动物转基因方法技术研究新进展

农业生物技术学报 Journal of Agricultural Biotechnology 2008,16(1):163~168

·综述·

动物转基因技术研究新进展

施振旦 1 *，李万利 1，张永亮 1，陈学进 2

(1. 华南农业大学动物科学学院， 2. 上海交通大学医学院附属新华医院发育生物学实验室， 广州 510642； 上海 200092)

摘要：动物转基因的关键限制因素是制备效率和基因表达的精确调控。综述了近年发展的提高转基因效率的非定点整合 调控外源基因表达的时空 转基因方法， 如睾丸转基因法和卵巢转基因法； 提高转基因精确性的定点整合转基因的基因打靶法； 通过转基因对特定基因的进行表达时空和可逆的 RNA 干扰灵活精细调控。 对这些新的转基因方 表达和可控表达转基因策略；

法的优缺点进行了讨论， 并探讨如何利用这些方法进行转基因动物的制备。

效率； 时空表达； 可控表达； RNA 干扰 关键词：转基因方法； S188 文献标识码： A 中图分类号：

1006­1304(2008)01­0163­06 文章编号：

An Update on the Development of Techniques for Producing Transgenic Animals

1 1 1 2

SHI Zhen­dan *,LI Wan­li , ZHANG Yong­liang , CHEN Xue­jin

Efficiency and specificity are key limiting factors on preparation of transgenic animals. This review describes the re­

cently developed animal gene transfer techniques, including gene transfer into the testis and ovary for easily making non­sitespecific methods;gene targeting in embryonic stem cells, somatic cells and primordial germ cells for site specific methods;and site­and time­ specific gene targeting and controlled expression of transferred genes. In addition, methods of utilizing newly developed RNA inter­ ference, combined with the above gene expression controlling techniques, to produce transgenic animals to pGEX­PR 和 pET­PR­S and reversibly knock down specific genes are also discussed. The merits and disadvantages for each method are also discussed, as well as potentials of using these methods to develop transgenic animals for breeding of new animal lines, studying of disease models and production of therapeutic

medicines.

gene transfer method;efficiency;spatio­temporalexpression;inducible expression;RNA interference

动物转基因技术是将外源基因移入动物细胞并

整合到基因组中，从而使其得以表达。自从 Berg

如何利用这些技术更好地服务于动物新品种培育、 医学疾病模型研究、 生物制药等领域。

and Eckardt (1970)创立 DNA 重组技术、 Jaenisch and Mintz (1974) 首次利用反转录病毒感染胚胎的方法 进行动物转基因以来，动物转基因技术得到不断完

电穿孔、 善和发展。 利用逆转录病毒介导、 显微注射、 制备了小鼠、 脂质体介导、 精子载体等转基因方法， 大鼠、 兔、 猪、 绵羊、 山羊、 鸡、 蛙、 鱼类等多种转基因 动物。而近几年来动物转基因的方法和转基因的内 涵又有了新进展，包括通过简便的性腺注射介导的 转入 RNA 干扰基因、 转基因、 基因打靶结合克隆的 定点整合转基因和基因的条件表达转基因技术等， 本文对这些新近发展的技术作详细的介绍，并探讨

2007­05­15 收稿日期：

2007­06­13 接受日期：

1 性腺转基因方法

早期的动物转基因研究中，大量应用了利用逆

精子 转录病毒介导、 显微注射、 电穿孔、 脂质体介导、

1996；陈永福， 载体法等方法（魏平华和陈清轩，

2002）， 这些方法需要复杂的操作仪器和胚胎体外培 养等复杂的实验过程，同时获得转基因动物的效率 很低， 一般不到 10%。

Kim 根据精子作为外源基因载体转

基因的原理，及一般细胞都能够吸收外源 DNA 的 把外源基因用脂质体转染精原细胞， 再将被转原理，

*通讯作者。Author for correspondence. 教授, 主要从事动物分子遗传与基因工程研究。E­mail:.

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农 业 生 物 技 术 学 报 2008 年

染的精原细胞微注射到精原细胞被破坏的雄性动物 的睾丸的曲精细管内，结果发现小鼠在康复后可以 产生携带外源基因的精子。如果利用这样的小鼠对 雌鼠交配，可以预期能够产生含有所转外源基因的 转基因小鼠。沈新明等 (2002) 省略了对精原细胞转 染外源基因并对曲精细胞移植转染细胞的步骤， 直 接用人巨细胞病毒启动子调控的增强型绿色荧光蛋 白表达载体注射到小鼠的曲精细管内，最后通过与 雌鼠交配，成功获得了表达绿色荧光蛋白的转基因 仔鼠。Yuan

(2005) 报道向通过向曲精细管内

注射外源 DNA ， 然后再结合对曲精细管电击或电穿 孔处理， 以使外源基因进入睾丸生精细胞。 然后将这 些处理的雄鼠与母鼠交配，得到的小鼠中有一组的 阳性检测率达 25%。Shen

则将处理方法 更为简化，首先直接向雄兔睾丸内注射携带绿色荧 光表达的外源 DNA 及二甲基亚枫的介质， 使 DNA 能够进入睾丸细胞和生精细胞。一个月后用处理的 雄兔与雌兔交配，

所产生后代的 56%仔兔能高效地 表达所导入的外源基因。这一转入外源基因的阳性 率大大高于以往精子载体法或其他非定点转基因方

法的结果。

对应于在雄性动物的向睾丸注射外源基因，

Yang (2007)直接对小鼠的卵巢注射绿色荧光

蛋白基因， 也可以得到转基因小鼠， 并且检测后代的 阳性率达 54%， 并且发现获得的 6 代以内的转基因 小鼠都具有较好的遗传稳定性。用同样的方法制作 转基因鸡的研究中， 阳性率高达 67.65%。

由于通过性腺转基因操作简便、 技术要求较低、 难度较小，这种方法将成为一个制作转基因动物的 方向， 有可能用于如猪和牛这样的大动物的转基因。 然而该方法制备转基因动物时，仍然存在外源基因 随机整合进入与宿主基因组的问题，因此目前还无 法利用此方法随意地获得理想的转基因动物。

2 定点制作转基因动物的方法

由于非定点转基因方法使外源基因随机整合到 宿主细胞染色体上，使得制作转基因动物带有很大

的偶然性， 外源基因的表达的可控性也较差。 同时由 于外源基因随机整合到宿主基因组，很可能破坏宿

主基因的正常表达， 将影响到宿主的发育和存活。 因 此新的定点整合转基因方法就应运而生了，一般通

称为基因打靶 （gene targeting ）。 2.1胚胎干细胞(ES 细胞)基因打靶方法

基因打靶是在胚胎干细胞技术和同源重组技术 基础上发展起来的可对基因组进行定点修饰的实验

技术。 基因打靶通过外源 DNA 与染色体 DNA 之间 的同源重组、精细地定点修饰和改造基因 DNA 片 段，具有位点专一性强和打靶后目的片段可以与染 色体 DNA 共同稳定遗传的特点。Thomas and

Capecchi (1987) 首先对小鼠 ES 细胞进行了基因打 靶， 然后将此打靶的 ES 细胞移植进入小鼠囊胚， 将 此重组胚移植进入代孕母鼠， 最后产出嵌合体仔鼠， 通过相互交配获得基因敲除的纯合小鼠。基因打靶

包括基因敲除 （knock out ） 和基因敲入 （knock in ） 技 术。目前利用以上技术已经制备了大量基因敲除小 鼠，在研究基因功能和疾病模型研究方面作出了贡 献。 相应地， 外源基因也可以通过基因打靶转入小鼠 基因组，并获得了通过基因敲入的转基因小鼠 (Gu

1993) ，实现了外源基因在宿主基因组的定点 整合。

2.2 对体细胞进行基因打靶

虽然 ES 细胞具有全能性，并且具有无限传代 和增殖的能力，但是由于目前尚未建立起一套有效 的完善的适用于任何物种 ES 细胞的分离和培养方 法， 到目前为止很多物种尚未得到 ES 细胞， 而体细 胞便于采集、 数量巨大， 并可以在体外增殖培养， 所 以通过对体细胞进行基因打靶，使外源性基因定点

的整合到体细胞的基因组中，再结合体细胞克隆来 生产转基因动物将是一个不错的选择。McCreath

(2000) 报道了用体细胞核移植生产出了基因打 靶绵羊。Lai

(2002) 和 Dai (2002) 报道了 用基因打靶及克隆的方法制作出了敲除 琢1,3­  糖苷

转移酶的转基因猪， Kuroiwa (2004) 通过敲除

牛朊蛋白 基因制作了无疯牛病的牛 ， 不会

发生乳房炎的奶牛 (Wall

2005) 和能够合成多 不饱和脂肪酸的猪 (Lai

2006) 也被制备到 。

体细胞基因打靶结合克隆的方法早就定型，

问 题是如何提高体细胞克隆的效率。对此，

Kuroiwa (2004) 通过对基因印记较少和较为年轻化的胎 牛成纤维细胞进行基因打靶，细胞经过克隆后构建

重组胚并移植到子宫内发育成 2.5 月龄的胎儿， 再 将此胎儿流产并再次分离出成纤维细胞，对此进行 重复打靶获得纯合型基因敲除细胞，然后再进行克

隆胚的构建和移植，

重组胚移植后怀孕 45d 的受胎 率达到 45%。此方法大大提高了基因敲除动物的制 备效率， 经过 5 次移植、 流产、

胎儿成纤维细胞分离、 基因打靶和重构胚制备的循环，

在 22 个月内生产了 按传统方法需要 6 年时间才能获得的纯合敲除

和

两个基因的牛。

一般在体细胞克隆研究中都是制备异体克隆，

第 1期 施振旦等：动物转基因技术研究新进展

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即提供细胞核的供体动物都不同于提供卵母细胞的 受体动物。异体克隆胚可能由于基因印记可能导致 核质相互作用的不协调，致使目前制备克隆动物的 效率都很低。为了解决这一问题， Yang

(2006) 把体细胞核移植入源于同一母牛的去核卵子，克隆 后激活的同体重组胚中基因重排要大大优于异体重

组胚； 同体重组胚的囊胚发育率达 38.5%, 高于异体 胚的 22%；同体重组胚移植后克隆动物出生率达 23%， 高于异体胚的 5.6%。 2.3 对原始生殖细胞 （PGC） 进行基因打靶

PGC 类似于 ES 细胞， 具有发育全能性。 PGC 介 导的转基因技术在原理和方法上与 ES 细胞技术相 似， 应用 PGC 技术在制作转基因家禽方面有特别明 显的优势。

Brinster and Avarbock (1994) 尝试了在雄性哺 乳动物个体之间转移精原细胞的可行性，研究者将 设计好的 ZFlacZ 系供体小鼠的 PGC 植入

C57BL6伊STL  杂交一代小鼠的曲精细管，经移植后 的 PGC 能够发育成具有受精能力的精子细胞， 并产

生了后代。Mueller

(1999) 报道从转基因猪分 离和培养出的 PGC 能用于制作嵌合体，从而证实 PGC 具有一定的嵌合能力，也显示了利用 PGC 进 行转基因猪或其它大动物的可能性。禽类至今尚未 得到 ES 细胞，其卵子和胚胎结构也不允许像哺乳 动物那样进行胚胎克隆以生产转基因动物。但目前 已经分离培养了多种禽类的 PGC ， 并且可以把 PGC 移植入发育中的胚胎的原始生殖腺并制作嵌合体禽 类 (Naito

1994) 。van de Lavoir (2006) 将

基因打靶的携带能表达绿色荧光蛋白基因的 PGC 注入孵化 3d 发育至 13~15 期的鸡胚内，获得 8 只

公雏，成长后与母鸡交配产生 7 只生殖腺有转入外 源基因和带有绿色荧光的转基因雏鸡。这一成功为 今后进行禽类的定点转基因提供了示范。

3 外源目的基因的表达和调控

早期的研究中， 外源基因在转入动物基因组中， 表现出有或无的表达模式，对外源基因的表达无法 进行精细的调控， 如只在某一组织和发育阶段表达， 其表达水平也无法控制。外源基因的时空和可控表 达， 一直是人们希望解决的问题。 3.1 目的基因的时空表达

基因的时空表达，即是按特定的时间在特定的 组织器官中进行基因表达或抑制、终止基因表达。

Gu (1994) 首先提出的了 系统。它包 括 Cre 重组酶和 loxP 由两个 13

bp 的反向重复顺序和 8bp 的间隔区域构成, Cre 重 组酶可介导 34bp 的重复单元，切除或置换 2 个

位点之间的 DNA 片段，保留 1 个 位点

(MacColl 1999) 。因此在构建打靶载体时，

将 标记基因两侧加上相同方向排列的 序列， 然后

对动物进行基因打靶并制备转基因小鼠。而同时再

另外制备一个转入 Cre 重组酶基因的小鼠。将 2 种 转基因小鼠交配即可产生同时转入 2 种外源基因的 小鼠。给 Cre 重组酶基因选择适当的组织特异性启 动子，并使 Cre 重组酶基因与类固醇激素受体的配 体结合部位融合，使表达的杂合 Cre 重组酶只有在 与类固醇激素或药物结合时才能被激活。选择在需 要的时间对以上生成的同时具备 2 种外源基因的小 鼠施用外源类固醇药物如它莫西芬，就可以激活 Cre 重组酶并切除基因组中 2个 位点之间的基 因， 使该目的基因不被表达 (Metzgerand Feil, 1999; Metzger and Chambon, 2001) 。这种在动物个体出生 后按时间需要进行基因在某个特定组织器官的局部 敲除的转基因策略，特别适用于研究一些胚胎期必 需的、丧失功能致死的基因的功能和广泛表达的基 因在某一特定组织中的功能 (Li

2000) 。相反，

如果在一个功能基因中间插入 2 个 位点破坏

该基因，然后在某个时间通过药物诱导激活 Cre 重

组酶， 切除 2 个

位点之间的片段并使目的基因

重新修复恢复功能，有可能使目的基因重新开始表 达，从而实现基因表达的时空调控 (Ventura

,

2004;Yu 2006) 。 3.2 目的基因的可控表达

目前所制备的转基因动物，外源目的基因的表 达水平都呈现有或无的表达，其表达水平无法进行 控制。在基因治疗方面, 外源目的基因的表达调控研 究技术有可能为今后转基因动物中控制目的基因的 表达提供借鉴。该种调控技术是通过一个中介药物

拉巴霉素 （rapamycin ） 实现的。该药物分子的 2 个位 点能够分别与 2 个细胞内多肽 FKBP12 和 FRAP 结

合。因此分别将 FKBP12 与拉巴霉素的结合序列与 锌指蛋白 ZFBP 融合成为结合元件，将 FRAP 与拉 巴霉素的结合序列与转录激活因子 NF­资B  p65 融 合成为转录元件。结合元件与目的基因的转录调控

zinc finger 位点结合后， 在拉巴霉素的作用下， 转录 元件与结合元件构成三聚体并靠近目的基因，从而 启动目的基因的转录。根据药物拉巴霉素的使用浓 度， 就可以调控转入外源基因的表达水平 (MacColl

1999) 。

为了简化转基因操作的复杂性，也可以将转录

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农 业 生 物 技 术 学 报 2008 年

激活体系的 2 套嵌合蛋白组装在 1 个转基因载体 上，

2 个嵌合蛋白的基因序列中间加上 1 个核糖体 进入位点序列，同时为了提高外源目的基因的表达 对药物浓度的反应灵敏度，也可以在同一个结合或

转录元件中增加结合拉巴霉素的 FKBP12 和 FRAP 的拷贝数 (Natesan

1999) 。因此如果参照以上

转基因时空表达的做法，选择适当的启动子装配于 目的基因的转录激活体系上，将携带此外源基因的 动物与另一携带或转入外源目的基因的动物通过适 当的交配或育种程序，就可以获得携带 2 套基因的 转基因动物。因此需要在某种组织内（依启动子而 定）在特定的时间某一特定水平上表达外源目的基 因时，只需对这样的动物注射一定剂量的拉巴霉素 即可实现。

4 转入干扰基因进行RNA 干扰(RNAi)调控

基因沉默是指生物体中特定基因由于种种原因

不能表达， 是基因表达调控的一种重要方式。 在动物 转基因研究中，一般容易将外源基因转入体内或基 因组内，但不容易把体内或基因组内已存在的基因 去掉， 除非采用难度较大的基因敲除技术。 然而基因 敲除是不可逆的，

基因被敲除后就不能再被恢复。 利 用近年发展的 RNAi 技术，则可以通过抑制内源基 因的表达或 mRNA 的降解， 特异地、 部分地和可逆 地使目的基因表达下调沉默，从而实现抑制基因调 控的时空性和可逆性。

对动物组织或细胞导入能够与自身基因匹配和 长度为 21 个核苷酸的外源双链小分子 RNA ，即可 以干扰自身基因的表达或促进其 mRNA 的降解， 并 使动物表现出基因功能丧失的性状改变 (陈忠斌, 2004) 。如对斑马鱼的受精卵注入 基因的 干扰小分子双链 RNA ，就可以干扰

的表

达并降低其 mRNA 水平, 最后解除对肌肉组织发育 和生长的抑制作用，产生肌肉特别发达的斑马鱼

(Acosta , 2005) 。这种注射的干扰小分子 RNA

虽然可以持续发挥作用并且有可能延续到子代动 物， 但并不会被整合到基因组，

因此不会遗传。 Dann (2006) 利用携带由生殖细胞表达、 正常生殖力 所需的

基因片段的慢病毒载体，

注入大鼠受精 卵制备了转基因仔鼠， 仔鼠表达了

基因片段的

参 考 文 献

Acosta J, Carpio Y, Borroto I, Gonz 佗lez O and Estrada M P. Myostatin gene silenced by RNAi show a zebrafish giant phe­

shRNA ， 后者使睾丸内 Dazl 蛋白量大大降低， 也使 仔鼠表现出不育，而且发现这种转基因的 RNA 干

扰效应至少能够遗传至第 3 代仔鼠。

根据上述转基因的时空表达技术，利用 系统， 结合 RNA 聚合酶启动子序列和某一 特定基因的前后互补序列，已经开发出时空 RNA

干扰技术(Ventura , 2004;Yu 2006) 。 然而 这一技术由于基于基因操作，还不是可逆的 RNA

干扰技术。要使 RNA 干扰能够随时打开或关闭， 只 能通过控制干扰基因的转录实现。Kistner

(1996) 发展了一个能被四环素激活的转录因子 （tTA ） 的转基因载体并转入小鼠， 使之在转基因鼠 中表达转录因子，该转录因子仅在四环素存在时才 能被激活并与启动子结合，然后启动下游目的基因

的转录。 Dickins  2007） 则将启动子四环素反应 元件(tetracyclinresponse element, TRE) 的与 RNA 干 扰基因结合并将基因转入小鼠中，然后该小鼠与含 有 tTA 的转基因小鼠杂交，

制备同时含有 2 套元件 的转基因小鼠。 当对这些小鼠给予四环素药物时， 就 可以通过激活 tTA 系统，再激活 TRE 来启动 RNA 干扰； 当撤除四环素时， 则可以停止 RNA 干扰， 实 现 RNA 干扰的可逆调控。

因此利用 RNAi 制作降低 或抑制某些基因或性状的转基因动物，将是一种非 常奇妙和有前景的领域。

5 展望

目前动物转基因技术发展迅速，转基因的成功 效率和对转入外源基因的调控能力不断提高。把基 因打靶技术和体细胞克隆技术结合起来，为转基因 动物的制备提供了一个良好的平台。通过进一步发 展克隆技术特别是动物胚胎干细胞分离，可以进一 步提高克隆动物制备和转基因技术的效率。通过发 展基因打靶技术，则可以完善外源基因的表达调控 实现时空和可控表达，而将基因打靶与 RNA 干扰 结合转基因技术，为获得对于特定基因进行表达的 可控、 可逆等精细调控提供了新的途径。可以预见， 通过灵活应用的各种生物技术，在不远的将来即能 发展出更新、效率更高和更加方便快捷的转基因技 术， 用于制备新颖的转基因动物， 更好地应用于动物 新品种培育、 医学疾病模型研究和生物制药等领域。

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动物转基因技术研究新进展

施振旦 1 *，李万利 1，张永亮 1，陈学进 2

(1. 华南农业大学动物科学学院， 2. 上海交通大学医学院附属新华医院发育生物学实验室， 广州 510642； 上海 200092)

摘要：动物转基因的关键限制因素是制备效率和基因表达的精确调控。综述了近年发展的提高转基因效率的非定点整合 调控外源基因表达的时空 转基因方法， 如睾丸转基因法和卵巢转基因法； 提高转基因精确性的定点整合转基因的基因打靶法； 通过转基因对特定基因的进行表达时空和可逆的 RNA 干扰灵活精细调控。 对这些新的转基因方 表达和可控表达转基因策略；

法的优缺点进行了讨论， 并探讨如何利用这些方法进行转基因动物的制备。

效率； 时空表达； 可控表达； RNA 干扰 关键词：转基因方法； S188 文献标识码： A 中图分类号：

1006­1304(2008)01­0163­06 文章编号：

An Update on the Development of Techniques for Producing Transgenic Animals

1 1 1 2

SHI Zhen­dan *,LI Wan­li , ZHANG Yong­liang , CHEN Xue­jin

Efficiency and specificity are key limiting factors on preparation of transgenic animals. This review describes the re­

cently developed animal gene transfer techniques, including gene transfer into the testis and ovary for easily making non­sitespecific methods;gene targeting in embryonic stem cells, somatic cells and primordial germ cells for site specific methods;and site­and time­ specific gene targeting and controlled expression of transferred genes. In addition, methods of utilizing newly developed RNA inter­ ference, combined with the above gene expression controlling techniques, to produce transgenic animals to pGEX­PR 和 pET­PR­S and reversibly knock down specific genes are also discussed. The merits and disadvantages for each method are also discussed, as well as potentials of using these methods to develop transgenic animals for breeding of new animal lines, studying of disease models and production of therapeutic

medicines.

gene transfer method;efficiency;spatio­temporalexpression;inducible expression;RNA interference

动物转基因技术是将外源基因移入动物细胞并

整合到基因组中，从而使其得以表达。自从 Berg

如何利用这些技术更好地服务于动物新品种培育、 医学疾病模型研究、 生物制药等领域。

and Eckardt (1970)创立 DNA 重组技术、 Jaenisch and Mintz (1974) 首次利用反转录病毒感染胚胎的方法 进行动物转基因以来，动物转基因技术得到不断完

电穿孔、 善和发展。 利用逆转录病毒介导、 显微注射、 制备了小鼠、 脂质体介导、 精子载体等转基因方法， 大鼠、 兔、 猪、 绵羊、 山羊、 鸡、 蛙、 鱼类等多种转基因 动物。而近几年来动物转基因的方法和转基因的内 涵又有了新进展，包括通过简便的性腺注射介导的 转入 RNA 干扰基因、 转基因、 基因打靶结合克隆的 定点整合转基因和基因的条件表达转基因技术等， 本文对这些新近发展的技术作详细的介绍，并探讨

2007­05­15 收稿日期：

2007­06­13 接受日期：

1 性腺转基因方法

早期的动物转基因研究中，大量应用了利用逆

精子 转录病毒介导、 显微注射、 电穿孔、 脂质体介导、

1996；陈永福， 载体法等方法（魏平华和陈清轩，

2002）， 这些方法需要复杂的操作仪器和胚胎体外培 养等复杂的实验过程，同时获得转基因动物的效率 很低， 一般不到 10%。

Kim 根据精子作为外源基因载体转

基因的原理，及一般细胞都能够吸收外源 DNA 的 把外源基因用脂质体转染精原细胞， 再将被转原理，

*通讯作者。Author for correspondence. 教授, 主要从事动物分子遗传与基因工程研究。E­mail:.

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农 业 生 物 技 术 学 报 2008 年

染的精原细胞微注射到精原细胞被破坏的雄性动物 的睾丸的曲精细管内，结果发现小鼠在康复后可以 产生携带外源基因的精子。如果利用这样的小鼠对 雌鼠交配，可以预期能够产生含有所转外源基因的 转基因小鼠。沈新明等 (2002) 省略了对精原细胞转 染外源基因并对曲精细胞移植转染细胞的步骤， 直 接用人巨细胞病毒启动子调控的增强型绿色荧光蛋 白表达载体注射到小鼠的曲精细管内，最后通过与 雌鼠交配，成功获得了表达绿色荧光蛋白的转基因 仔鼠。Yuan

(2005) 报道向通过向曲精细管内

注射外源 DNA ， 然后再结合对曲精细管电击或电穿 孔处理， 以使外源基因进入睾丸生精细胞。 然后将这 些处理的雄鼠与母鼠交配，得到的小鼠中有一组的 阳性检测率达 25%。Shen

则将处理方法 更为简化，首先直接向雄兔睾丸内注射携带绿色荧 光表达的外源 DNA 及二甲基亚枫的介质， 使 DNA 能够进入睾丸细胞和生精细胞。一个月后用处理的 雄兔与雌兔交配，

所产生后代的 56%仔兔能高效地 表达所导入的外源基因。这一转入外源基因的阳性 率大大高于以往精子载体法或其他非定点转基因方

法的结果。

对应于在雄性动物的向睾丸注射外源基因，

Yang (2007)直接对小鼠的卵巢注射绿色荧光

蛋白基因， 也可以得到转基因小鼠， 并且检测后代的 阳性率达 54%， 并且发现获得的 6 代以内的转基因 小鼠都具有较好的遗传稳定性。用同样的方法制作 转基因鸡的研究中， 阳性率高达 67.65%。

由于通过性腺转基因操作简便、 技术要求较低、 难度较小，这种方法将成为一个制作转基因动物的 方向， 有可能用于如猪和牛这样的大动物的转基因。 然而该方法制备转基因动物时，仍然存在外源基因 随机整合进入与宿主基因组的问题，因此目前还无 法利用此方法随意地获得理想的转基因动物。

2 定点制作转基因动物的方法

由于非定点转基因方法使外源基因随机整合到 宿主细胞染色体上，使得制作转基因动物带有很大

的偶然性， 外源基因的表达的可控性也较差。 同时由 于外源基因随机整合到宿主基因组，很可能破坏宿

主基因的正常表达， 将影响到宿主的发育和存活。 因 此新的定点整合转基因方法就应运而生了，一般通

称为基因打靶 （gene targeting ）。 2.1胚胎干细胞(ES 细胞)基因打靶方法

基因打靶是在胚胎干细胞技术和同源重组技术 基础上发展起来的可对基因组进行定点修饰的实验

技术。 基因打靶通过外源 DNA 与染色体 DNA 之间 的同源重组、精细地定点修饰和改造基因 DNA 片 段，具有位点专一性强和打靶后目的片段可以与染 色体 DNA 共同稳定遗传的特点。Thomas and

Capecchi (1987) 首先对小鼠 ES 细胞进行了基因打 靶， 然后将此打靶的 ES 细胞移植进入小鼠囊胚， 将 此重组胚移植进入代孕母鼠， 最后产出嵌合体仔鼠， 通过相互交配获得基因敲除的纯合小鼠。基因打靶

包括基因敲除 （knock out ） 和基因敲入 （knock in ） 技 术。目前利用以上技术已经制备了大量基因敲除小 鼠，在研究基因功能和疾病模型研究方面作出了贡 献。 相应地， 外源基因也可以通过基因打靶转入小鼠 基因组，并获得了通过基因敲入的转基因小鼠 (Gu

1993) ，实现了外源基因在宿主基因组的定点 整合。

2.2 对体细胞进行基因打靶

虽然 ES 细胞具有全能性，并且具有无限传代 和增殖的能力，但是由于目前尚未建立起一套有效 的完善的适用于任何物种 ES 细胞的分离和培养方 法， 到目前为止很多物种尚未得到 ES 细胞， 而体细 胞便于采集、 数量巨大， 并可以在体外增殖培养， 所 以通过对体细胞进行基因打靶，使外源性基因定点

的整合到体细胞的基因组中，再结合体细胞克隆来 生产转基因动物将是一个不错的选择。McCreath

(2000) 报道了用体细胞核移植生产出了基因打 靶绵羊。Lai

(2002) 和 Dai (2002) 报道了 用基因打靶及克隆的方法制作出了敲除 琢1,3­  糖苷

转移酶的转基因猪， Kuroiwa (2004) 通过敲除

牛朊蛋白 基因制作了无疯牛病的牛 ， 不会

发生乳房炎的奶牛 (Wall

2005) 和能够合成多 不饱和脂肪酸的猪 (Lai

2006) 也被制备到 。

体细胞基因打靶结合克隆的方法早就定型，

问 题是如何提高体细胞克隆的效率。对此，

Kuroiwa (2004) 通过对基因印记较少和较为年轻化的胎 牛成纤维细胞进行基因打靶，细胞经过克隆后构建

重组胚并移植到子宫内发育成 2.5 月龄的胎儿， 再 将此胎儿流产并再次分离出成纤维细胞，对此进行 重复打靶获得纯合型基因敲除细胞，然后再进行克

隆胚的构建和移植，

重组胚移植后怀孕 45d 的受胎 率达到 45%。此方法大大提高了基因敲除动物的制 备效率， 经过 5 次移植、 流产、

胎儿成纤维细胞分离、 基因打靶和重构胚制备的循环，

在 22 个月内生产了 按传统方法需要 6 年时间才能获得的纯合敲除

和

两个基因的牛。

一般在体细胞克隆研究中都是制备异体克隆，

第 1期 施振旦等：动物转基因技术研究新进展

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即提供细胞核的供体动物都不同于提供卵母细胞的 受体动物。异体克隆胚可能由于基因印记可能导致 核质相互作用的不协调，致使目前制备克隆动物的 效率都很低。为了解决这一问题， Yang

(2006) 把体细胞核移植入源于同一母牛的去核卵子，克隆 后激活的同体重组胚中基因重排要大大优于异体重

组胚； 同体重组胚的囊胚发育率达 38.5%, 高于异体 胚的 22%；同体重组胚移植后克隆动物出生率达 23%， 高于异体胚的 5.6%。 2.3 对原始生殖细胞 （PGC） 进行基因打靶

PGC 类似于 ES 细胞， 具有发育全能性。 PGC 介 导的转基因技术在原理和方法上与 ES 细胞技术相 似， 应用 PGC 技术在制作转基因家禽方面有特别明 显的优势。

Brinster and Avarbock (1994) 尝试了在雄性哺 乳动物个体之间转移精原细胞的可行性，研究者将 设计好的 ZFlacZ 系供体小鼠的 PGC 植入

C57BL6伊STL  杂交一代小鼠的曲精细管，经移植后 的 PGC 能够发育成具有受精能力的精子细胞， 并产

生了后代。Mueller

(1999) 报道从转基因猪分 离和培养出的 PGC 能用于制作嵌合体，从而证实 PGC 具有一定的嵌合能力，也显示了利用 PGC 进 行转基因猪或其它大动物的可能性。禽类至今尚未 得到 ES 细胞，其卵子和胚胎结构也不允许像哺乳 动物那样进行胚胎克隆以生产转基因动物。但目前 已经分离培养了多种禽类的 PGC ， 并且可以把 PGC 移植入发育中的胚胎的原始生殖腺并制作嵌合体禽 类 (Naito

1994) 。van de Lavoir (2006) 将

基因打靶的携带能表达绿色荧光蛋白基因的 PGC 注入孵化 3d 发育至 13~15 期的鸡胚内，获得 8 只

公雏，成长后与母鸡交配产生 7 只生殖腺有转入外 源基因和带有绿色荧光的转基因雏鸡。这一成功为 今后进行禽类的定点转基因提供了示范。

3 外源目的基因的表达和调控

早期的研究中， 外源基因在转入动物基因组中， 表现出有或无的表达模式，对外源基因的表达无法 进行精细的调控， 如只在某一组织和发育阶段表达， 其表达水平也无法控制。外源基因的时空和可控表 达， 一直是人们希望解决的问题。 3.1 目的基因的时空表达

基因的时空表达，即是按特定的时间在特定的 组织器官中进行基因表达或抑制、终止基因表达。

Gu (1994) 首先提出的了 系统。它包 括 Cre 重组酶和 loxP 由两个 13

bp 的反向重复顺序和 8bp 的间隔区域构成, Cre 重 组酶可介导 34bp 的重复单元，切除或置换 2 个

位点之间的 DNA 片段，保留 1 个 位点

(MacColl 1999) 。因此在构建打靶载体时，

将 标记基因两侧加上相同方向排列的 序列， 然后

对动物进行基因打靶并制备转基因小鼠。而同时再

另外制备一个转入 Cre 重组酶基因的小鼠。将 2 种 转基因小鼠交配即可产生同时转入 2 种外源基因的 小鼠。给 Cre 重组酶基因选择适当的组织特异性启 动子，并使 Cre 重组酶基因与类固醇激素受体的配 体结合部位融合，使表达的杂合 Cre 重组酶只有在 与类固醇激素或药物结合时才能被激活。选择在需 要的时间对以上生成的同时具备 2 种外源基因的小 鼠施用外源类固醇药物如它莫西芬，就可以激活 Cre 重组酶并切除基因组中 2个 位点之间的基 因， 使该目的基因不被表达 (Metzgerand Feil, 1999; Metzger and Chambon, 2001) 。这种在动物个体出生 后按时间需要进行基因在某个特定组织器官的局部 敲除的转基因策略，特别适用于研究一些胚胎期必 需的、丧失功能致死的基因的功能和广泛表达的基 因在某一特定组织中的功能 (Li

2000) 。相反，

如果在一个功能基因中间插入 2 个 位点破坏

该基因，然后在某个时间通过药物诱导激活 Cre 重

组酶， 切除 2 个

位点之间的片段并使目的基因

重新修复恢复功能，有可能使目的基因重新开始表 达，从而实现基因表达的时空调控 (Ventura

,

2004;Yu 2006) 。 3.2 目的基因的可控表达

目前所制备的转基因动物，外源目的基因的表 达水平都呈现有或无的表达，其表达水平无法进行 控制。在基因治疗方面, 外源目的基因的表达调控研 究技术有可能为今后转基因动物中控制目的基因的 表达提供借鉴。该种调控技术是通过一个中介药物

拉巴霉素 （rapamycin ） 实现的。该药物分子的 2 个位 点能够分别与 2 个细胞内多肽 FKBP12 和 FRAP 结

合。因此分别将 FKBP12 与拉巴霉素的结合序列与 锌指蛋白 ZFBP 融合成为结合元件，将 FRAP 与拉 巴霉素的结合序列与转录激活因子 NF­资B  p65 融 合成为转录元件。结合元件与目的基因的转录调控

zinc finger 位点结合后， 在拉巴霉素的作用下， 转录 元件与结合元件构成三聚体并靠近目的基因，从而 启动目的基因的转录。根据药物拉巴霉素的使用浓 度， 就可以调控转入外源基因的表达水平 (MacColl

1999) 。

为了简化转基因操作的复杂性，也可以将转录

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农 业 生 物 技 术 学 报 2008 年

激活体系的 2 套嵌合蛋白组装在 1 个转基因载体 上，

2 个嵌合蛋白的基因序列中间加上 1 个核糖体 进入位点序列，同时为了提高外源目的基因的表达 对药物浓度的反应灵敏度，也可以在同一个结合或

转录元件中增加结合拉巴霉素的 FKBP12 和 FRAP 的拷贝数 (Natesan

1999) 。因此如果参照以上

转基因时空表达的做法，选择适当的启动子装配于 目的基因的转录激活体系上，将携带此外源基因的 动物与另一携带或转入外源目的基因的动物通过适 当的交配或育种程序，就可以获得携带 2 套基因的 转基因动物。因此需要在某种组织内（依启动子而 定）在特定的时间某一特定水平上表达外源目的基 因时，只需对这样的动物注射一定剂量的拉巴霉素 即可实现。

4 转入干扰基因进行RNA 干扰(RNAi)调控

基因沉默是指生物体中特定基因由于种种原因

不能表达， 是基因表达调控的一种重要方式。 在动物 转基因研究中，一般容易将外源基因转入体内或基 因组内，但不容易把体内或基因组内已存在的基因 去掉， 除非采用难度较大的基因敲除技术。 然而基因 敲除是不可逆的，

基因被敲除后就不能再被恢复。 利 用近年发展的 RNAi 技术，则可以通过抑制内源基 因的表达或 mRNA 的降解， 特异地、 部分地和可逆 地使目的基因表达下调沉默，从而实现抑制基因调 控的时空性和可逆性。

对动物组织或细胞导入能够与自身基因匹配和 长度为 21 个核苷酸的外源双链小分子 RNA ，即可 以干扰自身基因的表达或促进其 mRNA 的降解， 并 使动物表现出基因功能丧失的性状改变 (陈忠斌, 2004) 。如对斑马鱼的受精卵注入 基因的 干扰小分子双链 RNA ，就可以干扰

的表

达并降低其 mRNA 水平, 最后解除对肌肉组织发育 和生长的抑制作用，产生肌肉特别发达的斑马鱼

(Acosta , 2005) 。这种注射的干扰小分子 RNA

虽然可以持续发挥作用并且有可能延续到子代动 物， 但并不会被整合到基因组，

因此不会遗传。 Dann (2006) 利用携带由生殖细胞表达、 正常生殖力 所需的

基因片段的慢病毒载体，

注入大鼠受精 卵制备了转基因仔鼠， 仔鼠表达了

基因片段的

参 考 文 献

Acosta J, Carpio Y, Borroto I, Gonz 佗lez O and Estrada M P. Myostatin gene silenced by RNAi show a zebrafish giant phe­

shRNA ， 后者使睾丸内 Dazl 蛋白量大大降低， 也使 仔鼠表现出不育，而且发现这种转基因的 RNA 干

扰效应至少能够遗传至第 3 代仔鼠。

根据上述转基因的时空表达技术，利用 系统， 结合 RNA 聚合酶启动子序列和某一 特定基因的前后互补序列，已经开发出时空 RNA

干扰技术(Ventura , 2004;Yu 2006) 。 然而 这一技术由于基于基因操作，还不是可逆的 RNA

干扰技术。要使 RNA 干扰能够随时打开或关闭， 只 能通过控制干扰基因的转录实现。Kistner

(1996) 发展了一个能被四环素激活的转录因子 （tTA ） 的转基因载体并转入小鼠， 使之在转基因鼠 中表达转录因子，该转录因子仅在四环素存在时才 能被激活并与启动子结合，然后启动下游目的基因

的转录。 Dickins  2007） 则将启动子四环素反应 元件(tetracyclinresponse element, TRE) 的与 RNA 干 扰基因结合并将基因转入小鼠中，然后该小鼠与含 有 tTA 的转基因小鼠杂交，

制备同时含有 2 套元件 的转基因小鼠。 当对这些小鼠给予四环素药物时， 就 可以通过激活 tTA 系统，再激活 TRE 来启动 RNA 干扰； 当撤除四环素时， 则可以停止 RNA 干扰， 实 现 RNA 干扰的可逆调控。

因此利用 RNAi 制作降低 或抑制某些基因或性状的转基因动物，将是一种非 常奇妙和有前景的领域。

5 展望

目前动物转基因技术发展迅速，转基因的成功 效率和对转入外源基因的调控能力不断提高。把基 因打靶技术和体细胞克隆技术结合起来，为转基因 动物的制备提供了一个良好的平台。通过进一步发 展克隆技术特别是动物胚胎干细胞分离，可以进一 步提高克隆动物制备和转基因技术的效率。通过发 展基因打靶技术，则可以完善外源基因的表达调控 实现时空和可控表达，而将基因打靶与 RNA 干扰 结合转基因技术，为获得对于特定基因进行表达的 可控、 可逆等精细调控提供了新的途径。可以预见， 通过灵活应用的各种生物技术，在不远的将来即能 发展出更新、效率更高和更加方便快捷的转基因技 术， 用于制备新颖的转基因动物， 更好地应用于动物 新品种培育、 医学疾病模型研究和生物制药等领域。

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