22中国生化药物杂志Chinese Journal of Biochemical Pharmaceutics 2010年第31卷第1期
性分析实验表明,Citrostatin 同时具有杀伤肿瘤细胞的功能, 证明了Citrostatin 同时具有抑制肿瘤新生血管的形成和直接杀伤肿瘤的双重活性。但与等摩尔浓度的T 8、citropin1. 18比较, 在细胞和血管水平, 抑制效果无明显差异, 与化学合成的Citrostatin 相比, 抗肿瘤活性也无明显差别
[5]
或者通过酰胺化增加Citrostatin 的活性, 达到更好的
抑制肿瘤生长的目的, 这有待下一步的研究证实。参考文献:
[1] O ′Reilly M S ,Boehm T ,Shing Y,et al. Endostatin :anendogenous in 2
hibitor of angiogenesis and tum or growth [J].Cell ,1997,88:2772285. [2] D oyle J ,Brinkw orth C S ,W egener KL ,et al. nNOS inhibition ,antim i 2
crobial and anticancer activity of the am phibian skin peptide ,citropin1. 1and synthetic m odification [J ].Eur J Biochem , 2003, 270:114121153.
[3] W egener KL ,W abnitz P A ,Carver J A ,et al. H ost defence peptides
from the skin glands of the Australian blue m ountains tree 2frog Litoria
citropa . S olution structure of the antibacterial peptide citripin 1. 1[J].
。
Citrostatin 具有位于C 端的citropin1. 18序列, 其
带正电荷的极性氨基酸可与肿瘤细胞膜表层带负电荷的磷脂产生静电引力作用, 使Citrostatin 聚集于肿瘤细胞附近, 而新生肿瘤组织的血管丰富, 内皮细胞数量较多,Citrostatin 的浓度增加可增强对内皮细胞的抑制作用。尽管细胞和血管水平只反映了Citro 2statin 具有双功能的抗肿瘤活性, 但真正有意义的工
Eur J Biochem ,1999,265:6272637.
[4] M aeshima Y,Sudhakar A ,Lively J C ,et al. Tumstatin ,an endothelial
cell 2S pecific inhibitor of protein synthesis[J].Science ,2002,295:1402143.
[5] 马丽, , 杨志峰, 等. [J].第
作须在活体水平证明Citrostatin 与单独使用cit 2ropin1. 18、T 8相比, 具有明显抑制肿瘤生长的优势,
) 人绒促性素单克隆抗体的制备与分离纯化
沈 泓1, 易 喻1, 梅建凤1, 朱克寅2, 李 敏1, 应国清1
(1. 浙江工业大学药学院, 浙江杭州310014; 2. 杭州博林生物技术有限公司, 浙江杭州310018)
摘 要:目的制备人绒促性素(hCG ) 单克隆抗体。方法hCG 抗原免疫BA LB/c 小鼠, 取其脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0按5∶1融合, 间接E LIS A 法筛选阳性孔, 有限稀释法进行克隆化培养; 制备腹水抗体; 间接E LIS A 法测定抗体效价; 采用HiT rap rProtein A FF 亲和色谱柱纯化抗体。结果得到2株能稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株, 细胞培养上清中抗体效价达10-3以上, 腹水抗体效价达10-7以上, 纯化后的单抗纯度达98%以上, 回收率达
75%。结论成功获得两株能稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞, 可用于早孕、肿瘤等诊断的研究。
关键词:人绒促性素; 单克隆抗体; 杂交瘤细胞
中图分类号:Q57; Q813 文献标识码:A 文章编号:100521678(2010) 0120022204
Preparation and puri fication of monoclonal antibodies against human
chorionic gonadotrophin
SHE N H ong 1, YI Y u 1, MEI Jian 2feng 1, ZH U K e 2yin 2, LI Min 1, YI NG G uo 2qing 1
(1. School o f Pharmaceutical Science , Zhejiang Univer sity o f Technology , Hangzhou 310014, China ;
2. BIO LIN K Biopharm , Co. , Ltd. , Hangzhou 310018, China )
收稿日期:2009209208
基金项目:浙江省科技厅项目(2009c33089)
作者简介:沈泓(19832) , 女, 浙江杭州人, 硕士研究生, 研究方向为单克隆抗体的制备、分离纯化和应用研究; 应国清, 通信作者,bio 2
ph @zjut. edu. cn 。
中国生化药物杂志Chinese Journal of Biochemical Pharmaceutics 2010年第31卷第1期23
Abstract :PurposeT o prepare m onoclonal antibody against hCG. Methods Balb/c mice were immunized with hCG,and spleen cells from the mice were fused with myeloma cells SP2/0at ratio of 5∶1. P ositive clones were screened by indirect enzyme 2linked 2immunoads orbent assay (E LIS A ) ,then the clones were subcloned by limiting dilution and am plified further. A fter intraperitoneal injection of hybridoma cells ,m ouse ascites antibody was prepared. T itres and specificity of the ascites antibody were identified and determined by indirect E LIS A. The ascites were purified by protein A affinity chromatography. R esults T w o strains of hybridoma cell lines ob 2tained could secrete MAb stably. The titre of MAb of cell culture supernate is m ore than 10-3,and the titre of prepared ascites MAb is m ore than 10-7. The purity of the obtained m onoclonal antibody was m ore than 98%and recovery reached 75%after purification. Conclusion The obtained tw o strains of hybridoma cell lines can secrete MAb stably. The m onoclonal antibodies can be used in the research of early pregnancy and tum or diag 2nosis.
K ey w ords :human chorionic g onadotrophin ; m onoclonal antibody ; hybridoma cell lines
人绒促性素(human chorionic g onadotrophin ,hCG ) 是人类受孕后胎盘合体滋养层细胞分泌的一种糖蛋白激素。在妊娠早期hCG 的浓度迅速增高, 检测尿中的hCG 即可证实妊娠[1]。有许多研究表明, 有游离的]的hCG 、义。2辛酸沉淀法、疏水色谱[3]、离子交换[4]等。这些方法操作复杂, 步骤繁琐, 纯化效率不高, 产率和纯度都很低。蛋白A 亲和色谱是纯化抗体的一种重要的方法。A 蛋白来源于金黄色葡萄球菌, 有5个位点能够与IgG 的Fc 段结合, 一个偶联在凝胶上的A 蛋白分子至少能结合2个IgG 分子。重组A 蛋白可通过C 端的半胱氨酸残基与琼脂糖凝胶单点偶合, 增加了重组A 蛋白与琼脂糖凝的结合量, 因此大大提高了重组A 蛋白2琼脂糖凝胶与抗体蛋白的结合能力[526]。这一特点使之非常适合用于纯化腹水中的单克隆抗体。但目前尚未见利用蛋白A 亲和色谱方法纯化hCG 单克隆抗体的报道。本研究以纯化的hCG 为免疫原, 利用经典的淋巴细胞融合技术, 建立了稳定分泌特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞株, 并对得到的单克隆抗体进行了纯化和鉴定, 以期为后续的早孕、肿瘤相关研究提供实验基础。1 材 料1. 1 动物、细胞株
BA LB/c 小鼠, 浙江省动物实验中心, 许可证:SCXK (浙200320001) ;F1小鼠, 浙江中医药大学动物实验中心, 许可证:SCXK(沪200720005) ;SP2/0骨髓瘤细胞, 华安生物技术有限公司。1. 2 仪器
层流超净台SC V 24A1Laboratory Prod 2
ucts ; 12S NCP ,Nikon ; lectron C orpora 2(5m L ) 、AK T A purifi 2er 。1. 3 试剂
hCG (5000U/mg ) , ProS pec 公司; H AT 培养液, 华安生物技术有限公司;PEG (相对分子质量5000) , Sigma 公司; 胎牛血清(BS A ) , 民海生物工程有限公司;RPMI 1640培养液, 吉诺生物医药技术有限公司; 羊抗小鼠IgG 2HRP , 博士德生物工程有限公司。2 方 法2. 1 免疫动物
取8周龄的BA LB/c 小鼠, 用hCG 抗原皮下多点免疫, 每次免疫量为100μg/只, 第1次免疫与等量的弗氏完全佐剂充分乳化, 第2,3次免疫与等量的弗氏不完全佐剂充分乳化, 每次间隔7d , 融合前
g 加强免疫。3d 腹腔直接注射抗原100μ2. 2 细胞融合
将小鼠处死, 无菌摘取脾脏, 研磨制取脾B 淋
巴细胞悬液, 洗涤调整细胞浓度为1×107～5×107/m L 备用。将免疫脾B 淋巴细胞与处于对数生长期的骨髓瘤细胞按5∶1混合后离心弃上清, 缓慢加入50%PEG溶液1m L , 间隔1min 后, 缓慢滴入无血清培养液, 终止融合剂的作用, 经洗涤去除融合剂后加入所需量的细胞培养液, 分种于96孔培养板孔内, 每孔100μL 。2. 3 杂交瘤细胞的筛选
在接种96孔培养板时, 每孔加入H AT 培养液100μL ,2～3d 换液1/2, 经过2周的培养后, 骨髓瘤细胞与B 淋巴细胞的杂交瘤细胞即被选择培养出,
24中国生化药物杂志Chinese Journal of Biochemical Pharmaceutics 2010年第31卷第1期
然后进行单克隆化。
克隆化方法用有限稀释法, 按实验室常规方法进行, 一般克隆化3～4次, 直至克隆细胞生长的各个孔检测100%抗体阳性为止。2. 4 单克隆抗体的制备及其性质的鉴定体内诱生法制备腹水, 按实验室常规方法进行。间接E LIS A 测抗体效价。将hCG 抗原1. 25U/孔包被酶标板, 设置空白对照孔,37℃包被过夜; P BS 2T (含有吐温20的磷酸盐缓冲液) 浸洗3次, 每孔加入封闭液(含1%BSA 的P BS 2T ) 200μL ,37℃孵育2h ; P BS 2T 浸洗3次, 每孔加入200μL 待测样, 以封闭液梯度稀释(10-1～10-8) ,37℃孵育1h ;P BS 2T 浸洗3次, 每孔加入用封闭液按1∶3000稀释的羊抗小鼠IgG 2HRP 100μL ,37℃孵育1h ; P BS 2T 浸洗3次, 双蒸水浸洗3次, 每孔加入邻苯二胺底物溶液100μL , 置暗处反应5min , 阳性孔变为棕黄色, 每孔加入2m ol/L H 2S O 4溶液100μL 终止反应。2. 5 抗体的纯化
选择5m 抗体。,10r/min 离心15min , 取上清, 经过0. 22μm 微孔滤膜过滤后, 用20mm ol/L 磷酸缓冲液上样, 用0. 1m ol/L 柠檬酸缓冲液洗脱。考察选择上样缓冲液的pH 值和离子强度、洗脱缓冲液的pH 值, 控制样品流速。
S DS 2PAGE 法鉴定单抗纯度。分离胶浓度12%, 浓缩胶浓度4%, 还原状态下处理样品, 电泳
96孔板, 经H AT 培养液筛选后, 测出7个阳性孔, 取上清效价最高(10-3) 的两孔细胞株(1C 1,2G 12) 单克
隆化4次。从表2看出, 第2～4次单克隆时,2株细胞的阳性率均为100%。杂交瘤细胞株经15周的培养后依旧能稳定分泌单克隆抗体。经液氮冻存复苏后仍能稳定分泌抗hCG 抗体。
表2 2株杂交瘤细胞株单克隆化实验结果
T ab. 2 Result of hybridoma cell cloning of 2hybridoma cells
细胞株1C1
2G 12
克隆次数
12341234有生长孔
[1**********]440阳性孔[**************]9阳性率89. 6%100%100%100%90. 3%100%100%100%
2测 细胞上清抗体效价达到了10-3以上(表3) 。3. 2. 2 腹水蛋白含量及抗体效价的检测 2株杂
交瘤细胞株注射小鼠腹腔均能产生较高浓度的蛋白, 且抗体效价均在10-7以上(表3) 。
表3 细胞上清和腹水中的蛋白含量及抗体效价
T ab. 3 Protein concentration and antibody titer of cell culture su 2pernate and obtained ascites
1C 1细胞上清2G 12细胞上清1C 1腹水2G 12腹水
后以考马斯亮蓝R250染色, 然后经凝胶成像仪扫描
鉴定纯度。3 结 果3. 1 hCG 杂交瘤细胞株的建立3. 1. 1 小鼠血清抗体效价检测 hCG 抗原免疫的BA LB/c 小鼠共6只, 眼眶取血检测效价(表1) 。6
蛋白/(mg/m L )
5. 275. 1331. 0830. 95
效价
10-310-310-710-7
3. 3 抗体的纯化
只小鼠的血清抗体效价都达到了10-7以上, 免疫效
果较好, 可进行细胞融合。
表1 免疫小鼠血清抗体效价
T ab. 1 Antibody titers in the sera of the mice immunized with hCG
在上样缓冲液pH 6. 5,7. 0,7. 5和8. 0条件下,
目的单抗基本保留在色谱介质上。在pH 7. 0的上样条件下, 洗脱的目的蛋白峰中杂蛋白含量较少, 回收率略高。
上样缓冲液的离子强度为4m ol/L 以上时会产生盐析效应, 影响抗体的稳定性。在0～3. 0m ol/L NaCl 的离子强度下, 目的单抗均能较好地与色谱介
小鼠编号
123456
效价
-1
-2
-3
-4
-5
-6
-7
------
-8
++++++
++++++
++++++
++++++
++++++
++++++
++++++
3. 1. 2 杂交瘤细胞株的建立 细胞融合后铺3块
质结合, 在3. 0m ol/L NaCl 的离子强度下, 洗脱的目
的蛋白峰中杂蛋白含量较少, 回收率较高。
采用pH 为3. 0的0. 1m ol/L 柠檬酸缓冲液进行洗脱时, 洗脱峰为单一峰, 而且峰形较好, 洗脱较完全, 回收率高。随着pH 的增加, 洗脱时间越长, 洗脱也越不完全, 抗体回收率降低。当pH 为6时, 无明显的洗脱峰。
中国生化药物杂志Chinese Journal of Biochemical Pharmaceutics 2010年第31卷第1期25
样品在各个流速下进行上样和洗脱, 都可以得到较高的纯度和回收率, 流速对其影响较小。因此为了提高效率, 可以采用5. 0m L/min 的流速进行上样和洗脱。
本实验确定pH 7. 0,20mm ol/L 磷酸缓冲液+3. 0m ol/L NaCl 为最佳上样条件;pH 3. 0,0. 1m ol/L 片段。故用完整的hCG 分子作为免疫原制备单克隆抗体, 或多或少地会和LH 、FSH 、TSH 发生交叉反应, 抗α2hCG 的抗体无法识别α2hCG 和甾体糖蛋白之间的差异[7]。因此我们设想下一步采用新型的基
β亚基羧基末端37肽因免疫法来制备针对hCG
(βhCG 2CTP ) 的单克隆抗体, 避免交叉反应。随着单抗在诊断与治疗中应用的快速发展, 对单抗的种类及数量的需求越来越多[8], 同时也对相应的下游纯化技术提出更高的要求。纯化抗体的方法多种多样, 硫酸铵沉淀法纯化后的纯度很有限; 辛酸提取法的操作时间太长, 效果也不是很理想; 离子交换色谱和凝胶过滤法纯化效果不错, 但是过程太繁琐; 疏水色谱能够影响蛋白的活性, 柱子的再生也比较困难。所以寻找具有高效、、纯度高的纯化, 仅一次纯, , 特异性, , 而且这种方法操作简便, 快速(通常在2h 即可完成纯化过程) , 重复性好, 色谱柱可反复多次使用, 为今后单抗用于基础研究及临床诊疗过程中的质量控制提供了保证。参考文献:
[1] 杨廷富. 人绒毛膜促性腺激素的临床意义及检测进展[J].检验
柠檬酸为最佳洗脱条件。纯化后抗体纯度达98%
以上, 回收率达75%。色谱结果如图1所示。电泳鉴定结果如图2所示
。
医学与临床,2007,4(10) :9762978.
[2] M ichael G,G reg ory W ,Annete G,et al. G enetic immunization with the
free human chorionic g onadotrophin βsubunit elicit cytotoxic T lym pho 2cyte responses and protects against tum or formation in m ice[J].LabIn 2vest ,1997,76(7) :8592871.
[3] M anzke O ,T esch H ,Diehl V ,et al. S ingle 2step purification of bispecific
m onoclonal antibodies for immunotherapeutic use by hydrophobic inter 2action chromatography [J].JImmunol M ethods ,1997,208:65273. [4] 谢竞, 石明隽, 张国忠, 等. 不同pH 值和盐浓度对柱色谱提取
4 讨 论
本文采用hCG 免疫BA LB/c 小鼠, 取其脾细胞
与小鼠骨艘瘤细胞SP2/0融合, 经反复筛选和单克隆化后得到2株稳定分泌单克隆抗体细胞株。所获得的单克隆抗体细胞株为将来有关早孕、癌症检测、激素本身相关研究及疫苗研制等领域打下基础。
hCG 与来自脑垂体的一些糖蛋白如促黄体生成素(LH ) 、促卵泡激素(FSH ) 和促甲状腺激素(TSH ) 等结构相似α, 链的氨基酸排列顺序基本相同, 而代表
β链羧基末端约30个氨基酸的hCG 特异性的仅是
抗2D 抗体的影响[J].中国生化药物杂志,2005,26(4) :2082210.
[5] M ccue J T ,K em p G,Low D ,et al. Evaluation of protein 2A chromatogra 2
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[6] Hahn R ,K azum ichi S ,S teindl F ,et al. C om paris on of protein A affinity
s orbents Ⅲ:Lifetime study [J].J Chromatogr A ,2006,1102(122) :2242231.
[7] S teven V C ,P owell J E ,Lee A C ,et al. Antifertility effects from immu 2
nization of female baboons with C 2term inal peptides of human chorionic gnadotropin[J].Fertil S teril ,1981,36:982105.
[8] 潘萌, 孔蕴, 陈畅. 单克隆抗体药物的研究进展[J].中国生化药
物杂志,2008,29(1) :62264.
22中国生化药物杂志Chinese Journal of Biochemical Pharmaceutics 2010年第31卷第1期
性分析实验表明,Citrostatin 同时具有杀伤肿瘤细胞的功能, 证明了Citrostatin 同时具有抑制肿瘤新生血管的形成和直接杀伤肿瘤的双重活性。但与等摩尔浓度的T 8、citropin1. 18比较, 在细胞和血管水平, 抑制效果无明显差异, 与化学合成的Citrostatin 相比, 抗肿瘤活性也无明显差别
[5]
或者通过酰胺化增加Citrostatin 的活性, 达到更好的
抑制肿瘤生长的目的, 这有待下一步的研究证实。参考文献:
[1] O ′Reilly M S ,Boehm T ,Shing Y,et al. Endostatin :anendogenous in 2
hibitor of angiogenesis and tum or growth [J].Cell ,1997,88:2772285. [2] D oyle J ,Brinkw orth C S ,W egener KL ,et al. nNOS inhibition ,antim i 2
crobial and anticancer activity of the am phibian skin peptide ,citropin1. 1and synthetic m odification [J ].Eur J Biochem , 2003, 270:114121153.
[3] W egener KL ,W abnitz P A ,Carver J A ,et al. H ost defence peptides
from the skin glands of the Australian blue m ountains tree 2frog Litoria
citropa . S olution structure of the antibacterial peptide citripin 1. 1[J].
。
Citrostatin 具有位于C 端的citropin1. 18序列, 其
带正电荷的极性氨基酸可与肿瘤细胞膜表层带负电荷的磷脂产生静电引力作用, 使Citrostatin 聚集于肿瘤细胞附近, 而新生肿瘤组织的血管丰富, 内皮细胞数量较多,Citrostatin 的浓度增加可增强对内皮细胞的抑制作用。尽管细胞和血管水平只反映了Citro 2statin 具有双功能的抗肿瘤活性, 但真正有意义的工
Eur J Biochem ,1999,265:6272637.
[4] M aeshima Y,Sudhakar A ,Lively J C ,et al. Tumstatin ,an endothelial
cell 2S pecific inhibitor of protein synthesis[J].Science ,2002,295:1402143.
[5] 马丽, , 杨志峰, 等. [J].第
作须在活体水平证明Citrostatin 与单独使用cit 2ropin1. 18、T 8相比, 具有明显抑制肿瘤生长的优势,
) 人绒促性素单克隆抗体的制备与分离纯化
沈 泓1, 易 喻1, 梅建凤1, 朱克寅2, 李 敏1, 应国清1
(1. 浙江工业大学药学院, 浙江杭州310014; 2. 杭州博林生物技术有限公司, 浙江杭州310018)
摘 要:目的制备人绒促性素(hCG ) 单克隆抗体。方法hCG 抗原免疫BA LB/c 小鼠, 取其脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0按5∶1融合, 间接E LIS A 法筛选阳性孔, 有限稀释法进行克隆化培养; 制备腹水抗体; 间接E LIS A 法测定抗体效价; 采用HiT rap rProtein A FF 亲和色谱柱纯化抗体。结果得到2株能稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株, 细胞培养上清中抗体效价达10-3以上, 腹水抗体效价达10-7以上, 纯化后的单抗纯度达98%以上, 回收率达
75%。结论成功获得两株能稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞, 可用于早孕、肿瘤等诊断的研究。
关键词:人绒促性素; 单克隆抗体; 杂交瘤细胞
中图分类号:Q57; Q813 文献标识码:A 文章编号:100521678(2010) 0120022204
Preparation and puri fication of monoclonal antibodies against human
chorionic gonadotrophin
SHE N H ong 1, YI Y u 1, MEI Jian 2feng 1, ZH U K e 2yin 2, LI Min 1, YI NG G uo 2qing 1
(1. School o f Pharmaceutical Science , Zhejiang Univer sity o f Technology , Hangzhou 310014, China ;
2. BIO LIN K Biopharm , Co. , Ltd. , Hangzhou 310018, China )
收稿日期:2009209208
基金项目:浙江省科技厅项目(2009c33089)
作者简介:沈泓(19832) , 女, 浙江杭州人, 硕士研究生, 研究方向为单克隆抗体的制备、分离纯化和应用研究; 应国清, 通信作者,bio 2
ph @zjut. edu. cn 。
中国生化药物杂志Chinese Journal of Biochemical Pharmaceutics 2010年第31卷第1期23
Abstract :PurposeT o prepare m onoclonal antibody against hCG. Methods Balb/c mice were immunized with hCG,and spleen cells from the mice were fused with myeloma cells SP2/0at ratio of 5∶1. P ositive clones were screened by indirect enzyme 2linked 2immunoads orbent assay (E LIS A ) ,then the clones were subcloned by limiting dilution and am plified further. A fter intraperitoneal injection of hybridoma cells ,m ouse ascites antibody was prepared. T itres and specificity of the ascites antibody were identified and determined by indirect E LIS A. The ascites were purified by protein A affinity chromatography. R esults T w o strains of hybridoma cell lines ob 2tained could secrete MAb stably. The titre of MAb of cell culture supernate is m ore than 10-3,and the titre of prepared ascites MAb is m ore than 10-7. The purity of the obtained m onoclonal antibody was m ore than 98%and recovery reached 75%after purification. Conclusion The obtained tw o strains of hybridoma cell lines can secrete MAb stably. The m onoclonal antibodies can be used in the research of early pregnancy and tum or diag 2nosis.
K ey w ords :human chorionic g onadotrophin ; m onoclonal antibody ; hybridoma cell lines
人绒促性素(human chorionic g onadotrophin ,hCG ) 是人类受孕后胎盘合体滋养层细胞分泌的一种糖蛋白激素。在妊娠早期hCG 的浓度迅速增高, 检测尿中的hCG 即可证实妊娠[1]。有许多研究表明, 有游离的]的hCG 、义。2辛酸沉淀法、疏水色谱[3]、离子交换[4]等。这些方法操作复杂, 步骤繁琐, 纯化效率不高, 产率和纯度都很低。蛋白A 亲和色谱是纯化抗体的一种重要的方法。A 蛋白来源于金黄色葡萄球菌, 有5个位点能够与IgG 的Fc 段结合, 一个偶联在凝胶上的A 蛋白分子至少能结合2个IgG 分子。重组A 蛋白可通过C 端的半胱氨酸残基与琼脂糖凝胶单点偶合, 增加了重组A 蛋白与琼脂糖凝的结合量, 因此大大提高了重组A 蛋白2琼脂糖凝胶与抗体蛋白的结合能力[526]。这一特点使之非常适合用于纯化腹水中的单克隆抗体。但目前尚未见利用蛋白A 亲和色谱方法纯化hCG 单克隆抗体的报道。本研究以纯化的hCG 为免疫原, 利用经典的淋巴细胞融合技术, 建立了稳定分泌特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞株, 并对得到的单克隆抗体进行了纯化和鉴定, 以期为后续的早孕、肿瘤相关研究提供实验基础。1 材 料1. 1 动物、细胞株
BA LB/c 小鼠, 浙江省动物实验中心, 许可证:SCXK (浙200320001) ;F1小鼠, 浙江中医药大学动物实验中心, 许可证:SCXK(沪200720005) ;SP2/0骨髓瘤细胞, 华安生物技术有限公司。1. 2 仪器
层流超净台SC V 24A1Laboratory Prod 2
ucts ; 12S NCP ,Nikon ; lectron C orpora 2(5m L ) 、AK T A purifi 2er 。1. 3 试剂
hCG (5000U/mg ) , ProS pec 公司; H AT 培养液, 华安生物技术有限公司;PEG (相对分子质量5000) , Sigma 公司; 胎牛血清(BS A ) , 民海生物工程有限公司;RPMI 1640培养液, 吉诺生物医药技术有限公司; 羊抗小鼠IgG 2HRP , 博士德生物工程有限公司。2 方 法2. 1 免疫动物
取8周龄的BA LB/c 小鼠, 用hCG 抗原皮下多点免疫, 每次免疫量为100μg/只, 第1次免疫与等量的弗氏完全佐剂充分乳化, 第2,3次免疫与等量的弗氏不完全佐剂充分乳化, 每次间隔7d , 融合前
g 加强免疫。3d 腹腔直接注射抗原100μ2. 2 细胞融合
将小鼠处死, 无菌摘取脾脏, 研磨制取脾B 淋
巴细胞悬液, 洗涤调整细胞浓度为1×107～5×107/m L 备用。将免疫脾B 淋巴细胞与处于对数生长期的骨髓瘤细胞按5∶1混合后离心弃上清, 缓慢加入50%PEG溶液1m L , 间隔1min 后, 缓慢滴入无血清培养液, 终止融合剂的作用, 经洗涤去除融合剂后加入所需量的细胞培养液, 分种于96孔培养板孔内, 每孔100μL 。2. 3 杂交瘤细胞的筛选
在接种96孔培养板时, 每孔加入H AT 培养液100μL ,2～3d 换液1/2, 经过2周的培养后, 骨髓瘤细胞与B 淋巴细胞的杂交瘤细胞即被选择培养出,
24中国生化药物杂志Chinese Journal of Biochemical Pharmaceutics 2010年第31卷第1期
然后进行单克隆化。
克隆化方法用有限稀释法, 按实验室常规方法进行, 一般克隆化3～4次, 直至克隆细胞生长的各个孔检测100%抗体阳性为止。2. 4 单克隆抗体的制备及其性质的鉴定体内诱生法制备腹水, 按实验室常规方法进行。间接E LIS A 测抗体效价。将hCG 抗原1. 25U/孔包被酶标板, 设置空白对照孔,37℃包被过夜; P BS 2T (含有吐温20的磷酸盐缓冲液) 浸洗3次, 每孔加入封闭液(含1%BSA 的P BS 2T ) 200μL ,37℃孵育2h ; P BS 2T 浸洗3次, 每孔加入200μL 待测样, 以封闭液梯度稀释(10-1～10-8) ,37℃孵育1h ;P BS 2T 浸洗3次, 每孔加入用封闭液按1∶3000稀释的羊抗小鼠IgG 2HRP 100μL ,37℃孵育1h ; P BS 2T 浸洗3次, 双蒸水浸洗3次, 每孔加入邻苯二胺底物溶液100μL , 置暗处反应5min , 阳性孔变为棕黄色, 每孔加入2m ol/L H 2S O 4溶液100μL 终止反应。2. 5 抗体的纯化
选择5m 抗体。,10r/min 离心15min , 取上清, 经过0. 22μm 微孔滤膜过滤后, 用20mm ol/L 磷酸缓冲液上样, 用0. 1m ol/L 柠檬酸缓冲液洗脱。考察选择上样缓冲液的pH 值和离子强度、洗脱缓冲液的pH 值, 控制样品流速。
S DS 2PAGE 法鉴定单抗纯度。分离胶浓度12%, 浓缩胶浓度4%, 还原状态下处理样品, 电泳
96孔板, 经H AT 培养液筛选后, 测出7个阳性孔, 取上清效价最高(10-3) 的两孔细胞株(1C 1,2G 12) 单克
隆化4次。从表2看出, 第2～4次单克隆时,2株细胞的阳性率均为100%。杂交瘤细胞株经15周的培养后依旧能稳定分泌单克隆抗体。经液氮冻存复苏后仍能稳定分泌抗hCG 抗体。
表2 2株杂交瘤细胞株单克隆化实验结果
T ab. 2 Result of hybridoma cell cloning of 2hybridoma cells
细胞株1C1
2G 12
克隆次数
12341234有生长孔
[1**********]440阳性孔[**************]9阳性率89. 6%100%100%100%90. 3%100%100%100%
2测 细胞上清抗体效价达到了10-3以上(表3) 。3. 2. 2 腹水蛋白含量及抗体效价的检测 2株杂
交瘤细胞株注射小鼠腹腔均能产生较高浓度的蛋白, 且抗体效价均在10-7以上(表3) 。
表3 细胞上清和腹水中的蛋白含量及抗体效价
T ab. 3 Protein concentration and antibody titer of cell culture su 2pernate and obtained ascites
1C 1细胞上清2G 12细胞上清1C 1腹水2G 12腹水
后以考马斯亮蓝R250染色, 然后经凝胶成像仪扫描
鉴定纯度。3 结 果3. 1 hCG 杂交瘤细胞株的建立3. 1. 1 小鼠血清抗体效价检测 hCG 抗原免疫的BA LB/c 小鼠共6只, 眼眶取血检测效价(表1) 。6
蛋白/(mg/m L )
5. 275. 1331. 0830. 95
效价
10-310-310-710-7
3. 3 抗体的纯化
只小鼠的血清抗体效价都达到了10-7以上, 免疫效
果较好, 可进行细胞融合。
表1 免疫小鼠血清抗体效价
T ab. 1 Antibody titers in the sera of the mice immunized with hCG
在上样缓冲液pH 6. 5,7. 0,7. 5和8. 0条件下,
目的单抗基本保留在色谱介质上。在pH 7. 0的上样条件下, 洗脱的目的蛋白峰中杂蛋白含量较少, 回收率略高。
上样缓冲液的离子强度为4m ol/L 以上时会产生盐析效应, 影响抗体的稳定性。在0～3. 0m ol/L NaCl 的离子强度下, 目的单抗均能较好地与色谱介
小鼠编号
123456
效价
-1
-2
-3
-4
-5
-6
-7
------
-8
++++++
++++++
++++++
++++++
++++++
++++++
++++++
3. 1. 2 杂交瘤细胞株的建立 细胞融合后铺3块
质结合, 在3. 0m ol/L NaCl 的离子强度下, 洗脱的目
的蛋白峰中杂蛋白含量较少, 回收率较高。
采用pH 为3. 0的0. 1m ol/L 柠檬酸缓冲液进行洗脱时, 洗脱峰为单一峰, 而且峰形较好, 洗脱较完全, 回收率高。随着pH 的增加, 洗脱时间越长, 洗脱也越不完全, 抗体回收率降低。当pH 为6时, 无明显的洗脱峰。
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样品在各个流速下进行上样和洗脱, 都可以得到较高的纯度和回收率, 流速对其影响较小。因此为了提高效率, 可以采用5. 0m L/min 的流速进行上样和洗脱。
本实验确定pH 7. 0,20mm ol/L 磷酸缓冲液+3. 0m ol/L NaCl 为最佳上样条件;pH 3. 0,0. 1m ol/L 片段。故用完整的hCG 分子作为免疫原制备单克隆抗体, 或多或少地会和LH 、FSH 、TSH 发生交叉反应, 抗α2hCG 的抗体无法识别α2hCG 和甾体糖蛋白之间的差异[7]。因此我们设想下一步采用新型的基
β亚基羧基末端37肽因免疫法来制备针对hCG
(βhCG 2CTP ) 的单克隆抗体, 避免交叉反应。随着单抗在诊断与治疗中应用的快速发展, 对单抗的种类及数量的需求越来越多[8], 同时也对相应的下游纯化技术提出更高的要求。纯化抗体的方法多种多样, 硫酸铵沉淀法纯化后的纯度很有限; 辛酸提取法的操作时间太长, 效果也不是很理想; 离子交换色谱和凝胶过滤法纯化效果不错, 但是过程太繁琐; 疏水色谱能够影响蛋白的活性, 柱子的再生也比较困难。所以寻找具有高效、、纯度高的纯化, 仅一次纯, , 特异性, , 而且这种方法操作简便, 快速(通常在2h 即可完成纯化过程) , 重复性好, 色谱柱可反复多次使用, 为今后单抗用于基础研究及临床诊疗过程中的质量控制提供了保证。参考文献:
[1] 杨廷富. 人绒毛膜促性腺激素的临床意义及检测进展[J].检验
柠檬酸为最佳洗脱条件。纯化后抗体纯度达98%
以上, 回收率达75%。色谱结果如图1所示。电泳鉴定结果如图2所示
。
医学与临床,2007,4(10) :9762978.
[2] M ichael G,G reg ory W ,Annete G,et al. G enetic immunization with the
free human chorionic g onadotrophin βsubunit elicit cytotoxic T lym pho 2cyte responses and protects against tum or formation in m ice[J].LabIn 2vest ,1997,76(7) :8592871.
[3] M anzke O ,T esch H ,Diehl V ,et al. S ingle 2step purification of bispecific
m onoclonal antibodies for immunotherapeutic use by hydrophobic inter 2action chromatography [J].JImmunol M ethods ,1997,208:65273. [4] 谢竞, 石明隽, 张国忠, 等. 不同pH 值和盐浓度对柱色谱提取
4 讨 论
本文采用hCG 免疫BA LB/c 小鼠, 取其脾细胞
与小鼠骨艘瘤细胞SP2/0融合, 经反复筛选和单克隆化后得到2株稳定分泌单克隆抗体细胞株。所获得的单克隆抗体细胞株为将来有关早孕、癌症检测、激素本身相关研究及疫苗研制等领域打下基础。
hCG 与来自脑垂体的一些糖蛋白如促黄体生成素(LH ) 、促卵泡激素(FSH ) 和促甲状腺激素(TSH ) 等结构相似α, 链的氨基酸排列顺序基本相同, 而代表
β链羧基末端约30个氨基酸的hCG 特异性的仅是
抗2D 抗体的影响[J].中国生化药物杂志,2005,26(4) :2082210.
[5] M ccue J T ,K em p G,Low D ,et al. Evaluation of protein 2A chromatogra 2
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s orbents Ⅲ:Lifetime study [J].J Chromatogr A ,2006,1102(122) :2242231.
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[8] 潘萌, 孔蕴, 陈畅. 单克隆抗体药物的研究进展[J].中国生化药
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