ＲｅｓｅａｒｃｈＡｒｔｉｄｅｓ
７８
基础研究
ｎ管内皮鱼
车晓聪刘水潘妻凰是国§
【捕２ｌ目的分析共培养时太鼠血管内皮细胞（ＶＥＣｓ）对大鼠血管平滑肌细胞（ｖＳＭＣｓ）表型转化的影响．方法ＶＳＭＣｓ直接种植于
培养板表面，ＶＥＣｓ删种植于与ＶＳＭＣｓ相对的浮胶底面。免疫荧光方挂观察和鍪窟ＶＥＣｓ和ＶＳＭＣｓ，ＲＴ－ＰＣＲ和共聚焦Ｅ傲镜分析丧型相关＃园的表达。结果搋代培养的大鼠ＶＥＣｓ呈铺路石样形志．ｖｗＦ巍色阳性。原代培养的大鼠ＶＳＭＣｓ免疫最光垡色ｄ－ＳＭＡ呈阳性。
ＲＴ－ＰＣＲ椅测结果表明．４８ｈ共培养组ＶＳＭＣｓ的合成表型相关基因ＣＲＢＰ－ｌ、ｓｍ哪ｂ的表达水平显著高干单独培葬组．分别为Ｉ
４倍，ｌ５
倍－７２ｈ选到峰值．分别为Ｉ７倍、２Ｉ倍．９６ｈ开始下降，搀培养组中收缩表！标记物Ｓｍｏｏｔｈｅｌｆａ—Ｂ和ＳＭ－ＭＨＣ的基园表达木平在４８ｈ、７２ｈ＆著低于单拙培养组．９６ｈＳｍ∞ｔｈｅｌｉｎ—Ｂ却高于单独培养维。单抽培养组上进备ｇ因的变化趋势Ｔ变或保持稳定。免癌荧光结果显示ＳＭ—ＭＨＣ＊白表达在共培养组中９６ｈ后从下降转为升高（Ｐ＜００５）。结论在共培养体系中，血管内皮细胞对缸管平滑肌细胞表型转化的作用表现为先促进向合成型转化，９６ｈ后促进向性缩型转化。
！＊望ｉ加表型－细胞共培养一血管内皮细胞ｔ血管平滑肌细胞ｔ基目表达
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血管疾病中，血管平滑肌细胞（…１＂ｓｍｉｔｈ
任动脉粥样硬化，高血压，血管成形术后再抉窄等心
平滑肌细胞表掣转化的重要凼素，在疾病发生发胜中，内皮
ｍｕｓｃｌｅｃｅｌｌｓ，
细胞分泌ＰＤＧＦ
ＴＧＦ—Ｄ等细胞因子．影响平滑肌细胞的形
ＶＳＭＣｓ）由收缩型转ｆｔ为台成型，增殖和迂移能力显菩增强，态和生理特性”。平滑肌细胞所表达的肌球蛋白莆链（ｓｍｉｔｈ
埘疾病的形成和发展有关键作川。血管内虚细胞（ｖａｓｃｕ［ａｒ
ｍｕｓｃｌｅｍｙｏｓｉｎｈｅａｖｙ
ｃｈａｉｎ．ＳＭ－ＭＨＣ）和Ｓｍｏｏｔｈｃｌｉｎ－Ｂ是其处
ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ
ｃｅｌｌｓ，ＶＥＣｓ）与平滑肌细胞之间的相互作用是悯节
丁收缩状态的标志性蛋白，当平滑肌细胞由收缩型转化为合成刊时ｓｍｏｏｔｈｅｌｉｎ－Ｂ是表达最先下嘲直至消失的标志蛋白”－旺
《＆《月８６３＊Ｍ（２００９ＡＡ０２２１１０１
胎型肌球蛋白市链（ｎｏｎ－ｍｏｓｃｌｃ
ｍｙｏｓｉｎ
ｈｅａｗｃｈａｉｎｉｓｏｆｏｍ—Ｂ，
”ｏ单ｎ：２０００３２±＊．女日＾￥ｈ海‰｛％Ｈｆ＆物｛女％｛
Ｓｍｅｍｂ）和细胞砚黄醇结合蛋白一１（ｃｅｌｌｕｌａｒ『ｃｔｔｈｏｌｂｉｎｄｉｎｇ
ｆ｝日槭Ⅻ女镕ｉＨ）
ｐｒｏｔｅｉｎ
１．ｃＲＢｐ－Ｉ）则与其台成表型相关［３１。
２００４３３
ｔ海，ｉＥ＾｛女￥々Ｉ程半《（Ｅ目ｍ）
Ｉ型胶原是血管壁结构中最重要的胞外基质成分之，本
Ⅲｍｎ女：镕§Ａ．Ｅ－ｍａｉｌ：１￥¨＠ｓｈｍｕ
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万方数据
Ｒｅｓｅａｒｃｈ
基础研究Ｉ
Ａｒｔｉｃｌｅｓ｜
７９
次实验所采用胶原浮胶共培养系统，为细胞提供了类似生理条件的培养环境，十分有利于研究两种细胞间的相互作用，同时通过对共培养体系中ＶＳＭＣｓ表型相关基因的表达情况进行分析，初步探讨内皮细胞对平滑肌细胞表型转化的影响。
１材料和方法
１．１材料：ＳＤ大鼠购自上海斯莱克实验动物有限公司。ＤＭＥＭ培养基（Ｇｉｂｃｏ—ＢＲＬ，美国）；胎牛血清（Ｈｙｃｌｏｎｅ，美国）ｌ羊抗大鼠ＣＤ３１，兔抗大鼠ＳＭ－ＭＨＣ，Ｓｍｏｏｔｈｅｌｉｎ—Ｂ，
Ｓｍｅｍｂ和ＣＲＢＰ．１均购自ＳａｎｔａＣｒｕｚ公司ｌＦＩＴＣ－小鼠抗羊
ＩｇＧ，ＴＲＩＴＣ－小鼠抗兔ＩｇＧ均购自Ｃｈｅｍｉｃｏｎ公司；鼠尾一型胶原（ＢＤ，美国）ｌＴｒｙｐｓｉｎ—ＥＤＴＡ，青霉素，链霉素，Ｌ－谷氨酰胺，氢化可的松，肝素，ＥＧＦ，ｂＦＧＦ均购白Ｓｉｇｍａ公司。
１．２方法：
１．２．１大鼠血管内皮细胞分离和培养：取２５０９的ＳＤ大鼠１只，断颈处死，无菌条件下剖开胸腔，取胸主动脉２－３厘米，ＰＢＳ冲洗清除血细胞。翻转血管，结扎两端，注入ｌｇ／Ｌ（Ｏ．１％）胶原酶于３７℃消化１５～２０ｍｉｎ。收集消化液，１０００ｒ／ｍｉｎ离心１０ｒａｉｎ，沉淀用内皮细胞完全培养基重悬，接种于六孔板（Ｃｏｍｉｎｇ，美国）中，于３７℃，５％ＣＯ，培养箱中常规培养。血管内皮细胞完全培养液成分：ＤＭＥＭ基础培养液、
１０％ＦＢＳ、１００Ｕ／ｍｌ青霉素，１００｝ｔｇ／ｍｌ链霉素、ｌＩ＿ｔｇ／ｍｌ两性
霉素Ｂ、１０Ｕ／ｍｌ肝素、１ｌａｇ／ｍｌ氢化可的松、２０
ｎｇ／ｒｒｄＥＧＦ、２
ｎ鲋血ｂＦＧＦ、２ｍｍｏｌ／ｍｌＬ一谷氨酰胺和２０Ｉ．ｔｇ／ｍｌ牛脑抽提。细胞每３天换液一次，汇合达７０～８０％细胞用Ｏ．０２５％Ｔｒｙｐｓｉｎ－ＥＤＴＡ消化传代。并于第二代做ｖ＇ＷＦ鉴定。第４～５代细胞用于实验。
１．２．２大鼠血管平滑肌细胞分离和培养：取２５０９的ＳＤ大鼠１只，断颈处死，无菌条件下剖开胸腔，取胸主动脉２—３厘米，置装有４℃无菌ＰＢＳ液的培养皿中。用眼科镊去除血管外结缔组织，剖开血管。尽量刮除内膜。用眼科剪将其剪成约１１１１１／１３的组织块，均匀放于培养瓶底部，翻转培养瓶，并加入ＤＭＥＭ培养液２ｍｌ，于３７℃，５％ＣＯ，培养箱中静置１２～２４ｈ后，再次翻转培养瓶，使培养液浸没组织块，继续培养，每３天换液一次。平滑肌细胞培养液成分：ＤＭＥＭ基础培养液、
ＩＯ％ＦＢＳ、１００Ｕ／ｍｌ青霉素、１００ｒｔｇ／ｍｌ链霉素、ｌ斗ｇ／Ｉｎｌ两性
霉素Ｂ和２ｍｍｏｌ／ｍｌＬ一谷氨酰胺。待细胞汇合达７０％～８０％时，用Ｏ．０５％Ｔｒｙｐｓｉｎ－０．０１％ＥＤＴＡ消化传代，并做０【・ＳＭＡ鉴定。第４～５代细胞用于实验
１．２．３浮胶联合培养模型１４］：胶原凝胶（１．５ｍｇ／ｍ１）制备：ｌ×体积的１０×ＰＢＳ，１．５×体积的鼠尾Ｉ型胶原母液（１０．０３ｍｇ／ｍ１），０．０３５×体积的ｌ
ＮＮａＯＨ，７．４６
Ｘ的ｄｄＨ，Ｏ。所有
操作在冰面上完成。ＶＥＣｓ以５×１０４／孔密度先种植于培养板。
２４
ｈ后，吸掉未贴壁的细胞，并吸净孔内剩余培养液。加入工作浓度为１．５ｍｇ／ｍｌ鼠尾Ｉ型胶原，每孔２５０１ａｌ铺于单层ＶＥＣｓ上，于３７℃，５％ＣＯ，培养箱放置３０ｍｉｎ左右，待胶原凝固后沿孔侧壁缓缓加入４００肛ｌ培养液，轻轻晃动，直至胶原凝胶
万方数据
剥离培养孔底部悬浮于培养液中，镜下观察可见单层ＶＥＣｓ附着在胶原凝胶底层。然后将ＶＳＭＣｓ细胞悬液按ｌ×１０４／孔密度沿孔内侧壁轻轻加至浮胶底部，并放入３７＂（２，５％ＣＯｚ培养箱，隔天换液一次。加入ＶＳＭＣｓ后整个操作过程避免晃动，防止含有ＶＳＭＣｓ的细胞悬液进入浮胶上层。
１．２．４
Ｒ．Ｔ—ＰＣＲ基因表达分析：按照总ＲＮＡ抽
提说明（申能博彩，生工），分别在１８ｈ，３６ｈ，４８ｈ，７２ｈ四个时间点收集共培养与单独培养的ＶＳＭＣｓ，并从总ＲＮＡ中取出２９用于ｃＤＮＡ合成。参与ＰＣＲ的寡核苷酸正义链与反义链引物序列分别是：ＳＭ—ＭＨＣ
（３７ｌｂｐ）５’一ＡＴＣＧＣＣＣＡＧＣＴＧＧＡＧＧＡＧＧＡＧ－３’，
５’．ＴＣＡＴＣＣＴＣＣＡＣＣＴＧＣＡＧ一３’。Ｓｍｏｏｔｈｅｌｉｌｌ－Ｂ
（１５３ｂｐ）５’一ＣＣＣＧＴＣＣＴＧＣＴＴＴＧＣＡＧＴ一３’，
５’－ＡＴＣＣＡＡＧＴＴＴＡＴＴＡＧＡＡＡＣＡＣＴＣＣＡ一３’ｔＳｍｅｍｂ
（３４０ｂｐ）５’－ＧＴＡＴＧＴＧＡＡＣＣＣＡＣＡＡＣＣＣＡＣＡＡ－３’，５’－ＴＧＴＣＣＡＣＴＧＧＣＴＴＣＴＣＡＧＧＧＴ乙３’；ＣＲＢＰ－１（２５３ｂｐ）
５’一ＣＡＧＡＴＧＡＡＧＣＴＡＣＴＴＧＴＡＴＧＧＧＣＴＴＣ．３’．５’一ＧＧＣＡＡＡＧＣＧＡＡＧＣＴＴＴＧＧＣＡＴＣ．３’：ＧＡＰＤＨ
（１４４ｂｐ）５’一ＡＴＧＧＧＴＧＴＧＡＡＣＣＡＣＧＡＧＡＡ－３’，
５’－ＧＧＣＡＴＧ（认ｃＴＧＴＧＧＴＣＡＴＧＡ．３’。ＰＣＲ产物１．２％琼脂糖凝胶电泳鉴定，并用Ｇｅｌｗｏｒｋｓ软件分析，以ＧＡＰＤＨ为内参照测定其相对含量。
１．２．５激光共聚焦基因表达分析：细胞接种在放置有无菌盖玻片的６孔板中，吸尽培养液，ＰＢＳ洗涤３次，加入４％多聚甲醛，固定１５ｍｉｎ；ＰＢＳ洗３次，每次５ｍｉｎｌ０．２％ＴｒｉｔｏｎＸ一１００孵育破膜５ｍｉｎ；ＰＢＳ洗涤后用２％ＢＳＡ室温封闭３０
ｍｉｎ
Ｉ去
封闭液，分别在盖玻片上加人１：２５０稀释的羊抗大鼠ｓＭ．ＭＨＣ单抗作用３０
ｍｉｎ
ｌ
ＰＢＳ洗涤３次，每次５ｍｉｎ，去除未
结合一抗ｌ然后滴加ＦＩＴＣ标记兔抗羊ＩｇＧ作用３０
ｍｉｎ
ｌ
ＰＢＳ
洗涤３次，每次５ｒａｉｎ，去除未结合二抗；抗荧光淬灭液封片，
置于ＬｅｉｃａＴＣＳＳＰ２激光共聚焦显微镜下观察拍照，用Ｉｍａｇｅ—
ｐｒｏＰｌｕｓ
５．０软件分析。
１．２．６数据统计：应用ＳＰＳＳ１５．０软件进行统计学分析，多因素分析采用ＡＮＯＶＡ检验，组间比较采用ｔ检验。数据用均数土标准差（灵土Ｓ）表示，Ｐ＜０．０５认为有统计学差异。
２结果
２．１
ＶＥＣｓ和ＶＳＭＣｓ的培养与鉴定：原代分离的ＶＥＣｓ培
养后５天后汇合，具有典型铺路石样形态；细胞ｖＷＦ染色呈阳性（图ｌＡ）。大鼠主动脉分离的ＶＳＭＣｓ于３代后呈现均一形态，长梭形，细胞汇合后出现典型波峰波谷样结构；细胞ａ．ＳＭＡ染色阳性（图１Ｂ）。
２．２
ｔｋＴ—ＰＣＲ基因表达分析：通过与内参ＧＡＰＤＨ的
ｍＲＮＡ表达水平做对照，结果表明，４８ｈ共培养组平滑肌细胞的合成表型相关基因ＣＲＢＰ一１、Ｓｍｅｍｂ的表达水平显著高于平滑肌细胞单独培养组，分别为１．４倍、１．５倍；７２ｈ达到峰值，分别为１．７倍、２．１倍；Ｓｍｏｏｔｈｅｌｉｎ・Ｂ和ＳＭ—ＭＨＣ的基因表达
Ｒｅｓｅａｎ：ｈＡＣｄｄｅｓ
８０
基础研究
目１＾ｍｆ自＆目＊州Ｆｉ＆＊＊女Ｅ■２
Ｂ
ｍｆ｝女肌目｜ａ—ＳＭＡ￡＆＊＊女ｅ１２ｆ
ｘ
２００）
女ｔ％Ｎ■∞
１８ｈ
水平在４８ｈ、７２ｈ显著低干单独培养组。９６１１北培养组中收缩型标志基园表达水平由Ｆ降趋势转为上升，Ｓｍ∞ｔｈｅｌｉｎ—Ｂ和ＳＭ—ＭＨＣ的基因表达水平是其７２ｈ的Ｌ５倍，ｌ４倍．台成型标志基因表达水平由Ｌ升趋势转为降低。单独培养组上述基因的变化趋势不变或保持稳定（同２）。
Ｍａｒｋｅｒ１８ｈ
＂ｈ７２ｈ％ｈ
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目２
弘ｈｏ”缸。孙ｈ
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ＶＳＭＣｓｌ■＊＊ｌ目＾ｔＲＴ—ＰＣＲ＊＊（ｍ目№＃’ｐ＜Ｏ０５．ｍ＾ｎ＆＃Ｐ＜００５
＾－Ｄ＃ｇ＊ＣＲＢＰ—Ｔ。Ｓｃｅｍｂ、Ｓ㈣ｅｌｍ—Ｂ、驯一ＭＨＣｌｔ＾｝
万方数据
Ｉ
三
ｍ
Ｉｌ
—■ｍ２．３盘毛共幕＾矗目曩退苛轩：共培养射中平滑帆绷傀ＳＭ－ＭＨＣ崔白柱达量先降低后升高即在毫２４ｈ．４９ｈ
７２ｈ蛐分别是二ｑ５卜ｌ
９７９２３３９—２３３７．１６２６＋Ｉ５７３，
１８
３３＋１．２８６ｔ共培莽组ＳＭ－ＭＨＣ蛋白表选量低手单觳坫捧纽
托旃４８７２小时分＊Ⅱ是时照ｌｎ表过水平的７７４５％６６２７％【Ｉ目
３）。但在９６小时．共培养组中ＳＭ—ＭＨＣ表达水牛娃著高ｆ
７２
…ｄ＇４１＂ｔ（Ｐ＜００５）．而单挂培养组中９６小时低于７２小时。
…Ｌ
血管内度细袍帮’Ｆ清叽细匏毡椅成血管壁的州种ｔ要细咆，内左细胞与平泔肌细胞细胞之唧的栩Ⅱ作嘲是删带平滑叽
细匏功能和促进血管，Ｉ娃的电要嘲卖。内应细弛畦成Ｊ’赫耳血液和昔肇问的结构粹而．叮＂泌多种强教生ｆｔ卉忻．调节血细
犯通行、血管收缩张力细胞生ｋ自皿管壁的重均。１型较塬址血管壁的ｔ要眙外举质成”２．十＂有｝忏忡恤细胞的拈
附．薤为细绝生长提供良ｔｆ的谥环境ｊ。血管内｝￡｛Ｉｌ｜鸭对平清叽细胞”ｆ抽ｊ影响尚￡定论研秉ｍ的宴鹎材辑、培＃最件的
年Ｈ．｛￡往捍刊平１日的结罂“。如Ｃｕｃｉｍ等１阱究啦啦花舍Ｏ１％胎牛血清的ＤＭＥＭ培养液中，共培养的ｍ蒋内虚细
万方数据
ＲｅｓｅａｒｃｈＡｒｔｉｄｅｓ
基础研究８１
目３＾ｔ｝■脯＊Ｓ№¨ＨＣ＃■＊＊《女＊ｌ自＊＊
ｍ目＆＃’ｐｅ００５．ｎ自＆《●Ｐ曲０５Ｊ
Ａ—Ｄ＊月＾２４ｈ、４Ｂｈ．７２｜１、９曲＃％＃目÷ＳＭ—ＭＨＣｉｔｍＲＥ—Ｈ＊月＾２４ｈ、４Ｂｈ、７抓、９曲￥＃镕＃目÷ＳＭ—ＭＨＣｔｔ＊ａ
胞促进平ｉｆ｝叽细胞坩殖．即在１８ｈ共培养拊中・Ｆ滑叽蜘咆的增
噎铯力是币｝ｌ｝叽细咆草弛培养组的４情．而Ｂｍ帅等－‘壬甩
Ｆａｌｃｏｎ鼓站捧系缱．往禽：５％小中血捕的ＤＭＥＭ培养条件下对牛嘲ｔ功咻内友细抱和平滑帆绷匏进ｆｊ接培养．墅现内
应细胞可“性进平滑肌细艳向收缩丧刊转化．即花４８ｈ搀培养
中平滑肌缃胞收缩型标忐蛋扫ＳＭ－ＭＨＣ￥ｍ∞ｌｈｅｌｉｎ是单蛙
培养平ｉ｝｝帆纳咆的２．２、２１５倍。
我们的戎骆结睽证明．在肚啄浮日ｔ捆憎挑培养体系中．血管内皮炯啦耐中滑＿Ｌ细糙表型转他的作哪表现为先促进其
向台啦型＃化．后促进向收缩型转ｆ￡．ＲＴ－ＰＣＲ捡捆结景轰
咐．｜８ｈ・Ｆ漪肌蛔咆的啬成表型拼凳墓闲ＣＲＢＰ－１ｓ雌ｍｂ的
矗述木平垃菩高ｆ二Ｆ精肌细胞单挂培养ｄｌｔ收缩丧型标记物Ｓｍｏｏｔｌ＂ｌｍ－Ｂ和ＳＭ－ＭＨＣ的肇碉表选水Ｆ芷４８ｈ
７２ｈ娃著低
于啦拽培捧｜Ｉｉ。９６ｈＪ≈培捧纽中收缩型酥占蒜州表逃水ｆＩｈｌ：
降趋势转为Ｉ：Ｈ，Ｓ—ｔｈｅｌｉｎ－Ｂ和ＳＭ—ＭＩＩ（＇的旌附矗遮木平硅
苒７２ｈ的Ｉ６ｆ自Ｉ４倍．盘成型标志毕闻点逃水Ｆ山上升也势
转为降怔．啦蛆培养蛆ｂ￡墓四的变化ｂ势１、查点懈持匏宅．
柯研究拄叫．内虚细咆处于小嗣七ｋ状态．对＃滑叽矗型转化的作刚也币相同．排培养时．内皮细胞可”泌ｐＤＧＦ．
ＲｅｓｅａｒｃｈＡｒｔｉｃｌｅｓ
８２
基础研究
ＴＧＦ－Ｄ、ＶＥＧＦ等多种细胞因子对平滑肌细胞进行调节Ｅ９］。维持和改变有重要作用。Ｈｉｐｐｅｒ等ｍ１通过对大鼠大动脉平滑肌细胞体外培养研究证明循环脉冲机械张力可以减少ＤＮＡ合成，维持平滑肌细胞收缩状态。也有研究认为机械张力有双向作用，既可促进增殖也可增强收缩型基因的表达【”】。剪应力对平滑肌细胞表型转化有多方面的影响，可降低ＳＭ－ＭＨＣ、ｓｍｏｏｔｈｉｌｉｎ的表达，同时增强ＳＭｏ【一ａｃｔｉｎ和ＳＭ２２的表达［１４１。在模拟体内血流动态变化的环境下，研究共培养时内皮细胞对平滑肌细胞表型的影响，是我们进一步研究的方ｗｈⅪ等¨０】研究发现，增殖期内皮细胞分泌的ＰＤＧＦ等血管
活性物质明显高于融合生长的内皮细胞，而ＰＤＧＦ是强有丝分裂原，与平滑肌细胞上的酪氨酸激酶活性受体结合后，可使收缩型标志蛋白ＳＭｏ【－ａｃｔｉｎ和ＳＭ２２表达受抑制［ＨＩ，从而促使平滑肌细胞向合成表型转化。我们的实验结果，内皮细胞先促进平滑肌细胞合成型后促进收缩型，即可能与内皮细胞先增殖后保持融合状态有关，需要进一步实验证明。
体内血管受到血流的作用，机械力对平滑肌细胞表型的
Ｕｃｕｚｉａｎ
ＡＡ，ＧａｓｓｍａｎＡＡ，ＥａｓｔＡＴ，ｅｔａ１．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
ｍｅｄｉａｔｏｒｓｏｆ
ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ【Ｊ】ＪＢｕｒｎＣａｒｅＲｅｓ，２０１０，３１（１）：１５８－７５．
２
ｖａｉｌ
ＥｙｓＧＪ，Ｎｉｅｓｓｅｎ
ＰＭ，ＲｅｎｓｅｎＳＳ．Ｓｍｏｏｔｈｅｌｉｎ
ｉｎｖａｓｃｕｌａｒｓｍｏｏｔｈｍｕｓｃｌｅ
ｃｅｌｌｓ［Ｊ】．ＴｒｅｎｄｓＣａｒｄｉｏｖａｓｃ
Ｍｅｄ，２００７，１７（１）：２６・３０．
ＲｅｎｓｅｎＳＳ，Ｄｏｅｖｅｎｄａｎｓ
ＰＡ，ｖａｎ
Ｅｙｓ
ＧＪ．Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ
ａｎｄｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ
ｏｆｖａｓｃｕｌａｒ
ｓｍｏｏｔｈ
ｍｕｓｃｌｅｃｅｌｌｐｈｅｎｏｔｙｐｉｃｄｉｖｅｒｓｉｔｙ［Ｊ】
Ｎｅｔｈ
Ｈｅａｒｔ以２００７，１５（３）：１００－８．
４
刘水，李晓聪，方宁涛，等．与胶原浮胶细胞共培养中内皮细
胞血管新生相关基因的表达［Ｊ】．中国组织工翟研究与倚床康
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Ｐａｎｇ
Ｙ．Ｇｒｅｉｓｌｅｒ
ＨＰ．Ｕｓｉｎｇ
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ｇｒｏｗｔｈ
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ｃｅｌｌ
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鼬馏，２０１０，２４（１）：１１６・２６．
血管内皮细胞对平滑肌细胞表型转化的影响
作者：作者单位：
李晓聪， 刘水， 潘銮凤， 吴国强， Li Xiao-cong， Liu Shui， Pan Luan-feng， Wu Guo-qaing
李晓聪,刘水,潘銮凤,Li Xiao-cong,Liu Shui,Pan Luan-feng(复旦大学上海医学院分子生物学实验室,上海,200032)， 吴国强,Wu Guo-qaing(复旦大学力学与工程学系,上海,200433)
中国分子心脏病学杂志
MOLECULAR CARDIOLOGY OF CHINA2011,11(2)
刊名：英文刊名：年，卷(期)：
本文链接：http://d.g.wanfangdata.com.cn/Periodical_zgfzxzbxzz201102004.aspx
ＲｅｓｅａｒｃｈＡｒｔｉｄｅｓ
７８
基础研究
ｎ管内皮鱼
车晓聪刘水潘妻凰是国§
【捕２ｌ目的分析共培养时太鼠血管内皮细胞（ＶＥＣｓ）对大鼠血管平滑肌细胞（ｖＳＭＣｓ）表型转化的影响．方法ＶＳＭＣｓ直接种植于
培养板表面，ＶＥＣｓ删种植于与ＶＳＭＣｓ相对的浮胶底面。免疫荧光方挂观察和鍪窟ＶＥＣｓ和ＶＳＭＣｓ，ＲＴ－ＰＣＲ和共聚焦Ｅ傲镜分析丧型相关＃园的表达。结果搋代培养的大鼠ＶＥＣｓ呈铺路石样形志．ｖｗＦ巍色阳性。原代培养的大鼠ＶＳＭＣｓ免疫最光垡色ｄ－ＳＭＡ呈阳性。
ＲＴ－ＰＣＲ椅测结果表明．４８ｈ共培养组ＶＳＭＣｓ的合成表型相关基因ＣＲＢＰ－ｌ、ｓｍ哪ｂ的表达水平显著高干单独培葬组．分别为Ｉ
４倍，ｌ５
倍－７２ｈ选到峰值．分别为Ｉ７倍、２Ｉ倍．９６ｈ开始下降，搀培养组中收缩表！标记物Ｓｍｏｏｔｈｅｌｆａ—Ｂ和ＳＭ－ＭＨＣ的基园表达木平在４８ｈ、７２ｈ＆著低于单拙培养组．９６ｈＳｍ∞ｔｈｅｌｉｎ—Ｂ却高于单独培养维。单抽培养组上进备ｇ因的变化趋势Ｔ变或保持稳定。免癌荧光结果显示ＳＭ—ＭＨＣ＊白表达在共培养组中９６ｈ后从下降转为升高（Ｐ＜００５）。结论在共培养体系中，血管内皮细胞对缸管平滑肌细胞表型转化的作用表现为先促进向合成型转化，９６ｈ后促进向性缩型转化。
！＊望ｉ加表型－细胞共培养一血管内皮细胞ｔ血管平滑肌细胞ｔ基目表达
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ｃｅｌｌｓ；Ｇ…ｘＤｍｓｓｌｏｎ
血管疾病中，血管平滑肌细胞（…１＂ｓｍｉｔｈ
任动脉粥样硬化，高血压，血管成形术后再抉窄等心
平滑肌细胞表掣转化的重要凼素，在疾病发生发胜中，内皮
ｍｕｓｃｌｅｃｅｌｌｓ，
细胞分泌ＰＤＧＦ
ＴＧＦ—Ｄ等细胞因子．影响平滑肌细胞的形
ＶＳＭＣｓ）由收缩型转ｆｔ为台成型，增殖和迂移能力显菩增强，态和生理特性”。平滑肌细胞所表达的肌球蛋白莆链（ｓｍｉｔｈ
埘疾病的形成和发展有关键作川。血管内虚细胞（ｖａｓｃｕ［ａｒ
ｍｕｓｃｌｅｍｙｏｓｉｎｈｅａｖｙ
ｃｈａｉｎ．ＳＭ－ＭＨＣ）和Ｓｍｏｏｔｈｃｌｉｎ－Ｂ是其处
ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ
ｃｅｌｌｓ，ＶＥＣｓ）与平滑肌细胞之间的相互作用是悯节
丁收缩状态的标志性蛋白，当平滑肌细胞由收缩型转化为合成刊时ｓｍｏｏｔｈｅｌｉｎ－Ｂ是表达最先下嘲直至消失的标志蛋白”－旺
《＆《月８６３＊Ｍ（２００９ＡＡ０２２１１０１
胎型肌球蛋白市链（ｎｏｎ－ｍｏｓｃｌｃ
ｍｙｏｓｉｎ
ｈｅａｗｃｈａｉｎｉｓｏｆｏｍ—Ｂ，
”ｏ单ｎ：２０００３２±＊．女日＾￥ｈ海‰｛％Ｈｆ＆物｛女％｛
Ｓｍｅｍｂ）和细胞砚黄醇结合蛋白一１（ｃｅｌｌｕｌａｒ『ｃｔｔｈｏｌｂｉｎｄｉｎｇ
ｆ｝日槭Ⅻ女镕ｉＨ）
ｐｒｏｔｅｉｎ
１．ｃＲＢｐ－Ｉ）则与其台成表型相关［３１。
２００４３３
ｔ海，ｉＥ＾｛女￥々Ｉ程半《（Ｅ目ｍ）
Ｉ型胶原是血管壁结构中最重要的胞外基质成分之，本
Ⅲｍｎ女：镕§Ａ．Ｅ－ｍａｉｌ：１￥¨＠ｓｈｍｕ
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万方数据
Ｒｅｓｅａｒｃｈ
基础研究Ｉ
Ａｒｔｉｃｌｅｓ｜
７９
次实验所采用胶原浮胶共培养系统，为细胞提供了类似生理条件的培养环境，十分有利于研究两种细胞间的相互作用，同时通过对共培养体系中ＶＳＭＣｓ表型相关基因的表达情况进行分析，初步探讨内皮细胞对平滑肌细胞表型转化的影响。
１材料和方法
１．１材料：ＳＤ大鼠购自上海斯莱克实验动物有限公司。ＤＭＥＭ培养基（Ｇｉｂｃｏ—ＢＲＬ，美国）；胎牛血清（Ｈｙｃｌｏｎｅ，美国）ｌ羊抗大鼠ＣＤ３１，兔抗大鼠ＳＭ－ＭＨＣ，Ｓｍｏｏｔｈｅｌｉｎ—Ｂ，
Ｓｍｅｍｂ和ＣＲＢＰ．１均购自ＳａｎｔａＣｒｕｚ公司ｌＦＩＴＣ－小鼠抗羊
ＩｇＧ，ＴＲＩＴＣ－小鼠抗兔ＩｇＧ均购自Ｃｈｅｍｉｃｏｎ公司；鼠尾一型胶原（ＢＤ，美国）ｌＴｒｙｐｓｉｎ—ＥＤＴＡ，青霉素，链霉素，Ｌ－谷氨酰胺，氢化可的松，肝素，ＥＧＦ，ｂＦＧＦ均购白Ｓｉｇｍａ公司。
１．２方法：
１．２．１大鼠血管内皮细胞分离和培养：取２５０９的ＳＤ大鼠１只，断颈处死，无菌条件下剖开胸腔，取胸主动脉２－３厘米，ＰＢＳ冲洗清除血细胞。翻转血管，结扎两端，注入ｌｇ／Ｌ（Ｏ．１％）胶原酶于３７℃消化１５～２０ｍｉｎ。收集消化液，１０００ｒ／ｍｉｎ离心１０ｒａｉｎ，沉淀用内皮细胞完全培养基重悬，接种于六孔板（Ｃｏｍｉｎｇ，美国）中，于３７℃，５％ＣＯ，培养箱中常规培养。血管内皮细胞完全培养液成分：ＤＭＥＭ基础培养液、
１０％ＦＢＳ、１００Ｕ／ｍｌ青霉素，１００｝ｔｇ／ｍｌ链霉素、ｌＩ＿ｔｇ／ｍｌ两性
霉素Ｂ、１０Ｕ／ｍｌ肝素、１ｌａｇ／ｍｌ氢化可的松、２０
ｎｇ／ｒｒｄＥＧＦ、２
ｎ鲋血ｂＦＧＦ、２ｍｍｏｌ／ｍｌＬ一谷氨酰胺和２０Ｉ．ｔｇ／ｍｌ牛脑抽提。细胞每３天换液一次，汇合达７０～８０％细胞用Ｏ．０２５％Ｔｒｙｐｓｉｎ－ＥＤＴＡ消化传代。并于第二代做ｖ＇ＷＦ鉴定。第４～５代细胞用于实验。
１．２．２大鼠血管平滑肌细胞分离和培养：取２５０９的ＳＤ大鼠１只，断颈处死，无菌条件下剖开胸腔，取胸主动脉２—３厘米，置装有４℃无菌ＰＢＳ液的培养皿中。用眼科镊去除血管外结缔组织，剖开血管。尽量刮除内膜。用眼科剪将其剪成约１１１１１／１３的组织块，均匀放于培养瓶底部，翻转培养瓶，并加入ＤＭＥＭ培养液２ｍｌ，于３７℃，５％ＣＯ，培养箱中静置１２～２４ｈ后，再次翻转培养瓶，使培养液浸没组织块，继续培养，每３天换液一次。平滑肌细胞培养液成分：ＤＭＥＭ基础培养液、
ＩＯ％ＦＢＳ、１００Ｕ／ｍｌ青霉素、１００ｒｔｇ／ｍｌ链霉素、ｌ斗ｇ／Ｉｎｌ两性
霉素Ｂ和２ｍｍｏｌ／ｍｌＬ一谷氨酰胺。待细胞汇合达７０％～８０％时，用Ｏ．０５％Ｔｒｙｐｓｉｎ－０．０１％ＥＤＴＡ消化传代，并做０【・ＳＭＡ鉴定。第４～５代细胞用于实验
１．２．３浮胶联合培养模型１４］：胶原凝胶（１．５ｍｇ／ｍ１）制备：ｌ×体积的１０×ＰＢＳ，１．５×体积的鼠尾Ｉ型胶原母液（１０．０３ｍｇ／ｍ１），０．０３５×体积的ｌ
ＮＮａＯＨ，７．４６
Ｘ的ｄｄＨ，Ｏ。所有
操作在冰面上完成。ＶＥＣｓ以５×１０４／孔密度先种植于培养板。
２４
ｈ后，吸掉未贴壁的细胞，并吸净孔内剩余培养液。加入工作浓度为１．５ｍｇ／ｍｌ鼠尾Ｉ型胶原，每孔２５０１ａｌ铺于单层ＶＥＣｓ上，于３７℃，５％ＣＯ，培养箱放置３０ｍｉｎ左右，待胶原凝固后沿孔侧壁缓缓加入４００肛ｌ培养液，轻轻晃动，直至胶原凝胶
万方数据
剥离培养孔底部悬浮于培养液中，镜下观察可见单层ＶＥＣｓ附着在胶原凝胶底层。然后将ＶＳＭＣｓ细胞悬液按ｌ×１０４／孔密度沿孔内侧壁轻轻加至浮胶底部，并放入３７＂（２，５％ＣＯｚ培养箱，隔天换液一次。加入ＶＳＭＣｓ后整个操作过程避免晃动，防止含有ＶＳＭＣｓ的细胞悬液进入浮胶上层。
１．２．４
Ｒ．Ｔ—ＰＣＲ基因表达分析：按照总ＲＮＡ抽
提说明（申能博彩，生工），分别在１８ｈ，３６ｈ，４８ｈ，７２ｈ四个时间点收集共培养与单独培养的ＶＳＭＣｓ，并从总ＲＮＡ中取出２９用于ｃＤＮＡ合成。参与ＰＣＲ的寡核苷酸正义链与反义链引物序列分别是：ＳＭ—ＭＨＣ
（３７ｌｂｐ）５’一ＡＴＣＧＣＣＣＡＧＣＴＧＧＡＧＧＡＧＧＡＧ－３’，
５’．ＴＣＡＴＣＣＴＣＣＡＣＣＴＧＣＡＧ一３’。Ｓｍｏｏｔｈｅｌｉｌｌ－Ｂ
（１５３ｂｐ）５’一ＣＣＣＧＴＣＣＴＧＣＴＴＴＧＣＡＧＴ一３’，
５’－ＡＴＣＣＡＡＧＴＴＴＡＴＴＡＧＡＡＡＣＡＣＴＣＣＡ一３’ｔＳｍｅｍｂ
（３４０ｂｐ）５’－ＧＴＡＴＧＴＧＡＡＣＣＣＡＣＡＡＣＣＣＡＣＡＡ－３’，５’－ＴＧＴＣＣＡＣＴＧＧＣＴＴＣＴＣＡＧＧＧＴ乙３’；ＣＲＢＰ－１（２５３ｂｐ）
５’一ＣＡＧＡＴＧＡＡＧＣＴＡＣＴＴＧＴＡＴＧＧＧＣＴＴＣ．３’．５’一ＧＧＣＡＡＡＧＣＧＡＡＧＣＴＴＴＧＧＣＡＴＣ．３’：ＧＡＰＤＨ
（１４４ｂｐ）５’一ＡＴＧＧＧＴＧＴＧＡＡＣＣＡＣＧＡＧＡＡ－３’，
５’－ＧＧＣＡＴＧ（认ｃＴＧＴＧＧＴＣＡＴＧＡ．３’。ＰＣＲ产物１．２％琼脂糖凝胶电泳鉴定，并用Ｇｅｌｗｏｒｋｓ软件分析，以ＧＡＰＤＨ为内参照测定其相对含量。
１．２．５激光共聚焦基因表达分析：细胞接种在放置有无菌盖玻片的６孔板中，吸尽培养液，ＰＢＳ洗涤３次，加入４％多聚甲醛，固定１５ｍｉｎ；ＰＢＳ洗３次，每次５ｍｉｎｌ０．２％ＴｒｉｔｏｎＸ一１００孵育破膜５ｍｉｎ；ＰＢＳ洗涤后用２％ＢＳＡ室温封闭３０
ｍｉｎ
Ｉ去
封闭液，分别在盖玻片上加人１：２５０稀释的羊抗大鼠ｓＭ．ＭＨＣ单抗作用３０
ｍｉｎ
ｌ
ＰＢＳ洗涤３次，每次５ｍｉｎ，去除未
结合一抗ｌ然后滴加ＦＩＴＣ标记兔抗羊ＩｇＧ作用３０
ｍｉｎ
ｌ
ＰＢＳ
洗涤３次，每次５ｒａｉｎ，去除未结合二抗；抗荧光淬灭液封片，
置于ＬｅｉｃａＴＣＳＳＰ２激光共聚焦显微镜下观察拍照，用Ｉｍａｇｅ—
ｐｒｏＰｌｕｓ
５．０软件分析。
１．２．６数据统计：应用ＳＰＳＳ１５．０软件进行统计学分析，多因素分析采用ＡＮＯＶＡ检验，组间比较采用ｔ检验。数据用均数土标准差（灵土Ｓ）表示，Ｐ＜０．０５认为有统计学差异。
２结果
２．１
ＶＥＣｓ和ＶＳＭＣｓ的培养与鉴定：原代分离的ＶＥＣｓ培
养后５天后汇合，具有典型铺路石样形态；细胞ｖＷＦ染色呈阳性（图ｌＡ）。大鼠主动脉分离的ＶＳＭＣｓ于３代后呈现均一形态，长梭形，细胞汇合后出现典型波峰波谷样结构；细胞ａ．ＳＭＡ染色阳性（图１Ｂ）。
２．２
ｔｋＴ—ＰＣＲ基因表达分析：通过与内参ＧＡＰＤＨ的
ｍＲＮＡ表达水平做对照，结果表明，４８ｈ共培养组平滑肌细胞的合成表型相关基因ＣＲＢＰ一１、Ｓｍｅｍｂ的表达水平显著高于平滑肌细胞单独培养组，分别为１．４倍、１．５倍；７２ｈ达到峰值，分别为１．７倍、２．１倍；Ｓｍｏｏｔｈｅｌｉｎ・Ｂ和ＳＭ—ＭＨＣ的基因表达
Ｒｅｓｅａｎ：ｈＡＣｄｄｅｓ
８０
基础研究
目１＾ｍｆ自＆目＊州Ｆｉ＆＊＊女Ｅ■２
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水平在４８ｈ、７２ｈ显著低干单独培养组。９６１１北培养组中收缩型标志基园表达水平由Ｆ降趋势转为上升，Ｓｍ∞ｔｈｅｌｉｎ—Ｂ和ＳＭ—ＭＨＣ的基因表达水平是其７２ｈ的Ｌ５倍，ｌ４倍．台成型标志基因表达水平由Ｌ升趋势转为降低。单独培养组上述基因的变化趋势不变或保持稳定（同２）。
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—■ｍ２．３盘毛共幕＾矗目曩退苛轩：共培养射中平滑帆绷傀ＳＭ－ＭＨＣ崔白柱达量先降低后升高即在毫２４ｈ．４９ｈ
７２ｈ蛐分别是二ｑ５卜ｌ
９７９２３３９—２３３７．１６２６＋Ｉ５７３，
１８
３３＋１．２８６ｔ共培莽组ＳＭ－ＭＨＣ蛋白表选量低手单觳坫捧纽
托旃４８７２小时分＊Ⅱ是时照ｌｎ表过水平的７７４５％６６２７％【Ｉ目
３）。但在９６小时．共培养组中ＳＭ—ＭＨＣ表达水牛娃著高ｆ
７２
…ｄ＇４１＂ｔ（Ｐ＜００５）．而单挂培养组中９６小时低于７２小时。
…Ｌ
血管内度细袍帮’Ｆ清叽细匏毡椅成血管壁的州种ｔ要细咆，内左细胞与平泔肌细胞细胞之唧的栩Ⅱ作嘲是删带平滑叽
细匏功能和促进血管，Ｉ娃的电要嘲卖。内应细弛畦成Ｊ’赫耳血液和昔肇问的结构粹而．叮＂泌多种强教生ｆｔ卉忻．调节血细
犯通行、血管收缩张力细胞生ｋ自皿管壁的重均。１型较塬址血管壁的ｔ要眙外举质成”２．十＂有｝忏忡恤细胞的拈
附．薤为细绝生长提供良ｔｆ的谥环境ｊ。血管内｝￡｛Ｉｌ｜鸭对平清叽细胞”ｆ抽ｊ影响尚￡定论研秉ｍ的宴鹎材辑、培＃最件的
年Ｈ．｛￡往捍刊平１日的结罂“。如Ｃｕｃｉｍ等１阱究啦啦花舍Ｏ１％胎牛血清的ＤＭＥＭ培养液中，共培养的ｍ蒋内虚细
万方数据
ＲｅｓｅａｒｃｈＡｒｔｉｄｅｓ
基础研究８１
目３＾ｔ｝■脯＊Ｓ№¨ＨＣ＃■＊＊《女＊ｌ自＊＊
ｍ目＆＃’ｐｅ００５．ｎ自＆《●Ｐ曲０５Ｊ
Ａ—Ｄ＊月＾２４ｈ、４Ｂｈ．７２｜１、９曲＃％＃目÷ＳＭ—ＭＨＣｉｔｍＲＥ—Ｈ＊月＾２４ｈ、４Ｂｈ、７抓、９曲￥＃镕＃目÷ＳＭ—ＭＨＣｔｔ＊ａ
胞促进平ｉｆ｝叽细胞坩殖．即在１８ｈ共培养拊中・Ｆ滑叽蜘咆的增
噎铯力是币｝ｌ｝叽细咆草弛培养组的４情．而Ｂｍ帅等－‘壬甩
Ｆａｌｃｏｎ鼓站捧系缱．往禽：５％小中血捕的ＤＭＥＭ培养条件下对牛嘲ｔ功咻内友细抱和平滑帆绷匏进ｆｊ接培养．墅现内
应细胞可“性进平滑肌细艳向收缩丧刊转化．即花４８ｈ搀培养
中平滑肌缃胞收缩型标忐蛋扫ＳＭ－ＭＨＣ￥ｍ∞ｌｈｅｌｉｎ是单蛙
培养平ｉ｝｝帆纳咆的２．２、２１５倍。
我们的戎骆结睽证明．在肚啄浮日ｔ捆憎挑培养体系中．血管内皮炯啦耐中滑＿Ｌ细糙表型转他的作哪表现为先促进其
向台啦型＃化．后促进向收缩型转ｆ￡．ＲＴ－ＰＣＲ捡捆结景轰
咐．｜８ｈ・Ｆ漪肌蛔咆的啬成表型拼凳墓闲ＣＲＢＰ－１ｓ雌ｍｂ的
矗述木平垃菩高ｆ二Ｆ精肌细胞单挂培养ｄｌｔ收缩丧型标记物Ｓｍｏｏｔｌ＂ｌｍ－Ｂ和ＳＭ－ＭＨＣ的肇碉表选水Ｆ芷４８ｈ
７２ｈ娃著低
于啦拽培捧｜Ｉｉ。９６ｈＪ≈培捧纽中收缩型酥占蒜州表逃水ｆＩｈｌ：
降趋势转为Ｉ：Ｈ，Ｓ—ｔｈｅｌｉｎ－Ｂ和ＳＭ—ＭＩＩ（＇的旌附矗遮木平硅
苒７２ｈ的Ｉ６ｆ自Ｉ４倍．盘成型标志毕闻点逃水Ｆ山上升也势
转为降怔．啦蛆培养蛆ｂ￡墓四的变化ｂ势１、查点懈持匏宅．
柯研究拄叫．内虚细咆处于小嗣七ｋ状态．对＃滑叽矗型转化的作刚也币相同．排培养时．内皮细胞可”泌ｐＤＧＦ．
ＲｅｓｅａｒｃｈＡｒｔｉｃｌｅｓ
８２
基础研究
ＴＧＦ－Ｄ、ＶＥＧＦ等多种细胞因子对平滑肌细胞进行调节Ｅ９］。维持和改变有重要作用。Ｈｉｐｐｅｒ等ｍ１通过对大鼠大动脉平滑肌细胞体外培养研究证明循环脉冲机械张力可以减少ＤＮＡ合成，维持平滑肌细胞收缩状态。也有研究认为机械张力有双向作用，既可促进增殖也可增强收缩型基因的表达【”】。剪应力对平滑肌细胞表型转化有多方面的影响，可降低ＳＭ－ＭＨＣ、ｓｍｏｏｔｈｉｌｉｎ的表达，同时增强ＳＭｏ【一ａｃｔｉｎ和ＳＭ２２的表达［１４１。在模拟体内血流动态变化的环境下，研究共培养时内皮细胞对平滑肌细胞表型的影响，是我们进一步研究的方ｗｈⅪ等¨０】研究发现，增殖期内皮细胞分泌的ＰＤＧＦ等血管
活性物质明显高于融合生长的内皮细胞，而ＰＤＧＦ是强有丝分裂原，与平滑肌细胞上的酪氨酸激酶活性受体结合后，可使收缩型标志蛋白ＳＭｏ【－ａｃｔｉｎ和ＳＭ２２表达受抑制［ＨＩ，从而促使平滑肌细胞向合成表型转化。我们的实验结果，内皮细胞先促进平滑肌细胞合成型后促进收缩型，即可能与内皮细胞先增殖后保持融合状态有关，需要进一步实验证明。
体内血管受到血流的作用，机械力对平滑肌细胞表型的
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ｇｅｎｅ
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ＤＮＡ
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Ｈａｌｋａ
ＡＴ，ＴｕｒｎｅｒＮＪ，ＣａｒｔｅｒＡ，ｅｔａ１．Ｔｈｅｅｆｆｅｃｔｓｏｆｓｔｒｅｔｃｈｏｎ
ｖａｓｃｕｌａｒ
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Ｊ，Ｌａｎｇａｎ
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Ｖａｓｃ
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血管内皮细胞对平滑肌细胞表型转化的影响
作者：作者单位：
李晓聪， 刘水， 潘銮凤， 吴国强， Li Xiao-cong， Liu Shui， Pan Luan-feng， Wu Guo-qaing
李晓聪,刘水,潘銮凤,Li Xiao-cong,Liu Shui,Pan Luan-feng(复旦大学上海医学院分子生物学实验室,上海,200032)， 吴国强,Wu Guo-qaing(复旦大学力学与工程学系,上海,200433)
中国分子心脏病学杂志
MOLECULAR CARDIOLOGY OF CHINA2011,11(2)
刊名：英文刊名：年，卷(期)：
本文链接：http://d.g.wanfangdata.com.cn/Periodical_zgfzxzbxzz201102004.aspx