第26卷第2期2004年4月 西 南 农 业 大 学 学 报(自然科学版)JournalofSouthwestAgriculturalUniversity(NaturalScience)Vol.26,No.2
Apr.2004
文章编号:1000-2642(2004)02-0169-04
桑粒肩天牛幼虫肠道菌群的种类及分布
张 伟1,何正波2,邓新平1,殷幼平2
①
(1.西南农业大学重庆市昆虫学及害虫控制工程重点实验室,重庆 400716;2.重庆大学重庆大学基因工程研究中
心,重庆 400030)
摘要:对47头野外采集的桑粒肩天牛幼虫肠道进行定性与定量检测,发现了13种菌群。其中葡萄球菌属在前中肠、中中肠、后中肠和后肠中的分离率为100%,是常住菌群。链球菌属、肠杆菌属、埃希氏菌属、属在上述4个肠段都能分离到,但分离率较低。而其他菌群只能在某些肠道分离到,各个肠段菌群菌量分布不同,即后中肠
ZHANGWei1,HEZheng-bo2,DENGXin-ping1,YINYou-ping2
(1.KeyLaboratoryofEntomologyandPestControlEngineeringofChongqingMunicipality,SouthwestAgriculturalUniversity,Chongqing400716,China;2.GeneticEngineeringResearchCenter,ChongqingUniversity,Chongqing400030,China)
Abstract:ThevarietyanddistributionofthebacteriaintheintestineofAprionagermari(Hope)werequalitativelyandquantitativelystudiedfromMay1999toOctober2000.Atotalof21differenttroopsofbacteriabelongingto13generawereisolatedandidentifiedfromtheintestinalfluidof47A.germarilarvaeThecountandisolationrateofStaphyloccuscover7.63±0.21pergramgutand100%,respectively,anditwasthepredominantandindigenousflora.Theothersweresupposedtobetransientfloras.Differentgutsectionsshoweddifferentfloracompositions.Treptococcus,Enterobacter,ShigellaandBacillusweredetectedinallthefoursectionsbuttheirisolationratewaslow.Thenormalintestinalflorasinthefore-midmut,mid-midgutandhindgutofA.germarilarvaewereexamined.Thegrandmeancountofviablecellsofthefoursectionswas7.35±0.30,7.22±0.31,6.89±0.36and7.84±0.28,re2spectively.Thecountofbacteriainthehindgutwasgreaterthanthatinthemid-midgutandhind-midgut(P
天牛是鞘翅目昆虫中较大的一个类群,其幼虫大多以树木的纤维材料为食,林木、果树、桑、茶、棉、竹、麻、木建材料、家具、商品包装材料等都可以受到天牛的为害[1]。李文杰[2]等报道了全国杨树每年病虫害面积达67×106hm2,其中天牛的为害面积占50%以
上。由于天牛营钻蛀性生活,生活隐蔽,成虫寿命和
活动期长,所以防治工作难度很大。目前的主要防治方法仍是以传统的人工钩杀幼虫、砸卵、堵洞和药剂防治等。这些防治方法费时、费工,而且成本高,有的又对环境有污染。随着科技发展和社会进步,环境的
①收稿日期:2003-08-28
基金项目:重庆市科委资助项目作者简介:张 伟(1979-),男,江西九江人,西南农业大学硕士研究生,从事农药剂型加工的研究。
170
西 南 农 业 大 学 学 报 (自然科学版) 2004年4月
形态,判断菌落性质。按照可数性原则,记数相同稀释度的每个平板上的典型目标菌落,根据稀释倍数和肠道的质量计算每g肠道所含菌落数,求得其平均值,并转换成自然对数值。有关计算公式如下:
检出率(%)=(有菌虫数/检测虫数)×100%
每g肠道含菌数(cfu/g)=平均菌落数×稀释倍数×20/肠道重量
1.2.5 细菌鉴定 参照周德庆[8],Hendicks[11]方法
保护、生态平衡已日益引起人们的关注,新的害虫生
物防治方法和理论不断出现,这些先进的方法和理论的完善与发展离不开昆虫生理生化的研究[3]。昆虫肠道中存在大量的正常微生物,一般认为这些微生物(或叫正常菌群)是宿主昆虫正常生长发育所不可缺少的,它们不仅在维生素的合成、脂肪和碳水化合物的吸收与利用中起着重要作用,而且在抵御外籍菌的侵入与定植,以及在促进免疫系统的功能中也起了重要作用[4]。目前昆虫肠道正常菌群种类与分布研究较多的主要有白蚁[5]、蟑螂[6]和蝗虫[7]等。为研究天牛的消化生理,本研究以桑粒肩天牛Aprionager2mari(Hope)为材料,定性定量研究其肠道正常菌群,以更好地了解天牛消化食物的机制和天牛肠道微生态系统,为天牛的防治提供理论基础。
进行形态染色及生化试验。根据《伯杰氏细菌鉴定手
[13]册》第8版[12]及《一般细菌鉴定手册》进行鉴定。
2 结果与分析
2.1 从4～,个菌群,各菌群、菌由肠道菌群的数量统计可得:8.25±0.80。
表1 桑粒肩天牛幼虫肠道菌群检测结果
Table1 TheintestinalfloraofA.germarilarvae
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 供试昆虫 ,
饥饿1d1.1.2 美兰琼脂、麦康凯琼脂、NAC、锰营养琼脂、RogosaSL琼脂等均按周德庆[8],陈天寿[9]介绍的方法配制。1.1.3 对照菌株 大肠杆菌(Escherichiacoli)、枯草芽孢菌(Bacillussubtilis)和金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaurens),由西南农业大学资源环境学院微生物实验室提供。1.2 方法1.2.1 采样 幼虫采样时间为1999年10月至次年10月,每2月采1次样,每次8头。1.2.2 天牛的解剖 用细线将桑粒肩天牛幼虫头尾分别系紧,75%酒精浸泡3min,体表消毒,无菌条件下解剖,取出肠道。称重后加入1ml灭菌水匀浆即得肠液。
肠道的分段:参照殷幼平[10]介绍天牛的分段方法,用无菌细线分前中肠(前肠较短,归入前中肠)、中中肠、后中肠和后肠系紧,剪断,分别称重后分段装于1ml无菌水中匀浆。1.2.3 稀释接种 将匀浆液迅速以10倍梯度稀释至10-6,采用平板涂布法和平板混匀法接种。每个稀释度做3个重复,菌落计数取合适稀释度的3个重复的平均数。1.2.4 细菌培养和菌落鉴定和计数 在37℃恒温箱中培养24～72h后观察菌落生长情况。根据细菌在各种选择性培养基上的生长特性、染色特征和菌体
菌 群
flora
菌 量
count/±SE7.63±0.217.48±0.516.90±0.817.42±0.243.48±0.546.87±1.165.41±0.346.69±0.633.00±0.987.37±0.447.49±0.455.78±0.676.77±0.12
分离率
isolation/%
10034.0427.6425.5323.4019.1517.0217.0214.8912.7712.7710.648.51
葡萄球菌属(Staphylococcus)肠杆菌属(Enterobacter)链球菌属(Streptococcus)埃希氏菌属(Escherichia)纤维单孢菌属(Cellulomonas)微球菌属(Micrococcs)芽孢杆菌属(Bacillus)志贺氏菌属(Shigella)克雷伯氏菌属(Klebsiella)明串球菌属(Leuconotoc)沙雷氏菌属(Serratia)变形杆菌属(Proteus)乳杆菌属(Lactobacillus)
2.2 桑粒肩天牛幼虫肠道菌群的分布
2.2.1 桑粒肩天牛幼虫肠道菌群种类的分布 不同
肠段分离到的菌群种类不一样,前中肠的菌群种类最多,共分离到14个菌群;中中肠9个菌群;后中肠和后肠的菌群数量最少仅6个菌群,但后肠菌群的分离率较后中肠高。各菌属在各肠段检出率不同,葡萄球菌属在4个肠段的检出率为100%,链球菌属、肠杆菌属、埃希氏菌属、志贺氏菌属和芽孢杆菌属在4个肠段都能检测到,但检出率较低;明串球菌属、微球菌
第26卷第2期 张 伟等 桑粒肩天牛幼虫肠道菌群的种类及分布属和乳杆菌属在前中肠和中中肠能够检测到,但在后中肠和后肠不能检测到;而纤维单胞菌属、变形杆菌属、沙雷氏菌属、克雷伯氏菌属和酵母菌只能在前中肠检测到(详见表2)。
表2 桑粒肩天牛幼虫肠道菌群的分布(n=6)
Table2 Thedistributionoftheintestinalfloraindifferentgutsec2tionofA.germarilarvae(n=6)
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致。前中肠、中中肠、后中肠和后肠数量分别为7.06
±0.12,6.89±0.36,6.14±0.15和7.42±0.37,即后中肠
菌 属葡萄球菌属(Sta.)链球菌属(Str.)肠杆菌属(Ent.)埃希氏菌属(Esc.)芽孢杆菌属(Bac.)志贺氏菌属(Shi.)明串球菌属(Leu.)微球菌属(Mic.)乳杆菌属(Lac.)纤维单胞菌属(Cel.)变形杆菌属(Pro.)沙雷氏菌属(Ser.)克雷伯氏菌属(Kle.)
前中肠中中肠后中肠后 肠
Hindgut
3 讨论
许多天牛和食木白蚁均以木材为食,木材中纤维
素含量较高,而维生素、蛋白质等营养成份含量较低。研究表明,天牛对粗纤维的消化率为12%～57%[14],白蚁对粗纤维的消化率为65%～99%[15]。Eutick[16]研究了9,高等,低等白蚁的优势菌群,。[7],杂食性的美洲大蠊主属[6]。本研究发现桑粒肩天牛肠道优势菌群为葡萄球菌属。表明桑粒肩天牛和高等白蚁肠道微生态结构较为相似,由此可看出肠道正常菌群与昆虫的营养及消化生理有密切的关系,可能还与其行为生态上的特点有关。
肠道菌群在4个肠段的分布不是均匀的。从数量上来看:后肠>前中肠>中中肠>后中肠,且中中肠与后肠、后中肠与后肠的菌群数量之间存在着显著差异(P
Fore-midgutMid-midgutHind-midgut
++++++++++++++++++++++++
+++++++++++++++++++++----+++++------++++++++++------
注:+:检测出,-:未检测出。Note:+:detected,-:notdetected
1
2.2.2 桑粒肩天牛幼虫肠道菌群菌量的分布 桑粒
肩天牛幼虫前中肠、中中肠、后中肠和后肠的菌量分
别为7.35±0.30,7.22±0.31,6.75±0.69和7.84±0.28,即后中肠
葡萄球菌属的分布规律与整个肠道菌群基本一
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西 南 农 业 大 学 学 报 (自然科学版) 2004年4月
[7] HuntJ,CharnlyAK1Abundanceanddistributionofthe
gutfloraofthedesertlocust,SchistocercagregariaF
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Apr.2004
文章编号:1000-2642(2004)02-0169-04
桑粒肩天牛幼虫肠道菌群的种类及分布
张 伟1,何正波2,邓新平1,殷幼平2
①
(1.西南农业大学重庆市昆虫学及害虫控制工程重点实验室,重庆 400716;2.重庆大学重庆大学基因工程研究中
心,重庆 400030)
摘要:对47头野外采集的桑粒肩天牛幼虫肠道进行定性与定量检测,发现了13种菌群。其中葡萄球菌属在前中肠、中中肠、后中肠和后肠中的分离率为100%,是常住菌群。链球菌属、肠杆菌属、埃希氏菌属、属在上述4个肠段都能分离到,但分离率较低。而其他菌群只能在某些肠道分离到,各个肠段菌群菌量分布不同,即后中肠
ZHANGWei1,HEZheng-bo2,DENGXin-ping1,YINYou-ping2
(1.KeyLaboratoryofEntomologyandPestControlEngineeringofChongqingMunicipality,SouthwestAgriculturalUniversity,Chongqing400716,China;2.GeneticEngineeringResearchCenter,ChongqingUniversity,Chongqing400030,China)
Abstract:ThevarietyanddistributionofthebacteriaintheintestineofAprionagermari(Hope)werequalitativelyandquantitativelystudiedfromMay1999toOctober2000.Atotalof21differenttroopsofbacteriabelongingto13generawereisolatedandidentifiedfromtheintestinalfluidof47A.germarilarvaeThecountandisolationrateofStaphyloccuscover7.63±0.21pergramgutand100%,respectively,anditwasthepredominantandindigenousflora.Theothersweresupposedtobetransientfloras.Differentgutsectionsshoweddifferentfloracompositions.Treptococcus,Enterobacter,ShigellaandBacillusweredetectedinallthefoursectionsbuttheirisolationratewaslow.Thenormalintestinalflorasinthefore-midmut,mid-midgutandhindgutofA.germarilarvaewereexamined.Thegrandmeancountofviablecellsofthefoursectionswas7.35±0.30,7.22±0.31,6.89±0.36and7.84±0.28,re2spectively.Thecountofbacteriainthehindgutwasgreaterthanthatinthemid-midgutandhind-midgut(P
天牛是鞘翅目昆虫中较大的一个类群,其幼虫大多以树木的纤维材料为食,林木、果树、桑、茶、棉、竹、麻、木建材料、家具、商品包装材料等都可以受到天牛的为害[1]。李文杰[2]等报道了全国杨树每年病虫害面积达67×106hm2,其中天牛的为害面积占50%以
上。由于天牛营钻蛀性生活,生活隐蔽,成虫寿命和
活动期长,所以防治工作难度很大。目前的主要防治方法仍是以传统的人工钩杀幼虫、砸卵、堵洞和药剂防治等。这些防治方法费时、费工,而且成本高,有的又对环境有污染。随着科技发展和社会进步,环境的
①收稿日期:2003-08-28
基金项目:重庆市科委资助项目作者简介:张 伟(1979-),男,江西九江人,西南农业大学硕士研究生,从事农药剂型加工的研究。
170
西 南 农 业 大 学 学 报 (自然科学版) 2004年4月
形态,判断菌落性质。按照可数性原则,记数相同稀释度的每个平板上的典型目标菌落,根据稀释倍数和肠道的质量计算每g肠道所含菌落数,求得其平均值,并转换成自然对数值。有关计算公式如下:
检出率(%)=(有菌虫数/检测虫数)×100%
每g肠道含菌数(cfu/g)=平均菌落数×稀释倍数×20/肠道重量
1.2.5 细菌鉴定 参照周德庆[8],Hendicks[11]方法
保护、生态平衡已日益引起人们的关注,新的害虫生
物防治方法和理论不断出现,这些先进的方法和理论的完善与发展离不开昆虫生理生化的研究[3]。昆虫肠道中存在大量的正常微生物,一般认为这些微生物(或叫正常菌群)是宿主昆虫正常生长发育所不可缺少的,它们不仅在维生素的合成、脂肪和碳水化合物的吸收与利用中起着重要作用,而且在抵御外籍菌的侵入与定植,以及在促进免疫系统的功能中也起了重要作用[4]。目前昆虫肠道正常菌群种类与分布研究较多的主要有白蚁[5]、蟑螂[6]和蝗虫[7]等。为研究天牛的消化生理,本研究以桑粒肩天牛Aprionager2mari(Hope)为材料,定性定量研究其肠道正常菌群,以更好地了解天牛消化食物的机制和天牛肠道微生态系统,为天牛的防治提供理论基础。
进行形态染色及生化试验。根据《伯杰氏细菌鉴定手
[13]册》第8版[12]及《一般细菌鉴定手册》进行鉴定。
2 结果与分析
2.1 从4～,个菌群,各菌群、菌由肠道菌群的数量统计可得:8.25±0.80。
表1 桑粒肩天牛幼虫肠道菌群检测结果
Table1 TheintestinalfloraofA.germarilarvae
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 供试昆虫 ,
饥饿1d1.1.2 美兰琼脂、麦康凯琼脂、NAC、锰营养琼脂、RogosaSL琼脂等均按周德庆[8],陈天寿[9]介绍的方法配制。1.1.3 对照菌株 大肠杆菌(Escherichiacoli)、枯草芽孢菌(Bacillussubtilis)和金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaurens),由西南农业大学资源环境学院微生物实验室提供。1.2 方法1.2.1 采样 幼虫采样时间为1999年10月至次年10月,每2月采1次样,每次8头。1.2.2 天牛的解剖 用细线将桑粒肩天牛幼虫头尾分别系紧,75%酒精浸泡3min,体表消毒,无菌条件下解剖,取出肠道。称重后加入1ml灭菌水匀浆即得肠液。
肠道的分段:参照殷幼平[10]介绍天牛的分段方法,用无菌细线分前中肠(前肠较短,归入前中肠)、中中肠、后中肠和后肠系紧,剪断,分别称重后分段装于1ml无菌水中匀浆。1.2.3 稀释接种 将匀浆液迅速以10倍梯度稀释至10-6,采用平板涂布法和平板混匀法接种。每个稀释度做3个重复,菌落计数取合适稀释度的3个重复的平均数。1.2.4 细菌培养和菌落鉴定和计数 在37℃恒温箱中培养24～72h后观察菌落生长情况。根据细菌在各种选择性培养基上的生长特性、染色特征和菌体
菌 群
flora
菌 量
count/±SE7.63±0.217.48±0.516.90±0.817.42±0.243.48±0.546.87±1.165.41±0.346.69±0.633.00±0.987.37±0.447.49±0.455.78±0.676.77±0.12
分离率
isolation/%
10034.0427.6425.5323.4019.1517.0217.0214.8912.7712.7710.648.51
葡萄球菌属(Staphylococcus)肠杆菌属(Enterobacter)链球菌属(Streptococcus)埃希氏菌属(Escherichia)纤维单孢菌属(Cellulomonas)微球菌属(Micrococcs)芽孢杆菌属(Bacillus)志贺氏菌属(Shigella)克雷伯氏菌属(Klebsiella)明串球菌属(Leuconotoc)沙雷氏菌属(Serratia)变形杆菌属(Proteus)乳杆菌属(Lactobacillus)
2.2 桑粒肩天牛幼虫肠道菌群的分布
2.2.1 桑粒肩天牛幼虫肠道菌群种类的分布 不同
肠段分离到的菌群种类不一样,前中肠的菌群种类最多,共分离到14个菌群;中中肠9个菌群;后中肠和后肠的菌群数量最少仅6个菌群,但后肠菌群的分离率较后中肠高。各菌属在各肠段检出率不同,葡萄球菌属在4个肠段的检出率为100%,链球菌属、肠杆菌属、埃希氏菌属、志贺氏菌属和芽孢杆菌属在4个肠段都能检测到,但检出率较低;明串球菌属、微球菌
第26卷第2期 张 伟等 桑粒肩天牛幼虫肠道菌群的种类及分布属和乳杆菌属在前中肠和中中肠能够检测到,但在后中肠和后肠不能检测到;而纤维单胞菌属、变形杆菌属、沙雷氏菌属、克雷伯氏菌属和酵母菌只能在前中肠检测到(详见表2)。
表2 桑粒肩天牛幼虫肠道菌群的分布(n=6)
Table2 Thedistributionoftheintestinalfloraindifferentgutsec2tionofA.germarilarvae(n=6)
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致。前中肠、中中肠、后中肠和后肠数量分别为7.06
±0.12,6.89±0.36,6.14±0.15和7.42±0.37,即后中肠
菌 属葡萄球菌属(Sta.)链球菌属(Str.)肠杆菌属(Ent.)埃希氏菌属(Esc.)芽孢杆菌属(Bac.)志贺氏菌属(Shi.)明串球菌属(Leu.)微球菌属(Mic.)乳杆菌属(Lac.)纤维单胞菌属(Cel.)变形杆菌属(Pro.)沙雷氏菌属(Ser.)克雷伯氏菌属(Kle.)
前中肠中中肠后中肠后 肠
Hindgut
3 讨论
许多天牛和食木白蚁均以木材为食,木材中纤维
素含量较高,而维生素、蛋白质等营养成份含量较低。研究表明,天牛对粗纤维的消化率为12%～57%[14],白蚁对粗纤维的消化率为65%～99%[15]。Eutick[16]研究了9,高等,低等白蚁的优势菌群,。[7],杂食性的美洲大蠊主属[6]。本研究发现桑粒肩天牛肠道优势菌群为葡萄球菌属。表明桑粒肩天牛和高等白蚁肠道微生态结构较为相似,由此可看出肠道正常菌群与昆虫的营养及消化生理有密切的关系,可能还与其行为生态上的特点有关。
肠道菌群在4个肠段的分布不是均匀的。从数量上来看:后肠>前中肠>中中肠>后中肠,且中中肠与后肠、后中肠与后肠的菌群数量之间存在着显著差异(P
Fore-midgutMid-midgutHind-midgut
++++++++++++++++++++++++
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注:+:检测出,-:未检测出。Note:+:detected,-:notdetected
1
2.2.2 桑粒肩天牛幼虫肠道菌群菌量的分布 桑粒
肩天牛幼虫前中肠、中中肠、后中肠和后肠的菌量分
别为7.35±0.30,7.22±0.31,6.75±0.69和7.84±0.28,即后中肠
葡萄球菌属的分布规律与整个肠道菌群基本一
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西 南 农 业 大 学 学 报 (自然科学版) 2004年4月
[7] HuntJ,CharnlyAK1Abundanceanddistributionofthe
gutfloraofthedesertlocust,SchistocercagregariaF