微量凯氏定氮法测定蛋白质含量

微量凯氏定氮法测定蛋白质含量

姓名：葛照硕

【摘要】蛋白质（protein）是生命的物质基础，是构成细胞的基本有机物，是生命活动的主要承担者。没有蛋白质就没有生命。蛋白质是食品中重要的营养指标。各种不同的食品中蛋白质的含量各不相同，一般说动物性食品的蛋白质含量高于植物性食品，测定食品中蛋白质的含量，对于评价食品的营养价值、合理开发利用食品资源、提高产品质量、优化食品配方、指导经济核算及生产过程控制均具有极重要的意义。

本实验采用微量凯氏定氮法测定蛋白质含量。

【关键词】微量凯氏定氮法 微量凯氏定氮仪 蛋白质含量

一、 前言

1、蛋白质含量测量方法

从查阅的资料来看，目前测定蛋白质含量常用的方法有凯氏定氮法、双缩脲法(Biuret)、紫外吸收法、考马斯亮蓝法（ Bradford）、Folin酚试剂法。 凯氏定氮法

蛋白质是含氮的有机化合物。食品与硫酸和催化剂一同加热消化，使蛋白质分解，分解的氨与硫酸结合生成硫酸铵。然后碱化蒸馏使氨游离，用硼酸吸收后再以硫酸或盐酸标准溶液滴定，根据酸的消耗量乘以换算系数，即为蛋白质含量。

天然有机物的含氮量常用微量凯氏定氮法来测定。生物材料的含氮化合物分析测定主要是指蛋白质，核酸的含量通常是用定磷法或别的方法测定。蛋白质的含氮量几乎是恒定的，约在15~16 %之间。由于蛋白质含氮量比较恒定，可由其氮量计算蛋白质含量，故此法是经典的蛋白质定量方法。 双缩脲法(Biuret)

双缩脲(NH3CONHCONH3 ) 是两个分子脲经180 ℃左右加热,放出一个分子氨后得到的产物。在强碱性溶液中,双缩脲与CuSO4 形成紫色络合物,称为双缩脲反应。凡具有两个酰胺基或两个直接连接的肽键,或能够以一个中间碳原子相连的肽键,这类化合物都有双缩脲反应。紫色络合物颜色的深浅与蛋白质浓度成正比,而与蛋白质分子量及氨基酸成分无关,故可用来测定蛋白质含量。 Folin酚试剂法

Folin-酚试剂法测定蛋白质含量是双缩脲法的发民，所用的试剂是由两部分组成的。第一部分相当于双缩脲试剂，第二部分为Folin-酚试剂(磷钨酸和磷钼酸混合液)。因此，反应的程序也是分两步进行的。第一步相当于双缩脲反应，在碱性条件下蛋白质中的肽键与Cu2+作用生成络合物；第二步是基于Folin试剂(磷钼酸和磷钨酸试剂)在碱性条件下极不稳定，易被酚类化合物还原生成钼蓝和钨

蓝混合物 (呈蓝色反应)。由于蛋白质中含有带酚羟基的酪氨酸，故有此呈色反应。而且溶液颜色的深浅与蛋白质的含量成正比关系。此法也适用于测定酪氨酸和色氨酸的含量。本法可测定范围是25—250μg 考马斯亮蓝法（ Bradford）

Bradford 法是根据蛋白质与染料相结合的原理设计的。考马斯亮蓝是一种有机染料，在游离状态下呈红色，在稀酸溶液中与蛋白质的碱性氨基酸（ 特别是精氨酸）和芳香族氨基酸残基结合后变为蓝色，其最大吸收波长从465 nm 变为595 nm, 蛋白质在1～1 000 μg 范围内, 蛋白质－色素结合物在595 nm波长下的吸光度与蛋白质含量成正比,故可用于蛋白质的定量测定。 紫外吸收法

蛋白质分子中,酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸残基的苯环含有共轭双键,使蛋白质具有吸收紫外光的性质,吸收峰在280nm 处,其吸光度(即光密度值) 与蛋白质含量成正比。此外,蛋白质溶液在238nm 的光吸收值与肽键含量成正比。利用一定波长下,蛋白质溶液的光吸收值与蛋白质浓度的正比关系,可以进行蛋白质含量的测定。

2、凯氏定氮仪

凯氏定氮仪是根据蛋白质中氮的含量恒定的原理，通过测定样品中氮的含量从而计算蛋白质含量的仪器。因其蛋白质含量测量计算的方法叫做凯氏定氮法，故被称为凯氏定氮仪，又名定氮仪、蛋白质测定仪、粗蛋白测定仪。

图1 改良式凯氏定氮仪

1,2,3 弹簧夹，4 加样漏斗，5 进气口，6 反应室，7 夹套，8 冷凝管，9 出水

口，10 进水口

二、 实验目的

1、学习微量凯氏定氮法的原理。

2

、掌握微量凯氏定氮法的操作技术（未知样品的消化、蒸馏、滴定及其含氮量

的计算等）。

三、 实验原理

当被测的天然含氮有机物与浓硫酸共热时，其中的碳、氢元素转变成CO2和H2O，而氮元素转变成氨，并进一步与硫酸反应生成硫酸铵，此过程称为“消化”。消化时分解反应进行得很慢，需要加入硫酸钾以提高沸点（可由290℃提高到400℃），加入硫酸铜作为催化剂（其他氧化剂如H2O2也可）。消化完成后，在凯氏定氮仪中加入强碱碱化消化液，使硫酸铵分解放出氨。用水蒸气蒸馏法，将氨蒸入过量标准无机酸（硼酸）溶液中，然后用标准盐酸溶液进行滴定，从而计算出含氮量。以甘氨酸为例，该过程的化学反应如下：

本法适用范围为0.2~1.0 mg氮，相对误差小于±2%。

四、 实验材料与试剂

（1）实验材料：

食用面粉 （2）实验试剂：

浓硫酸

30%氢氧化钠溶液 克氏催化剂 2%硼酸 指示剂 0.01M HCL （3）器材：

改良式微量凯氏定氮仪 消化炉 消化管 铁架台 电子天平 50 ml容量瓶

锥形瓶 表面皿 移液管 量筒

酸式滴定管 酒精灯

五、 操作步骤与现象

消化：

准确称取1克食用面粉，用称量纸卷好小心送入至50毫升的凯氏烧瓶底部，切勿沾于瓶口或瓶颈上。向另一烧瓶加入1ml水作空白对照。

在每个烧瓶内加入硫酸钾—硫酸铜混合物（克氏催化剂）少许，浓硫酸10ml，小瓷片两粒，摇匀。将烧瓶约60度角固定在铁架上，每个瓶口放一小漏斗，在通风厨内的电炉上消化。

在消化开始时，应控制火力，不要使液体冲到瓶颈。待瓶内水汽蒸完，硫酸开始分解并放出SO2白烟后，适当加强火力，继续消化，直至消化液呈透明绿色为止。消化完毕，待烧瓶内容物冷却后，加蒸馏水10ml（注意慢加，边加边摇）。冷却后将瓶内容物转入100ml的容量瓶中，并用蒸馏水洗烧瓶数次，溶液一并倒入容量瓶，最后定容至刻度摇匀，做上记号备用。 蒸馏：

洗涤仪器，蒸馏器洗净后，开放水龙头P3，使水进入A室，水放至A

室球

部即可。取3个50ml的锥形瓶，各准确加入10ml硼酸（内加有混合指示剂）。用表面皿复盖备用。

加样：用吸量管吸取1ml消化液，细心地由漏斗D倾入蒸馏室，再用蒸馏水1毫升清洗漏斗。取一个盛有硼酸—混合指示剂的锥形瓶，置于M管下，使管口恰好接触硼酸溶液，用量筒从漏斗D加入30%氢氧化钠5ml，随即将P4夹紧，并往漏斗加入少量蒸馏水封闭。

蒸馏：用酒精灯加热（应用挡风板将灯围拢，维持火力恒定，沸腾不可高于Y管口以免A室溶液从Y管倒吸，待第一滴蒸馏液从冷凝柱F顶端滴下时起，继续蒸3-5分钟，然后将锥形瓶放低，使导管离开液面再蒸2分钟，最后用蒸馏水洗导管外壁，蒸馏完毕，取下锥形瓶，随即将蒸馏器洗净。）

样品及空白蒸馏：用吸量管分别吸取1ml样品和1ml空白按上述操作步骤进行蒸馏。 滴定：

蒸馏完毕，用微量酸式滴定管，以0.01mol/L 盐酸标准溶液进行滴定锥瓶内溶液，溶液由蓝绿色变为淡紫色或灰色，即为终点。记录所用盐酸的量。

六、 注意事项

（1）本法适用于0.05-3.0mg氮，样品中含氮量过高时，则应减少取样量或将样液稀释。 （2）勿使样品粘于烧瓶颈部。放置液体样品时，需将吸管插至烧瓶底部再放样：如固体样品，可将样品卷在纸内，平插入烧瓶底部，然后再将烧瓶直起，纸卷内的样品即完全放在烧瓶底部。

（3）消化之前检查凯氏定氮仪的气密性良好，后用蒸馏水清洗凯氏定氮仪，要充分清洗。

（4）消化过程中，消化的时间应该充分，确保消化完全，消化至溶液呈现透明的浅蓝色；加碱液后要迅速关闭进样口，防止反应放出的氨气逸出；火焰的温度要适当，太小加热过慢，太大容易导致溶液暴沸甚至从进气口溢出；用硼酸封住蒸馏管口，防止氨气逸出；加热应保持均衡，冷凝水流速控制均衡，防止出现倒吸。

（5）消化后要将液体充分冷却，定容到容量瓶中备用。

（6）收集完氨气后，应用蒸馏水将蒸馏管口清洗，以收集在管壁残余的氨气。 （7）蒸馏完毕，先将蒸馏出口离开液面，继续蒸馏1min，将附着在尖端的吸收液完全洗入吸收瓶内，再将吸收瓶移开，最后移开酒精灯，绝不能先灭灯，否则吸收液将发生倒吸。

（8）滴定的时候，要控制滴定的速度由快到慢，准确判断滴定终点。

（9）硼酸吸收液的温度不应超过40°C，否则氨吸收减弱，造成损失，可置于冷水浴中。

（10）混合指示剂在碱性溶液中呈兰绿色，在中性溶液中呈灰色，在酸性溶液中呈红色。

七、 数据处理

计算：

（A(B)0.010014 样品的总氮含量(克氮%)100

C1000

若测定的样品含氮量部分只是蛋白质则：

(AB)0.0100146.25

100样品的总蛋白含量（克蛋白%）=

C1000

A为滴定样品用去的盐酸平均毫升数； B为滴定空白用去的盐酸平均毫升数；

C为称量样品的克数：0.0100为盐酸的当量浓度（实际上，此项应按实验中使用盐酸的实际浓度填写）； 14为氮的原子量；

6.25为常数（1毫升0.1N盐酸相当于0.14毫克氮）。 实验数据：

两次滴定中V的平均值是12.10mL，代入计算公式： 总氮量=15.82%

八、 分析与思考

1、写出一下各步的化学反应方程式:

蛋白质的消化： 含氮有机物+HSOCO+SO+HO+NH

24 2223

氨的蒸馏： (NH4)2SO42NaOHNa2SO42NH4OH 

NHOHHONH342

氨的滴定： NH3H3BO3NH4H2BO3NH4H2BO3HCLNH4CLH3BO3

2、分析凯氏定氮法测定样品蛋白质含量时误差的原因

答：凯氏定氮仪测定蛋白质含量的误差来源可能是样品、催化剂种类和用量、消化的时间、加碱液后的操作、蒸馏加热、清洗凯氏定氮仪的过程、凯氏定氮仪的

气密性、氨气是否完全蒸馏出来；硼酸是否封住蒸馏管口、试剂的准确性、滴定终点的判断、滴定盐酸的浓度准确性等。

九、 参考文献及致谢

感谢组员刘振宇的默契配合，老师的详细授课及助教的帮助。 参考文献：

（1）道客巴巴 《实验八——凯氏定氮法》ppt （2）《生物化学实验》上海交通大学出版社 主编:丛峰松 （3）老师的ppt

微量凯氏定氮法测定蛋白质含量

姓名：葛照硕

【摘要】蛋白质（protein）是生命的物质基础，是构成细胞的基本有机物，是生命活动的主要承担者。没有蛋白质就没有生命。蛋白质是食品中重要的营养指标。各种不同的食品中蛋白质的含量各不相同，一般说动物性食品的蛋白质含量高于植物性食品，测定食品中蛋白质的含量，对于评价食品的营养价值、合理开发利用食品资源、提高产品质量、优化食品配方、指导经济核算及生产过程控制均具有极重要的意义。

本实验采用微量凯氏定氮法测定蛋白质含量。

【关键词】微量凯氏定氮法 微量凯氏定氮仪 蛋白质含量

一、 前言

1、蛋白质含量测量方法

从查阅的资料来看，目前测定蛋白质含量常用的方法有凯氏定氮法、双缩脲法(Biuret)、紫外吸收法、考马斯亮蓝法（ Bradford）、Folin酚试剂法。 凯氏定氮法

蛋白质是含氮的有机化合物。食品与硫酸和催化剂一同加热消化，使蛋白质分解，分解的氨与硫酸结合生成硫酸铵。然后碱化蒸馏使氨游离，用硼酸吸收后再以硫酸或盐酸标准溶液滴定，根据酸的消耗量乘以换算系数，即为蛋白质含量。

天然有机物的含氮量常用微量凯氏定氮法来测定。生物材料的含氮化合物分析测定主要是指蛋白质，核酸的含量通常是用定磷法或别的方法测定。蛋白质的含氮量几乎是恒定的，约在15~16 %之间。由于蛋白质含氮量比较恒定，可由其氮量计算蛋白质含量，故此法是经典的蛋白质定量方法。 双缩脲法(Biuret)

双缩脲(NH3CONHCONH3 ) 是两个分子脲经180 ℃左右加热,放出一个分子氨后得到的产物。在强碱性溶液中,双缩脲与CuSO4 形成紫色络合物,称为双缩脲反应。凡具有两个酰胺基或两个直接连接的肽键,或能够以一个中间碳原子相连的肽键,这类化合物都有双缩脲反应。紫色络合物颜色的深浅与蛋白质浓度成正比,而与蛋白质分子量及氨基酸成分无关,故可用来测定蛋白质含量。 Folin酚试剂法

Folin-酚试剂法测定蛋白质含量是双缩脲法的发民，所用的试剂是由两部分组成的。第一部分相当于双缩脲试剂，第二部分为Folin-酚试剂(磷钨酸和磷钼酸混合液)。因此，反应的程序也是分两步进行的。第一步相当于双缩脲反应，在碱性条件下蛋白质中的肽键与Cu2+作用生成络合物；第二步是基于Folin试剂(磷钼酸和磷钨酸试剂)在碱性条件下极不稳定，易被酚类化合物还原生成钼蓝和钨

蓝混合物 (呈蓝色反应)。由于蛋白质中含有带酚羟基的酪氨酸，故有此呈色反应。而且溶液颜色的深浅与蛋白质的含量成正比关系。此法也适用于测定酪氨酸和色氨酸的含量。本法可测定范围是25—250μg 考马斯亮蓝法（ Bradford）

Bradford 法是根据蛋白质与染料相结合的原理设计的。考马斯亮蓝是一种有机染料，在游离状态下呈红色，在稀酸溶液中与蛋白质的碱性氨基酸（ 特别是精氨酸）和芳香族氨基酸残基结合后变为蓝色，其最大吸收波长从465 nm 变为595 nm, 蛋白质在1～1 000 μg 范围内, 蛋白质－色素结合物在595 nm波长下的吸光度与蛋白质含量成正比,故可用于蛋白质的定量测定。 紫外吸收法

蛋白质分子中,酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸残基的苯环含有共轭双键,使蛋白质具有吸收紫外光的性质,吸收峰在280nm 处,其吸光度(即光密度值) 与蛋白质含量成正比。此外,蛋白质溶液在238nm 的光吸收值与肽键含量成正比。利用一定波长下,蛋白质溶液的光吸收值与蛋白质浓度的正比关系,可以进行蛋白质含量的测定。

2、凯氏定氮仪

凯氏定氮仪是根据蛋白质中氮的含量恒定的原理，通过测定样品中氮的含量从而计算蛋白质含量的仪器。因其蛋白质含量测量计算的方法叫做凯氏定氮法，故被称为凯氏定氮仪，又名定氮仪、蛋白质测定仪、粗蛋白测定仪。

图1 改良式凯氏定氮仪

1,2,3 弹簧夹，4 加样漏斗，5 进气口，6 反应室，7 夹套，8 冷凝管，9 出水

口，10 进水口

二、 实验目的

1、学习微量凯氏定氮法的原理。

2

、掌握微量凯氏定氮法的操作技术（未知样品的消化、蒸馏、滴定及其含氮量

的计算等）。

三、 实验原理

当被测的天然含氮有机物与浓硫酸共热时，其中的碳、氢元素转变成CO2和H2O，而氮元素转变成氨，并进一步与硫酸反应生成硫酸铵，此过程称为“消化”。消化时分解反应进行得很慢，需要加入硫酸钾以提高沸点（可由290℃提高到400℃），加入硫酸铜作为催化剂（其他氧化剂如H2O2也可）。消化完成后，在凯氏定氮仪中加入强碱碱化消化液，使硫酸铵分解放出氨。用水蒸气蒸馏法，将氨蒸入过量标准无机酸（硼酸）溶液中，然后用标准盐酸溶液进行滴定，从而计算出含氮量。以甘氨酸为例，该过程的化学反应如下：

本法适用范围为0.2~1.0 mg氮，相对误差小于±2%。

四、 实验材料与试剂

（1）实验材料：

食用面粉 （2）实验试剂：

浓硫酸

30%氢氧化钠溶液 克氏催化剂 2%硼酸 指示剂 0.01M HCL （3）器材：

改良式微量凯氏定氮仪 消化炉 消化管 铁架台 电子天平 50 ml容量瓶

锥形瓶 表面皿 移液管 量筒

酸式滴定管 酒精灯

五、 操作步骤与现象

消化：

准确称取1克食用面粉，用称量纸卷好小心送入至50毫升的凯氏烧瓶底部，切勿沾于瓶口或瓶颈上。向另一烧瓶加入1ml水作空白对照。

在每个烧瓶内加入硫酸钾—硫酸铜混合物（克氏催化剂）少许，浓硫酸10ml，小瓷片两粒，摇匀。将烧瓶约60度角固定在铁架上，每个瓶口放一小漏斗，在通风厨内的电炉上消化。

在消化开始时，应控制火力，不要使液体冲到瓶颈。待瓶内水汽蒸完，硫酸开始分解并放出SO2白烟后，适当加强火力，继续消化，直至消化液呈透明绿色为止。消化完毕，待烧瓶内容物冷却后，加蒸馏水10ml（注意慢加，边加边摇）。冷却后将瓶内容物转入100ml的容量瓶中，并用蒸馏水洗烧瓶数次，溶液一并倒入容量瓶，最后定容至刻度摇匀，做上记号备用。 蒸馏：

洗涤仪器，蒸馏器洗净后，开放水龙头P3，使水进入A室，水放至A

室球

部即可。取3个50ml的锥形瓶，各准确加入10ml硼酸（内加有混合指示剂）。用表面皿复盖备用。

加样：用吸量管吸取1ml消化液，细心地由漏斗D倾入蒸馏室，再用蒸馏水1毫升清洗漏斗。取一个盛有硼酸—混合指示剂的锥形瓶，置于M管下，使管口恰好接触硼酸溶液，用量筒从漏斗D加入30%氢氧化钠5ml，随即将P4夹紧，并往漏斗加入少量蒸馏水封闭。

蒸馏：用酒精灯加热（应用挡风板将灯围拢，维持火力恒定，沸腾不可高于Y管口以免A室溶液从Y管倒吸，待第一滴蒸馏液从冷凝柱F顶端滴下时起，继续蒸3-5分钟，然后将锥形瓶放低，使导管离开液面再蒸2分钟，最后用蒸馏水洗导管外壁，蒸馏完毕，取下锥形瓶，随即将蒸馏器洗净。）

样品及空白蒸馏：用吸量管分别吸取1ml样品和1ml空白按上述操作步骤进行蒸馏。 滴定：

蒸馏完毕，用微量酸式滴定管，以0.01mol/L 盐酸标准溶液进行滴定锥瓶内溶液，溶液由蓝绿色变为淡紫色或灰色，即为终点。记录所用盐酸的量。

六、 注意事项

（1）本法适用于0.05-3.0mg氮，样品中含氮量过高时，则应减少取样量或将样液稀释。 （2）勿使样品粘于烧瓶颈部。放置液体样品时，需将吸管插至烧瓶底部再放样：如固体样品，可将样品卷在纸内，平插入烧瓶底部，然后再将烧瓶直起，纸卷内的样品即完全放在烧瓶底部。

（3）消化之前检查凯氏定氮仪的气密性良好，后用蒸馏水清洗凯氏定氮仪，要充分清洗。

（4）消化过程中，消化的时间应该充分，确保消化完全，消化至溶液呈现透明的浅蓝色；加碱液后要迅速关闭进样口，防止反应放出的氨气逸出；火焰的温度要适当，太小加热过慢，太大容易导致溶液暴沸甚至从进气口溢出；用硼酸封住蒸馏管口，防止氨气逸出；加热应保持均衡，冷凝水流速控制均衡，防止出现倒吸。

（5）消化后要将液体充分冷却，定容到容量瓶中备用。

（6）收集完氨气后，应用蒸馏水将蒸馏管口清洗，以收集在管壁残余的氨气。 （7）蒸馏完毕，先将蒸馏出口离开液面，继续蒸馏1min，将附着在尖端的吸收液完全洗入吸收瓶内，再将吸收瓶移开，最后移开酒精灯，绝不能先灭灯，否则吸收液将发生倒吸。

（8）滴定的时候，要控制滴定的速度由快到慢，准确判断滴定终点。

（9）硼酸吸收液的温度不应超过40°C，否则氨吸收减弱，造成损失，可置于冷水浴中。

（10）混合指示剂在碱性溶液中呈兰绿色，在中性溶液中呈灰色，在酸性溶液中呈红色。

七、 数据处理

计算：

（A(B)0.010014 样品的总氮含量(克氮%)100

C1000

若测定的样品含氮量部分只是蛋白质则：

(AB)0.0100146.25

100样品的总蛋白含量（克蛋白%）=

C1000

A为滴定样品用去的盐酸平均毫升数； B为滴定空白用去的盐酸平均毫升数；

C为称量样品的克数：0.0100为盐酸的当量浓度（实际上，此项应按实验中使用盐酸的实际浓度填写）； 14为氮的原子量；

6.25为常数（1毫升0.1N盐酸相当于0.14毫克氮）。 实验数据：

两次滴定中V的平均值是12.10mL，代入计算公式： 总氮量=15.82%

八、 分析与思考

1、写出一下各步的化学反应方程式:

蛋白质的消化： 含氮有机物+HSOCO+SO+HO+NH

24 2223

氨的蒸馏： (NH4)2SO42NaOHNa2SO42NH4OH 

NHOHHONH342

氨的滴定： NH3H3BO3NH4H2BO3NH4H2BO3HCLNH4CLH3BO3

2、分析凯氏定氮法测定样品蛋白质含量时误差的原因

答：凯氏定氮仪测定蛋白质含量的误差来源可能是样品、催化剂种类和用量、消化的时间、加碱液后的操作、蒸馏加热、清洗凯氏定氮仪的过程、凯氏定氮仪的

气密性、氨气是否完全蒸馏出来；硼酸是否封住蒸馏管口、试剂的准确性、滴定终点的判断、滴定盐酸的浓度准确性等。

九、 参考文献及致谢

感谢组员刘振宇的默契配合，老师的详细授课及助教的帮助。 参考文献：

（1）道客巴巴 《实验八——凯氏定氮法》ppt （2）《生物化学实验》上海交通大学出版社 主编:丛峰松 （3）老师的ppt