实验一 培养基的配制与灭菌
一、目的
掌握培养基母液的配制方法；培养基的配制和灭菌技术；不同质地实验用品的灭菌方法。
二、方法步骤
1、玻璃器皿清洗
2、母液配制
一般大量元素、微量元素和其它成分分别配制成100－200倍母液，使用时按比例稀释即可。配好的母液需贮存于2～4℃的冰箱中，定期检查有无沉淀和微生物污染，如果出现沉淀或微生物污染，则不能使用。
同学们只要配大量元素母液，按教科书P32页上进行，但不是20倍，配10倍即可。其他母液老师已经配制好，请注意试剂瓶上的浓度，即浓缩的倍数。
3、植物激素母液配制
植物激素一般配制成浓度为0.1—1.0mg/ml的溶液，贮存在2～4℃下备用。由于多数激素难溶于水，所以配制时应按下面步骤进行：
IAA： 先用少量95%乙醇使之充分溶解，再加蒸馏水定容至需要浓度的体积。 NAA：可溶于热水中，也可采用与IAA同样的方法配制。
2,4-D：先用少量1mol/L的NaOH溶液充分溶解，然后缓慢加入蒸馏水定容至需要浓度体积。 细胞分裂素类：KT和BA等细胞分裂素类物质均溶于稀盐酸，应先用少量1mol/L的HCl溶
解后再稀释至需要浓度。
赤霉素： 赤霉素的水溶液稳定性较差，一般用95%的乙醇配制成5～10mg/ml的母液低温保
存，使用时再稀释。
4、培养基配制
按实际配制培养基体积，取各母液的需要量加入一适当体积的烧杯或其它配制培养基的容器中，再加入实际配制培养基体积约2/3—3/4的蒸馏水，然后以每升所用蔗糖的量称取放入培养基并使其溶化：30g，以0.6%—0.8%的比例加入琼脂：9g。搅拌加热使琼脂完全溶化，用0.1mol/L的NaOH或0.1mol/L的HCl调整pH至5.6—5.8，并用蒸馏水定容至终体积：1L。
5、各激素培养基和灭菌
（1）对照组：纯MS培养基：250 ml，分装10瓶。不加激素，分别接种烟草子叶、胡萝
卜块根和菊花花瓣各接3-4瓶，每瓶4-5块组织。
（2）烟草组： MS + 2.0 mg/L 2,4-D + 0.08 mg/L 6-BA。250ml，分装为10瓶。
（3）胡萝卜组：MS + 2.0 mg/L 2,4-D + 0.2 mg/L 6-BA。250ml，分装为10瓶。
（4）菊花组： MS + 3.0 mg/L 6-BA + 0.05 mg/L NAA。250ml，分装为10瓶。
分装时应特别注意不要污染瓶口，用裁成适当大小的二层牛皮纸封口，橡皮筋轧口。用油性记号笔在瓶口的牛皮纸上写上组号及处理组名称。
分装好的培养基置于高压蒸汽灭菌锅中灭菌，灭菌条件为温度121℃，压力0.105MPa，灭菌时间与培养基容量的关系如下表所示。注意要把锅内的空气放掉。
培养基体积与灭菌时间的关系
6、其他所需灭菌物品：
10套培养皿，10张滤纸，250-500ml无菌水，若干吸水纸，解剖刀柄，剪刀等。 另：实验间隙另配制75%酒精，带到无菌操作室使用。
三、结果与分析
1、培养基的母液配制情况。
2、培养基配制时的注意事项。
四、提交实验报告
实验二 愈伤组织的诱导
一、目的
掌握植物外植体的消毒技术、离体培养的无菌操作和愈伤组织诱导技术。
二、实验材料
1、实验材料：烟草苗叶片，胡萝卜块根，菊花花瓣。
2、诱导培养基：
烟草组： MS + 2.0 mg/L 2,4-D + 0.08 mg/L 6-BA。250ml，分装为10瓶。
胡萝卜组：MS + 2.0 mg/L 2,4-D + 0.2 mg/L 6-BA。250ml，分装为10瓶。
菊花组： MS + 3.0 mg/L 6-BA + 0.05 mg/L NAA。250ml，分装为10瓶。
蔗糖30g/L，琼脂9g/L，pH调整至5.6-5.8。
3、设备及工具：超净工作台；不锈钢镊子、剪刀、解剖刀、酒精灯等；75%酒精。
三、接种操作方法
1、材料预处理：
（1）、胡萝卜块根预处理：洗净胡萝卜块根，切成1 cm 厚的圆片，带入无菌室；
（2）、切取烟草完整细嫩叶片20片，带入无菌室；
（3）、切取整个菊花花蕾，先用流水处理30分钟，吸干后带入无菌室。 其他75%乙醇（含棉花球）的广口瓶、0.1 % HgCl2 也一并带入无菌室。
2、用75%乙醇将净化工作台擦洗干净，将接种所用的材料、工具、培养基等准备好放入工作台。打开紫外灯和风机至少20分钟后开始操作。
2、用自来水将手洗净，然后用75%酒精将手消毒，才可进入超净工作台开始接种操作。
3、关闭紫外灯，点燃酒精灯，将镊子、解剖刀在酒精灯下灼烧干。
4、取一无菌培养皿：
（1）、先将烟草完整叶片（保留叶柄，切除胚轴），于0.1 % HgCl2 消毒 6 分钟，无菌水冲洗3次；然后将叶片切成2×3或3×4者左右的小块，保留叶柄和主脉，接入相应的培养基中（烟草组培养基），每瓶接5-6块，接10瓶，快速封好瓶口，并用油性记号笔写上接种日期。
（2）、取细嫩菊花花瓣，用0.1 % HgCl2 消毒 6 分钟，无菌水冲洗3次；将花蕾切成3 cm左右的长度的切段，接入相应的培养基中（菊花组培养基），每瓶接5-6条，接10瓶，快速封好瓶口，并用油性记号笔写上接种日期。
（3）、将胡萝卜圆片的形成层部分切成2×3或3×4者左右的小块，先用75%乙醇消毒2-3 S，无菌水冲洗3次，再用0.1 % HgCl2 消毒 8 分钟，无菌水冲洗3次；接入相应的培养基中（胡萝卜组培养基），每瓶接5-6块，接10瓶，快速封好瓶口，并用油性记号笔写上接种日期。
5、材料太多的情况下，可以先消毒、接种一部分，待取出一部分后再消毒接种另一部分。
6、接种后的三角瓶用保鲜膜再次封口，置于培养室（靠窗部分）25℃条件下，黑暗或光照培养2-3周，直至愈伤组织形成。
四、结果与分析
1、统计愈伤组织形成的数目
2、对结果进行分析原因。
五、提交实验报告
实验一 培养基的配制与灭菌
一、目的
掌握培养基母液的配制方法；培养基的配制和灭菌技术；不同质地实验用品的灭菌方法。
二、方法步骤
1、玻璃器皿清洗
2、母液配制
一般大量元素、微量元素和其它成分分别配制成100－200倍母液，使用时按比例稀释即可。配好的母液需贮存于2～4℃的冰箱中，定期检查有无沉淀和微生物污染，如果出现沉淀或微生物污染，则不能使用。
同学们只要配大量元素母液，按教科书P32页上进行，但不是20倍，配10倍即可。其他母液老师已经配制好，请注意试剂瓶上的浓度，即浓缩的倍数。
3、植物激素母液配制
植物激素一般配制成浓度为0.1—1.0mg/ml的溶液，贮存在2～4℃下备用。由于多数激素难溶于水，所以配制时应按下面步骤进行：
IAA： 先用少量95%乙醇使之充分溶解，再加蒸馏水定容至需要浓度的体积。 NAA：可溶于热水中，也可采用与IAA同样的方法配制。
2,4-D：先用少量1mol/L的NaOH溶液充分溶解，然后缓慢加入蒸馏水定容至需要浓度体积。 细胞分裂素类：KT和BA等细胞分裂素类物质均溶于稀盐酸，应先用少量1mol/L的HCl溶
解后再稀释至需要浓度。
赤霉素： 赤霉素的水溶液稳定性较差，一般用95%的乙醇配制成5～10mg/ml的母液低温保
存，使用时再稀释。
4、培养基配制
按实际配制培养基体积，取各母液的需要量加入一适当体积的烧杯或其它配制培养基的容器中，再加入实际配制培养基体积约2/3—3/4的蒸馏水，然后以每升所用蔗糖的量称取放入培养基并使其溶化：30g，以0.6%—0.8%的比例加入琼脂：9g。搅拌加热使琼脂完全溶化，用0.1mol/L的NaOH或0.1mol/L的HCl调整pH至5.6—5.8，并用蒸馏水定容至终体积：1L。
5、各激素培养基和灭菌
（1）对照组：纯MS培养基：250 ml，分装10瓶。不加激素，分别接种烟草子叶、胡萝
卜块根和菊花花瓣各接3-4瓶，每瓶4-5块组织。
（2）烟草组： MS + 2.0 mg/L 2,4-D + 0.08 mg/L 6-BA。250ml，分装为10瓶。
（3）胡萝卜组：MS + 2.0 mg/L 2,4-D + 0.2 mg/L 6-BA。250ml，分装为10瓶。
（4）菊花组： MS + 3.0 mg/L 6-BA + 0.05 mg/L NAA。250ml，分装为10瓶。
分装时应特别注意不要污染瓶口，用裁成适当大小的二层牛皮纸封口，橡皮筋轧口。用油性记号笔在瓶口的牛皮纸上写上组号及处理组名称。
分装好的培养基置于高压蒸汽灭菌锅中灭菌，灭菌条件为温度121℃，压力0.105MPa，灭菌时间与培养基容量的关系如下表所示。注意要把锅内的空气放掉。
培养基体积与灭菌时间的关系
6、其他所需灭菌物品：
10套培养皿，10张滤纸，250-500ml无菌水，若干吸水纸，解剖刀柄，剪刀等。 另：实验间隙另配制75%酒精，带到无菌操作室使用。
三、结果与分析
1、培养基的母液配制情况。
2、培养基配制时的注意事项。
四、提交实验报告
实验二 愈伤组织的诱导
一、目的
掌握植物外植体的消毒技术、离体培养的无菌操作和愈伤组织诱导技术。
二、实验材料
1、实验材料：烟草苗叶片，胡萝卜块根，菊花花瓣。
2、诱导培养基：
烟草组： MS + 2.0 mg/L 2,4-D + 0.08 mg/L 6-BA。250ml，分装为10瓶。
胡萝卜组：MS + 2.0 mg/L 2,4-D + 0.2 mg/L 6-BA。250ml，分装为10瓶。
菊花组： MS + 3.0 mg/L 6-BA + 0.05 mg/L NAA。250ml，分装为10瓶。
蔗糖30g/L，琼脂9g/L，pH调整至5.6-5.8。
3、设备及工具：超净工作台；不锈钢镊子、剪刀、解剖刀、酒精灯等；75%酒精。
三、接种操作方法
1、材料预处理：
（1）、胡萝卜块根预处理：洗净胡萝卜块根，切成1 cm 厚的圆片，带入无菌室；
（2）、切取烟草完整细嫩叶片20片，带入无菌室；
（3）、切取整个菊花花蕾，先用流水处理30分钟，吸干后带入无菌室。 其他75%乙醇（含棉花球）的广口瓶、0.1 % HgCl2 也一并带入无菌室。
2、用75%乙醇将净化工作台擦洗干净，将接种所用的材料、工具、培养基等准备好放入工作台。打开紫外灯和风机至少20分钟后开始操作。
2、用自来水将手洗净，然后用75%酒精将手消毒，才可进入超净工作台开始接种操作。
3、关闭紫外灯，点燃酒精灯，将镊子、解剖刀在酒精灯下灼烧干。
4、取一无菌培养皿：
（1）、先将烟草完整叶片（保留叶柄，切除胚轴），于0.1 % HgCl2 消毒 6 分钟，无菌水冲洗3次；然后将叶片切成2×3或3×4者左右的小块，保留叶柄和主脉，接入相应的培养基中（烟草组培养基），每瓶接5-6块，接10瓶，快速封好瓶口，并用油性记号笔写上接种日期。
（2）、取细嫩菊花花瓣，用0.1 % HgCl2 消毒 6 分钟，无菌水冲洗3次；将花蕾切成3 cm左右的长度的切段，接入相应的培养基中（菊花组培养基），每瓶接5-6条，接10瓶，快速封好瓶口，并用油性记号笔写上接种日期。
（3）、将胡萝卜圆片的形成层部分切成2×3或3×4者左右的小块，先用75%乙醇消毒2-3 S，无菌水冲洗3次，再用0.1 % HgCl2 消毒 8 分钟，无菌水冲洗3次；接入相应的培养基中（胡萝卜组培养基），每瓶接5-6块，接10瓶，快速封好瓶口，并用油性记号笔写上接种日期。
5、材料太多的情况下，可以先消毒、接种一部分，待取出一部分后再消毒接种另一部分。
6、接种后的三角瓶用保鲜膜再次封口，置于培养室（靠窗部分）25℃条件下，黑暗或光照培养2-3周，直至愈伤组织形成。
四、结果与分析
1、统计愈伤组织形成的数目
2、对结果进行分析原因。
五、提交实验报告