摘要
本次实验通过蓝白斑筛选、菌落直接PCR 、提质粒进行PCR 、酶切鉴定的实验方法，采用A mp
抗性筛选，利用含有抗性的培养基从转化后代中筛选出转化子，然后在进行相应的鉴定试验，再从相应的重组子中提取质粒，进行酶切实验，电泳观察酶切片段的大小是否与预期的一致，从而达到实验的基本目的，基本掌握了转基因生物筛选鉴定的基本方法。
关键词
菌落直接PCR 提质粒 酶切 鉴定
引言
在质粒载体上进行克隆时，由于重组质粒转化的大肠杆菌的量少，连接产物没有也不可能在经过
分离纯化而获得纯的重组质粒，连接产物中混有载体自连而成的空载体、载体与目的片段连接而成的目的重组质粒和载体与非目的片段连接而成的非目的重组质粒。同时，宿主的转化效率极低，因此，绝大部分宿主是没有被转化的，所以很有必要对转化产物进行筛选与鉴定。首先，通过抗生素抗性从转化后代中筛选出转化子。然后，通过菌落直接PCR 从转化子中筛选出候选转基因生物。最后，从候选重组子中提取质粒，通过凝胶电泳观察质粒的大小, 再利用限制性内切酶切割 大小符合的质粒. 电泳观察酶切片段的大小是否与预期的一致。
一、 实验目的
通过不同方法组合，筛选获得转基因菌株。
二、 实验原理
通过抗生素抗性筛选，从转化后代中筛选出转化子。因为非转化菌没有质粒而缺乏相应的抗生素
抗性，所以可将转化产物涂布在含有相应抗生素的培养基上筛选，只有含有相应抗性的抗生素抗性基因才能生长繁殖形成菌落。
通过菌落直接PCR 从转化子中筛选出转基因生物，扩增出特殊目的基因片段，判断所得转化子是
否为重组子。但因为PCR 技术的高灵敏性，往往会产生假阳性结果，所以有必要进一步进行鉴定. 。
从候选重组子中提取质粒, 通过凝胶电泳观察质粒的大小, 再利用限制性内切酶切割大小符合的质
粒. 电泳观察酶切片段的大小是否与预期的一致.
三、使用仪器、材料
1、材料
实验九准备好的菌株。
2、设备用具
PCR 仪、恒温摇床、台式高速离心机、恒温水浴锅、琼脂糖凝胶电泳装置、电热恒温培养箱、电
泳仪、超净工作台、微量移液抢、1.5mL 离心管等。
3、主要试剂
PCR ：
10 × PCR buffer 、rTaq 酶
dNTP mixtures：dATP, dTTP, dGTP, dCTP 各2.5mM
引物(2.5μM)
P1 ：TGGTGAGCAAGGGCGAGGAG-3’
(Tm=65.5℃) (Sal I)
P2:GFP-R: 5'-GCGTCTAGATTACTTGTACAGCTCGTCCATG-3’
(Tm=61.5℃) (Xba I)
1.5% 琼脂糖凝胶
配制LB 液体培养基：
称胰蛋白胨0.2g ，酵母提取物0.1g ，NaCl 0.2g 于100ml 的三角瓶中，加入20ml 蒸馏水搅
拌溶解，然后用NaOH 调pH 至7.5，加塞，包扎瓶口。
质粒提取：
溶液I ：50 mM葡萄糖，10 mM EDTA，25 mM Tris-HCl（pH8.0），
用前加溶菌酶4 mg/L
溶液II ： 0.2 mol/L NaOH溶液（内含1% SDS）, 现配现用
溶液III （pH4.8）: 60 mL 5 mol/L醋酸钾，11.5 mL 冰醋酸， 28.5 mL H2O；
饱和酚/氯仿/异戊醇（25:24:1）、酚/氯仿（1:1，V/V）
TE 缓冲液（pH8.0）: 10 mM Tris-HCl，1 mM EDTA，
含RNA 酶（RNaseA ）: 20 µg/ml
醋酸钠（pH5.2）、70%乙醇、无水乙醇
限制性核酸内切酶：
Sa l I和 RcoR I
10×H buffer
苯酚/氯仿/异戊醇、氯仿、醋酸钠（pH5.2）、
无水乙醇、70%乙醇等
四、 实验步骤
（一）转化子的筛选
取连接反应转化原液100uL ，涂布与筛选培养基上，直至液体被完全吸收。
倒置平板于37℃继续培养16个小时，平板所长出的单菌落（为白色的）即为转化子。
（二）菌落直接PCR
①用无菌牙签分别挑取5个白色单菌落, 在编好号码的PCR 反应管中的底部分别涂抹, 然后在PCR
管中配制15μL 反应体系..
10 x PCR buffer 1.5μl
dNTP mixture 1.2μl
前向引物 (P1) 2.4μl
反向引物 (P2) 2.4μl
rTaq 酶 0.15μl
灭菌蒸馏水 7.35μl
所有试剂加完后，轻轻混匀，稍离心后即可，为了防止反应混合液蒸发，可添加10μl 矿物油覆
盖。
②PCR 仪的参数设置
③琼脂糖凝胶电泳检测
反应结束后，取5μl PCR产品，加入1μl 6或10 x loading buffer，混匀后点样，电泳15min 。
（三）重组质粒的大小鉴定
①根据电泳结果，用无菌牙签从平板上挑选PCR 反应阳性菌落, 接种于含Amp 100μg/mL的10mL
LB 液体培养基中,37℃下震荡培养12个小时。
②质粒的提取：
1) 吸取1.4 ml菌液至1.5 ml离心管中。
2) 离心(8 000r/min，1min) ，弃上清液（根据菌液浓度判断是否需要重复1~2次）。
3) 加入150 µL 溶液Ⅰ，用旋涡振荡器充分悬浮菌体。
4) 加入200 µL 溶液Ⅱ，加盖后温和颠倒5~6次，直至呈透明状。此步骤在5分钟内完成。
5) 加入150 µL 预冷的溶液Ⅲ，加盖后反复颠倒混匀，直至出现白色絮状沉淀，冰浴5min 。
6) 离心(14 000r/min，4℃，5min) ，移取上清液于另一干净离心管。
7) 向上清液中加等体积的苯酚/氯仿/异戊醇（25:24:1），振荡混匀抽提，离心(14 000 r/min，4℃，
5min) ，溶液将出现分层。
8) 移取上层水相溶液（约450~500µL ）于另一干净离心管，加等体积氯仿，振荡混匀抽提，离心
(14 000 r/min，4℃，5min) ，溶液将出现分层。
9) 移取上层水相溶液于另一干净离心管，加入1/10体积的醋酸钠（pH5.2）和2倍体积无水乙醇
混匀，冰浴30min 。
10) 离心(14 000r/min，10min ，4℃) ，倒掉上清液。
11) 加0.5 ml 预冷的70% 酒精振荡，洗DNA 沉淀一次，离心5 min，倒掉上清液。
12) 真空抽干或室温自然干燥.
13) 加20~30µL TE缓冲液使DNA 完全溶解，室温放置10min ，降解RNA 杂质，少量用于琼脂糖
凝胶质量检测，剩余质粒-20℃保存备用。
14) 1%琼脂糖凝胶配制：称取1g 琼脂糖粉末，加入100ml 0.5倍TBE 溶液，加热熔化，稍降温
后，加入5µL 溴化乙锭（EB ），混匀，制备凝胶板，冷却后备用。
15) 每位同学各取5µL 质粒DNA 加入1µL 6×loading buffer，混匀，进行点样。
16) 电泳条件：120v ，40 min；电泳完成后，胶块通过凝胶成像系统检测，观察实验结果，并拍照
记录。
（四）重组质粒的酶切鉴定
① DNA 浓度纯度的测定
空白测定：吸取200 µl 蒸馏水至比色杯，进行紫外光空白测定。
DNA 测定：取质粒DNA 1 µl 至一干净的离心管，加入199 µl 蒸馏水稀释混匀，所有溶液加入到
干净的比色杯中，测定260 nm及280 nm的光吸收值；计录DNA 浓度及OD260/OD280比值。
②酶切反应
酶切反应液的配制:
Sal I 1μl
10×H buffer 2μl
RcoR I 1μl
质粒DNA 5μl
ddH2O 到 20μl
酶切反应条件：37℃水浴2～3小时。
③电泳检测
反应结束后，向反应液中加入2μl 10×loading buffer，混匀，用以停止酶切反应，所有22
μl 样品均点在一个点样孔。电泳条件：100V , 20分钟左右。
五、 实验结果
图一 挑取进行PCR 反应的平板菌落
图二 菌落直接PCR 电泳图
图三 摇瓶培养的阳性菌落
图四 提取质粒电泳图和酶切鉴定电泳图
六、 实验结果分析
图一是Amp 抗性筛选培养基，上面长出的菌落是转化子菌落。菌落呈白色、光滑、圆形形状。
每个培养基各挑选5个菌落的菌种做PCR 反应，挑选的菌落都是比较大的、清晰的、周围菌落干扰比较少的，并用油性笔在上面做1~10号标记，方便之后接种辨认。
图二是菌落直接PCR 反应后的电泳图。图中最右边是marker 。可以看出，图中标出的①、②、
③、④、⑤号泳带扩增出特异性条带，而且比较明亮、清晰，大约为750bp 到1000bp 之间，
与EGFP 片段理论值相符，表明这五个菌落的菌PCR 结果为阳性，说明第1、2、4、5、6号菌是所需鉴定的重组子。
图三是取PCR 阳性反应摇瓶培养后的照片。由于1号菌的条带相对比较弱，因此只选取了2、4、
5、6号菌摇瓶培养，图中显示菌种成功培养出来，摇瓶培养成功。
图四是质粒提取和酶切鉴定的电泳图。图中右边数起第一条是DL2000的marker 电泳带，第二条
是DL5000的marker 电泳带。①②③④号泳道是质粒提取的电泳带，⑤⑥⑦⑧是酶切反应的电泳道，两组电泳道依次对应2、4、5、6号菌。
质粒提取的电泳图中，①②③④号电泳带有三条带条带，从下往上数，分别是超螺旋DNA ，线
性DNA 和开环DNA 。，因为共价闭合DNA 是完整的，构型比较紧密，阻力比较小，所以跑的最快，线性DNA 是环状的双链DNA 两条链均断开了，其分子构象变化，不如共价闭合的紧密，所以跑的慢点。开环DNA 是环状双链DNA 有一条链断开，拖着一条尾巴，显得很臃肿，阻力最大，所以跑的最慢。电泳带都大约位于2000bp ，符合理论质粒大小。且条带比较暗，说明质粒的量比较少，而杂质偏多，而检测的OD260/OD280值均在适合的范围内，说明纯度比较高。可能是因为蛋白质残留和实验过程中震荡多于大力损坏了质粒。检测的OD260/OD280值均在适合的范围内，说明纯度比较高。
酶切鉴定反应中，⑥、⑧号电泳带有清晰的三条带，⑤、⑦号泳带只有两条泳带。在酶切反应中，
pET32-CaM5质粒有两个酶切位点，完全酶切应得到两个片段，分别为6131bp 和219bp 。⑥、⑧号泳道中，最上面的电泳带大约在6130bp 处，第二条大约在219bp 处；⑤、⑦号泳道中，电泳带大约在6130bp 处，符合理论值，说明⑥、⑧号泳带的菌种，也就是第4、6号菌是阳性，是pET32—CaM5转化子。⑤、⑦号泳带的菌种，也就是2、5号菌是假阳性。但是电泳图中出现第三条带，说明蛋白质杂质和已降解的DNA. 有点多，操作中有待改进。
七、 结果和讨论
这次综合实验还算是比较成功的，筛选并鉴定出③、⑤号菌是成功的pET32—CaM5转化子大肠
杆菌，得到了一定的实验预期结果。经过一个学期的基因工程实验操作和老师的悉心指导下，我对基因工程的了解更加深入，同时掌握了一定的实验操作能力，具有了某种程度的科学研究方法和思维方法。
八、 参考文献
《生物工程上游技术实验书册》 田长恩 科学出版社 《基因工程技术》 冯斌 谢先芝编著 化学化工出版社 《生物技术综合实验》 刘晓晴编 科学出版社
摘要
本次实验通过蓝白斑筛选、菌落直接PCR 、提质粒进行PCR 、酶切鉴定的实验方法，采用A mp
抗性筛选，利用含有抗性的培养基从转化后代中筛选出转化子，然后在进行相应的鉴定试验，再从相应的重组子中提取质粒，进行酶切实验，电泳观察酶切片段的大小是否与预期的一致，从而达到实验的基本目的，基本掌握了转基因生物筛选鉴定的基本方法。
关键词
菌落直接PCR 提质粒 酶切 鉴定
引言
在质粒载体上进行克隆时，由于重组质粒转化的大肠杆菌的量少，连接产物没有也不可能在经过
分离纯化而获得纯的重组质粒，连接产物中混有载体自连而成的空载体、载体与目的片段连接而成的目的重组质粒和载体与非目的片段连接而成的非目的重组质粒。同时，宿主的转化效率极低，因此，绝大部分宿主是没有被转化的，所以很有必要对转化产物进行筛选与鉴定。首先，通过抗生素抗性从转化后代中筛选出转化子。然后，通过菌落直接PCR 从转化子中筛选出候选转基因生物。最后，从候选重组子中提取质粒，通过凝胶电泳观察质粒的大小, 再利用限制性内切酶切割 大小符合的质粒. 电泳观察酶切片段的大小是否与预期的一致。
一、 实验目的
通过不同方法组合，筛选获得转基因菌株。
二、 实验原理
通过抗生素抗性筛选，从转化后代中筛选出转化子。因为非转化菌没有质粒而缺乏相应的抗生素
抗性，所以可将转化产物涂布在含有相应抗生素的培养基上筛选，只有含有相应抗性的抗生素抗性基因才能生长繁殖形成菌落。
通过菌落直接PCR 从转化子中筛选出转基因生物，扩增出特殊目的基因片段，判断所得转化子是
否为重组子。但因为PCR 技术的高灵敏性，往往会产生假阳性结果，所以有必要进一步进行鉴定. 。
从候选重组子中提取质粒, 通过凝胶电泳观察质粒的大小, 再利用限制性内切酶切割大小符合的质
粒. 电泳观察酶切片段的大小是否与预期的一致.
三、使用仪器、材料
1、材料
实验九准备好的菌株。
2、设备用具
PCR 仪、恒温摇床、台式高速离心机、恒温水浴锅、琼脂糖凝胶电泳装置、电热恒温培养箱、电
泳仪、超净工作台、微量移液抢、1.5mL 离心管等。
3、主要试剂
PCR ：
10 × PCR buffer 、rTaq 酶
dNTP mixtures：dATP, dTTP, dGTP, dCTP 各2.5mM
引物(2.5μM)
P1 ：TGGTGAGCAAGGGCGAGGAG-3’
(Tm=65.5℃) (Sal I)
P2:GFP-R: 5'-GCGTCTAGATTACTTGTACAGCTCGTCCATG-3’
(Tm=61.5℃) (Xba I)
1.5% 琼脂糖凝胶
配制LB 液体培养基：
称胰蛋白胨0.2g ，酵母提取物0.1g ，NaCl 0.2g 于100ml 的三角瓶中，加入20ml 蒸馏水搅
拌溶解，然后用NaOH 调pH 至7.5，加塞，包扎瓶口。
质粒提取：
溶液I ：50 mM葡萄糖，10 mM EDTA，25 mM Tris-HCl（pH8.0），
用前加溶菌酶4 mg/L
溶液II ： 0.2 mol/L NaOH溶液（内含1% SDS）, 现配现用
溶液III （pH4.8）: 60 mL 5 mol/L醋酸钾，11.5 mL 冰醋酸， 28.5 mL H2O；
饱和酚/氯仿/异戊醇（25:24:1）、酚/氯仿（1:1，V/V）
TE 缓冲液（pH8.0）: 10 mM Tris-HCl，1 mM EDTA，
含RNA 酶（RNaseA ）: 20 µg/ml
醋酸钠（pH5.2）、70%乙醇、无水乙醇
限制性核酸内切酶：
Sa l I和 RcoR I
10×H buffer
苯酚/氯仿/异戊醇、氯仿、醋酸钠（pH5.2）、
无水乙醇、70%乙醇等
四、 实验步骤
（一）转化子的筛选
取连接反应转化原液100uL ，涂布与筛选培养基上，直至液体被完全吸收。
倒置平板于37℃继续培养16个小时，平板所长出的单菌落（为白色的）即为转化子。
（二）菌落直接PCR
①用无菌牙签分别挑取5个白色单菌落, 在编好号码的PCR 反应管中的底部分别涂抹, 然后在PCR
管中配制15μL 反应体系..
10 x PCR buffer 1.5μl
dNTP mixture 1.2μl
前向引物 (P1) 2.4μl
反向引物 (P2) 2.4μl
rTaq 酶 0.15μl
灭菌蒸馏水 7.35μl
所有试剂加完后，轻轻混匀，稍离心后即可，为了防止反应混合液蒸发，可添加10μl 矿物油覆
盖。
②PCR 仪的参数设置
③琼脂糖凝胶电泳检测
反应结束后，取5μl PCR产品，加入1μl 6或10 x loading buffer，混匀后点样，电泳15min 。
（三）重组质粒的大小鉴定
①根据电泳结果，用无菌牙签从平板上挑选PCR 反应阳性菌落, 接种于含Amp 100μg/mL的10mL
LB 液体培养基中,37℃下震荡培养12个小时。
②质粒的提取：
1) 吸取1.4 ml菌液至1.5 ml离心管中。
2) 离心(8 000r/min，1min) ，弃上清液（根据菌液浓度判断是否需要重复1~2次）。
3) 加入150 µL 溶液Ⅰ，用旋涡振荡器充分悬浮菌体。
4) 加入200 µL 溶液Ⅱ，加盖后温和颠倒5~6次，直至呈透明状。此步骤在5分钟内完成。
5) 加入150 µL 预冷的溶液Ⅲ，加盖后反复颠倒混匀，直至出现白色絮状沉淀，冰浴5min 。
6) 离心(14 000r/min，4℃，5min) ，移取上清液于另一干净离心管。
7) 向上清液中加等体积的苯酚/氯仿/异戊醇（25:24:1），振荡混匀抽提，离心(14 000 r/min，4℃，
5min) ，溶液将出现分层。
8) 移取上层水相溶液（约450~500µL ）于另一干净离心管，加等体积氯仿，振荡混匀抽提，离心
(14 000 r/min，4℃，5min) ，溶液将出现分层。
9) 移取上层水相溶液于另一干净离心管，加入1/10体积的醋酸钠（pH5.2）和2倍体积无水乙醇
混匀，冰浴30min 。
10) 离心(14 000r/min，10min ，4℃) ，倒掉上清液。
11) 加0.5 ml 预冷的70% 酒精振荡，洗DNA 沉淀一次，离心5 min，倒掉上清液。
12) 真空抽干或室温自然干燥.
13) 加20~30µL TE缓冲液使DNA 完全溶解，室温放置10min ，降解RNA 杂质，少量用于琼脂糖
凝胶质量检测，剩余质粒-20℃保存备用。
14) 1%琼脂糖凝胶配制：称取1g 琼脂糖粉末，加入100ml 0.5倍TBE 溶液，加热熔化，稍降温
后，加入5µL 溴化乙锭（EB ），混匀，制备凝胶板，冷却后备用。
15) 每位同学各取5µL 质粒DNA 加入1µL 6×loading buffer，混匀，进行点样。
16) 电泳条件：120v ，40 min；电泳完成后，胶块通过凝胶成像系统检测，观察实验结果，并拍照
记录。
（四）重组质粒的酶切鉴定
① DNA 浓度纯度的测定
空白测定：吸取200 µl 蒸馏水至比色杯，进行紫外光空白测定。
DNA 测定：取质粒DNA 1 µl 至一干净的离心管，加入199 µl 蒸馏水稀释混匀，所有溶液加入到
干净的比色杯中，测定260 nm及280 nm的光吸收值；计录DNA 浓度及OD260/OD280比值。
②酶切反应
酶切反应液的配制:
Sal I 1μl
10×H buffer 2μl
RcoR I 1μl
质粒DNA 5μl
ddH2O 到 20μl
酶切反应条件：37℃水浴2～3小时。
③电泳检测
反应结束后，向反应液中加入2μl 10×loading buffer，混匀，用以停止酶切反应，所有22
μl 样品均点在一个点样孔。电泳条件：100V , 20分钟左右。
五、 实验结果
图一 挑取进行PCR 反应的平板菌落
图二 菌落直接PCR 电泳图
图三 摇瓶培养的阳性菌落
图四 提取质粒电泳图和酶切鉴定电泳图
六、 实验结果分析
图一是Amp 抗性筛选培养基，上面长出的菌落是转化子菌落。菌落呈白色、光滑、圆形形状。
每个培养基各挑选5个菌落的菌种做PCR 反应，挑选的菌落都是比较大的、清晰的、周围菌落干扰比较少的，并用油性笔在上面做1~10号标记，方便之后接种辨认。
图二是菌落直接PCR 反应后的电泳图。图中最右边是marker 。可以看出，图中标出的①、②、
③、④、⑤号泳带扩增出特异性条带，而且比较明亮、清晰，大约为750bp 到1000bp 之间，
与EGFP 片段理论值相符，表明这五个菌落的菌PCR 结果为阳性，说明第1、2、4、5、6号菌是所需鉴定的重组子。
图三是取PCR 阳性反应摇瓶培养后的照片。由于1号菌的条带相对比较弱，因此只选取了2、4、
5、6号菌摇瓶培养，图中显示菌种成功培养出来，摇瓶培养成功。
图四是质粒提取和酶切鉴定的电泳图。图中右边数起第一条是DL2000的marker 电泳带，第二条
是DL5000的marker 电泳带。①②③④号泳道是质粒提取的电泳带，⑤⑥⑦⑧是酶切反应的电泳道，两组电泳道依次对应2、4、5、6号菌。
质粒提取的电泳图中，①②③④号电泳带有三条带条带，从下往上数，分别是超螺旋DNA ，线
性DNA 和开环DNA 。，因为共价闭合DNA 是完整的，构型比较紧密，阻力比较小，所以跑的最快，线性DNA 是环状的双链DNA 两条链均断开了，其分子构象变化，不如共价闭合的紧密，所以跑的慢点。开环DNA 是环状双链DNA 有一条链断开，拖着一条尾巴，显得很臃肿，阻力最大，所以跑的最慢。电泳带都大约位于2000bp ，符合理论质粒大小。且条带比较暗，说明质粒的量比较少，而杂质偏多，而检测的OD260/OD280值均在适合的范围内，说明纯度比较高。可能是因为蛋白质残留和实验过程中震荡多于大力损坏了质粒。检测的OD260/OD280值均在适合的范围内，说明纯度比较高。
酶切鉴定反应中，⑥、⑧号电泳带有清晰的三条带，⑤、⑦号泳带只有两条泳带。在酶切反应中，
pET32-CaM5质粒有两个酶切位点，完全酶切应得到两个片段，分别为6131bp 和219bp 。⑥、⑧号泳道中，最上面的电泳带大约在6130bp 处，第二条大约在219bp 处；⑤、⑦号泳道中，电泳带大约在6130bp 处，符合理论值，说明⑥、⑧号泳带的菌种，也就是第4、6号菌是阳性，是pET32—CaM5转化子。⑤、⑦号泳带的菌种，也就是2、5号菌是假阳性。但是电泳图中出现第三条带，说明蛋白质杂质和已降解的DNA. 有点多，操作中有待改进。
七、 结果和讨论
这次综合实验还算是比较成功的，筛选并鉴定出③、⑤号菌是成功的pET32—CaM5转化子大肠
杆菌，得到了一定的实验预期结果。经过一个学期的基因工程实验操作和老师的悉心指导下，我对基因工程的了解更加深入，同时掌握了一定的实验操作能力，具有了某种程度的科学研究方法和思维方法。
八、 参考文献
《生物工程上游技术实验书册》 田长恩 科学出版社 《基因工程技术》 冯斌 谢先芝编著 化学化工出版社 《生物技术综合实验》 刘晓晴编 科学出版社