生产KQ 2250B 型超声波振动仪。乙腈色谱纯( Fisher 公司出品) , 重蒸馏水自制, 阿魏酸对照品由中国药品生物制品检定所提供(批号077329910) , 异阿魏酸和272脱氧升麻亭为本课题组分离和结构鉴定, 经HPLC 法检测含量达98 。
1. 2 实验方法
1. 2. 1 色谱条件
色谱柱为YMC 2Pack ODS 2C18柱(4. 6 mm ×150mm, 5μm) ; 乙腈2水2乙酸(15 ∶85 ∶0. 25)为流动相, 流速0. 6 mL /min,柱温26 °C, 紫外检测波长320nm, 进样量20μL, 外标法定量。理论塔板数按阿酸峰计算, 应不低于4 000。
1. 2. 2 溶液制备
对照品溶液制备 准确称取干燥至恒重的对照品阿魏酸2. 12 mg置2 mL 量瓶中, 用80 甲醇溶解并稀释至刻度, 摇匀即得1. 06 mg/mL 阿魏酸贮备溶液; 另再准确称取干燥至恒重的对照品异阿魏酸2. 08 mg 置2 mL 量瓶中, 用80 甲醇溶解并稀释至刻度, 摇匀即得1. 04 mg/mL 异阿魏酸贮备溶液。供试品溶液的制备 精密称取干燥的升麻样品粉末0. 5 g, 置三角瓶中, 加入50 mL 甲醇, 摇匀, 于80 °C 水浴上回流提取40min, 过滤, 滤渣用20 mL 甲醇洗涤3次, 合并滤液, 回收甲醇, 提取物用80甲醇定容至2 mL量瓶, 摇匀, 即得。
1. 2. 3 测定法
精密吸取阿魏酸和异阿魏酸贮备液80 μL 和160μL 置2 mL量瓶, 用80 甲醇定容至刻度, 即为阿魏酸和异阿魏酸稀释溶液。用微量进样器精密吸取供试品溶液和对照品稀释溶液各20 μL 注入HPLC 仪, 外标法定量，得到对照品、样品HPLC 色谱图, 测定结果见表1。
表1 升麻炮制前后有效成分含量测定
药名 产地 类别 阿魏酸含量 异阿魏酸含量 27脱氧升麻亭含量 （㎎／g ） (㎎／g ） (㎎／g ） 升 甘肃 生药
切片
蜜制片
麻
四川开源 生药
切片
蜜制片
兴安升麻炮制前后有效成分含量测定
药名 产地 类别 阿魏酸含量 异阿魏酸含量 27脱氧升麻亭含量 （㎎／g ） (㎎／g ） (㎎／g ） 兴 内蒙 生药
安 切片
升 蜜制片
麻 牡丹江 生药
切片
蜜制片
河北承德 生药
切片
蜜制片
1. 3 方法学考察
1. 3. 1 稳定性试验
取同一供试品溶液按上述色谱条件分别于0,1, 2, 4, 6, 10 h进样测定, 预测结果表明含量在10 h内基本不变。
1. 3. 2 线性关系考察
分别精密吸取阿魏酸贮备溶液20, 40, 80, 120,160μL 置1 mL量瓶, 加80 甲醇稀释至刻度, 按上述色谱条件进行HPLC 分析。以峰面积对进样量进行回归处理, 得阿魏酸线性回归方程 , r , 线性范围; 另精密吸取异阿魏酸贮备液20, 40, 60,80, 100μL 置1 mL 量瓶, 加80 甲醇稀释至刻度, 按上述色谱条件进行HPLC 分析。以峰面积对进样量进行回归处理, 得异阿魏酸线性回归方程 , r , 线性范围。
1. 3. 3 重复性试验
取同一批药材5份, 按供试液制备并测定。计算结果阿魏酸和异阿魏酸的RSD 。
1. 3. 4 精密度试验
取阿魏酸和异阿魏酸贮备液各40μL 置1 mL 量瓶, 加80 甲醇稀释至刻度, 按上述色谱条件进行HPLC 分析, 连续测定5次, 每次进样20μL, 计算阿魏酸峰面积的RSD , 异阿魏酸RSD 。
1. 3. 5 回收率试验
精密称取已知含量生药样品(四川开源产) 约0. 25 g 共5份, 分别加入阿魏酸(1. 02 mg/mL)和异阿魏酸( 1. 05 mg/mL)对照品溶液40, 80 μL, 待溶剂挥干后, 按供试液制备并测定。取5次测定的平均值计算回收率( n = 5) ,计算结果阿魏酸和异阿魏酸加样回收率(RSD ) 。 2 升麻炮制前后272脱氧升麻亭的含量测定
2. 1 仪器与试药
日本Jasco 系列HPLC 色谱仪: Jasco pump21580, Jasco Ri21575示差检测器, Jasco 工作站; 湘仪天平厂生产TG332A 微量分析天平, 昆山市超声仪器有限公司生产KQ 2250B 型超声波振动仪。乙腈色谱纯( Fisher 公司出品) , 水为重蒸馏水, 对照品272脱氧升麻亭由作者分离, 经红外、质谱和核磁共振鉴定结构, HPLC 法进行纯度检查, 面积归一法大于98 。升麻样品由作者采集并鉴定学名。
2. 2 方法
2. 2. 1 色谱条件
色谱柱为YMC 2Pack ODS 2C18柱(4. 6 mm ×150mm, 5μm) ; 乙腈2水2乙酸(40 ∶60 ∶1) 为流动相, 流速0. 6 mL /min,柱温26 °C, 示差检测器, 进样量20μL, 外标法定量。理论塔板数按272脱氧升麻峰亭计算, 应不低于3 500。
2. 2. 2 试液的制备
供试液制备 精密称取样品粉末2 g, 置磨口圆底瓶中, 加入甲醇80 mL 于水浴中加热回流, 提取60 min, 滤出提取液, 残渣同法再提取1次, 将滤液合并, 回收溶剂。将此提取物以甲醇(色谱纯) 溶解, 并定容至5 mL 量瓶, 摇匀, 即得。过0. 45 μm 的微孔滤膜, 作供试品溶液。对照品溶液制备精密称取干燥至恒重对照品2. 07 mg 置2 mL 量瓶, 加甲醇溶解并定容至刻度, 摇匀即得1. 035 mg/mL对照品溶液。
2. 2. 3 样品测定
精密吸取对照品溶液10, 20μL 和供试品溶液20μL, 分别注入HPLC 仪, 外标法定量对，得到照品、样品HPLC 色谱图。测定结果见表1。
3 讨论
3. 1 检测波长和检测器的确定
对阿魏酸和异阿魏酸甲醇溶液在200～400 nm 范围内进行紫外光谱扫描, 阿魏酸和异阿魏酸的最大吸收波长分别为313和320 nm, 故选择320 nm作检测波长。由于272deoxyactein 无紫外吸收, 只能用示差或蒸发光散射检测器进行测定, 本研究选择示差检测器。
3. 2 供试液制备方法的确定
测定阿魏酸和异阿魏酸的含量时, 考察了不同提取溶剂(甲醇、50 甲醇和水) 、不同提取方法(超声波提取和加热回流提取) 及不同提取次数, 预测结果表明, 以甲醇作溶剂, 加热回流提取阿魏酸和异阿魏酸的含量较高。
3. 3 升麻炮制后阿魏酸和异阿魏酸变化的探讨
预测结果：
升麻切制和蜜制以后, 阿魏酸和异阿魏酸含量均有所增高, 且蜜制片比切片含量增加更多。从HPLC 色谱图上, 可看出升麻炮制前后色谱图差异较大, 有些色谱峰面积增大, 而有些色谱峰面积减小。我们在作
升麻化学成分研究时, 发现升麻酚酸类化合物多以酸酯的形式存在, 可能在炮制过程中, 其酸酯类成分水解生成有机酸和醇类, 使阿魏酸和异阿魏酸含量增加。
3. 4 升麻炮制后272脱氧升麻亭变化的探讨
预测结果：升麻炮制前后272deoxyactein 的含量略有降低, 可能是炮制后, 样品中含有一定量的蜂蜜, 使272de 2oxyactein 的含量相对降低, 但炮制前后的色谱指纹图无变化, 说明升麻炮制对其三萜类成分影响不大。
预测结论：该方法简便、快捷、准确, 重复性好, 适合于升麻药材和饮片的质量控制
[参考文献]
[ 1 ] 中国药典2010年版一部[ S]. 2010: 50.
[ 2 ] 潘瑞乐, 陈迪华, 沈连钢, 等. 高效液相色谱法测定升麻中阿魏酸和异阿魏酸的含量[ J ]. 药物分析杂志, 2000, 20 ( 6) : 3962398.
[ 3 ] 张 涛. HPLC 测定升麻中阿魏酸的含量[ J ]. 中国药品标准,2002, 3 (4) : 41242.
[ 4 ] 刘 颖, 张小茜. 升麻质量标准的研究[ J ]. 中草药, 2005, 36(9) : 140221404.13372007,9(29)第9期。