DNA甲基化的生物学意义及其检测方法

第33卷第2期南华大学学报・医学版

2005年4月DNA甲基化的生物学意义及其检测方法

周翠兰

13

,殷宇芳

13

,张　佳,陈琳玲,肖　莉,廖端芳,李　凯

11111,2

,高汉林

1,2

(1.南华大学SNP研究所,湖南衡阳421001;2.希望城国家医学中心,加利福尼亚,美国)

摘　要:DNA甲基化是基因表达调控中一种常见而又重要的机制,参与细胞分化与增殖、生物体老

化、肿瘤发生等多种重要生命活动。文章简要叙述了DNA甲基化异常的病理学意义,分类介绍了目前主要的甲基化检测方法。希望对相关领域的研究有所助益。

关键词:甲基化;　单亲遗传病;　肿瘤;　老化;　甲基化检测中图分类号:Q786　　　文献标识码:A　　　文章编号:1672-7444(2005)02-0148-06

BiologicalImplicationsofDNAMethylation

andDNAMethylationAssays

ZHOUCui-lan,YINYu-fang,ZHANGJia,etal

(DepartmentofSNP,NanhuaUniversity,Hengyang,Hunan421001,China)

Abstract:　DNAmethylationplaysavarietyofcrucialrolesincelldivisionandproliferation,developmentandagingoflife,developmentofgeneticdiseasesrelatedtouniparentaldisomy,andcarcinogenesis.Asoneofthemajorepigeneticmechanisms,DNAemthylationanalysishasbeenoneofthefocusesinthepost-genomicera.ThispaperbrieflyintroducedthebiologicalimpactsofDNAmethylationanddiscussedthecurrentlyavailableDNAmeth2ylation-relatedassaysinmoredetail.InadditiontotheanalysisofDNAmethylationlevelofindividualgene,aglobalmethylationlevelisexpectedtobearoutineindexinindividualizedmedicineinevaluatingcancersusceptibil2ityandagingstatusinthenearfuture.

Keywords:DNAmethylation;　uniparentalgeneticdiseases;　cancinogenesis;　aging;　DNAmethylationassay

　　DNA甲基化是最常见的复制后及转录后修饰方式之一,在基因表达调控、发育调节、基因组

[1]

印迹等方面发挥重要作用。甲基化是指由DNA甲基转移酶介导,在胞嘧啶的第5位碳原子上加上一甲基基团,使之变成5-甲基胞嘧啶(5-mC)的化学修饰过程。基因组正常甲基化模式改变与

[2]

某些遗传病和肿瘤的发生密切相关。在各种疾

病的致病机制中,甲基化模式异常这一因素所起的作用各不相同。主要分为两类:(1)DNA甲基化直接造成基因失活。(2)甲基被加在突出的组蛋白尾部氨基端,使染色质构象改变,并藉此影响邻近基因的活性甚至更大范围的染色体行为。本文仅就上述第一点与相关生物学意义及甲基化检测方法予以讨论。

通讯作者:高汉林,南华大学SNP研究所,医学博士Π哲学博士,研究方向:分子遗传学.3此二位作者对本文具有相同贡献,为并列第一作者.

148

1　DNA甲基化的生物学意义

本文仅就当今医学界关注的热点:DNA甲基化与单亲遗传病、肿瘤以及老化进行了讨论。1.1　基因甲基化与单亲遗传病　单亲遗传病是

部性的高甲基化通过诱导基因突变、基因缺失

[7]

、

启动子区高甲基化导致基因表达抑制,使抑癌基因丧失功能。其中,局部性的高甲基化诱导基因突变有多方面原因:一是甲基化后的胞嘧啶更易发生内源性突变,如无酶脱氨的几率增加复

[6]

[8]

;二是

指由非孟德尔遗传方式引起的人类的遗传病。其中非孟德尔遗传方式指子代中本应包含双亲遗传信息的等位基因,丢失了一方亲本的遗传信息而仅保留了剩余一方亲本的信息。导致双亲遗传信息一方丢失的可能原因主要有以下四种:(1)父源或母源染色体缺失;(2)单亲二倍体的形成;(3)印记中心缺陷;(4)对称性移转。但非孟德尔遗传方式并非一定导致单亲遗传病的发生。事实上,染色体部分片段甚至整条染色体的单亲遗传亦非罕见现象。多数情况下,这些个体均可为正常表现型。此外,全基因组的单亲遗传,还可以造成镶嵌体的出现

[3,4]

突变后产生的T:G不易被错配修复机制识别恢

;三是其外源性突变几率增高,如对紫外线的

[9]

物理损伤更加敏感加等

[10]

,对化学致癌物的亲和力增

。

另一方面,全基因组的低甲基化可促使癌基因活化,使逆转座子的转录活性增强及基因的不稳定性增加。如去甲基化可能引起癌基因的非扩增性的过度表达

[11]

。除常见肿瘤之外,另有四类

特殊的肿瘤,即卵巢囊肿、葡萄胎、部分睾丸肿瘤和异位寄生囊肿,也与单亲遗传和DNA甲基化相关。

1.3　基因甲基化与老化　随着年龄的老化,基因

。

正常情况下存在部分与疾病相关的等位基因。其父源与母源甲基化模式不同,几乎所有与单亲遗传疾病相关的等位基因都有一些序列仅父源一方或仅母源一方发生甲基化,这些序列被称为“差异甲基化区域”。单亲遗传病发生与否,关键在于非孟德尔遗传方式是否发生在“差异甲基化区域”上。这是因为:甲基化的基因不表达或表达程度很低,因而基因的正常表达必须依赖于特定亲本(非甲基化一方)等位基因的正常表达。如果等位基因中非甲基化一方这段本来应有活性的基因片段出现异常或未能完整地遗传给子代,则会引起一系列人类疾病,并决定相关疾病的外显率、表现度,甚至遗传方式。主要代表有:贝克威思-威德曼综合征(Beckwith-WiedemannSyn2drome,BWS),普拉德威利综合征(Prader-WilliSyndrome,PWS),安格曼综合征(Angelmansyn2drome,AS)和特纳综合征(TURNER,TS)等。而等

组总体DNA甲基化水平逐渐降低。这一甲基化水平的变化,是否仅与老化有关,还是也参与老化过程中的肿瘤高发,尚有待进一步研究。不过,对基因组总体DNA甲基化水平进行监测,将可能成为未来个体化医药学中一种常用的医学指标。

2　基因甲基化的检测方法

CpG岛的局部高甲基化的出现往往早于细胞

的恶性增生,因此对DNA甲基化的检测可用于肿瘤发生的早期预测加而更加明显

[13]

[12]

;全基因组的低甲基化也伴

随癌症的发生而出现,且随着肿瘤恶性程度的增

,因此它也是诊断病情的重要指

标之一;甲基化检测还是肿瘤类型鉴别诊断的辅助手段,可用于癌症发生中的抑癌基因特异性失活的检测

[14]

。

虽然对甲基化生物学意义的认识已长达半个世纪,但对基因甲基化的相关检测方法的研究在近十年才得以重视。根据不同检测方法的原理及其发展先后,大致可分为三类:(1)将DNA降解为单核苷酸而后采用化学分析仪器如液相色谱或质谱对甲基化与非甲基化的胞嘧啶进行区分;(2)用序列特异性甲基化内切酶使DNA部份降解,通过Southern印迹区分甲基化与非甲基化的相关序列;(3)利用亚硫酸氢钠(BISULFITE)预处理DNA,直

位基因中甲基化一方出现异常并不导致单亲遗传病发生。

1.2　基因甲基化与肿瘤　基因组甲基化模式异

常(包括DNA过低甲基化和CpG岛高甲基化)与肿瘤发生一直是医学界关注热点之一。细胞周期、DNA修复、血管生成和凋亡等都涉及到相关基因的甲基化。肿瘤细胞DNA总体甲基化水平低于正常细胞,但某些特定基因(如肿瘤抑制基因)CpG岛却处于高甲基化状态

[2,5,6]

。一方面,局接通过引物延伸反应或耦联其他机制对甲基化与

149

非甲基化的胞嘧啶进行区分。

液相色谱或质谱法适用于全基因组DNA甲基化检测。此外利用不能酶切甲基化位点的限制性内切酶,分别消化处理待测基因组DNA和甲基化状态已知的对照组基因组DNA,电泳分离酶切片段,得出两张限制性内切酶图谱,通过比较待测组图谱与对照组图谱差异,也可获得全基因组甲基化状态。但这种方法较为粗略,要求两组的甲基化程度有明显的区别,假阳性较高。其余检测

方法主要用于特定DNA片段的甲基化检测。

在目前有关甲基化的研究中,以亚硫酸氢钠预处理法应用最为广泛。而亚硫酸氢钠预处理法,又可根据其区分甲基化与未甲基化的原理不同而进一步分为三亚类:主要包括亚硫酸氢钠联合限制性内切酶分析法,引物延伸反应界导的甲基化分析法(单碱基延伸,甲基化特异性PCR和实时PCR),以及亚硫酸氢钠预处理DNA的PCR产物的测序分析。各种方法的比较见表1。

表1　甲基化检测方法比较

　　　　　检测方法

1.高效液相色谱(HPLC)或质谱法

2.甲基化敏感的限制性内切酶联用Southern印迹杂交法3.亚硫酸氢钠(BISULFITE)预处理法

优缺点

灵敏;无法了解甲基化位置信息

简便,可实现高通量检测;检测位点受限,易产生假阳性

灵敏,其中部分方法可定量;易产生假阳性

　　a.亚硫酸氢钠联合限制性内切酶分析法(COBRA)

　　b.引物延伸反应介导的甲基化分析法(MS-SNuPE、MSP等)　　c.亚硫酸盐测序

　注:1类检测方法适用于基因组甲基化状态检测;2、3类检测方法适用于特定DNA片段甲基化状态检测

2.1　高效液相色谱(HPLC)法　用酸或酶将DNA

裂解为五类单核苷酸(包括5-mC)。因五类核苷

酸在极性溶液中的溶解度不同,在经过非极性的过滤柱时,出柱时间也不同,用波长260nm的紫外光测定流出液的吸收峰并定量。此法灵敏度为

[15]

碱基。此法是目前测定基因组DNA中5-mC总量最标准的方法,但不能了解甲基化的位置和状态信息且对DNA纯度要求较高。

2.2　甲基化敏感的限制性内切酶联用Southern印迹杂交法　限制性内切酶可分为对甲基敏感的限制性内切酶和对甲基不敏感的限制性内切酶两种。以对甲基敏感的限制性内切酶作用于待检DNA,未甲基化的DNA序列被酶解;甲基化的DNA虽碱基序列与限制性内切酶的识别序列一致,但因序列上存在甲基,不能被酶切。而不论DNA序列甲基化与否都能被对甲基不敏感的限制性内切酶消化。

根据上述原理,将样品DNA分为两组,分别用不同类型酶处理。用对甲基不敏感的限制性内切酶处理一组相当于平行对照。酶切处理后的产物经电泳分离后,用标记的探针对目的片段作Southern杂交。根据两组经不同处理的DNA样品杂交条带位置差异判断该位点的甲基化状态。对于部分甲基化的情况,会见到大小混杂的片断,其150

相对密度与甲基化的程度成正比。该方法较简便、成本低,可进行自动化和高通量基因检测,能通过内切酶的识别位点来反映甲基化的精确定位。但此法需要较多的样本,只能检测有限的含酶切位点的DNA甲基化状态,且有可能因为酶切反应的不完全而产生假阳性。用PCR扩增消化后的DNA模板可改良上述方法,大大增加该方法

[16]

的敏感性。该改良方法的基本原理是待检DNA分别经敏感性限制性内切酶和非敏感性限制性内切酶酶切后,根据待检甲基化位点外侧的DNA序列设计引物进行PCR扩增。用对甲基化敏感的限制性内切酶处理的一组DNA样品若扩增出含有甲基化位点的片段,则表示该组样品在相应限制性内切酶位点上存在甲基化;若不能扩增出含有甲基化位点的片段,则表示相应限制性内切酶位点上不存在甲基化。鉴于此法不能反映

[17]

出整个CpG岛甲基化状态,Liang等进一步将限制性酶切法和随机引物PCR相结合,以实现快速、高效地筛选基因组DNA甲基化异常片段,并分离与这些变化相关的特异性DNA序列。2.3　亚硫酸氢钠(BISULFITE)预处理法　采用亚硫酸盐对目标DNA进行化学修饰,为研究DNA甲基化提供了一种全新的方案。DNA经亚硫酸氢钠预处理后,非甲基化胞嘧啶转化为尿嘧啶,随

后作PCR扩增,此过程进一步将模板上的尿嘧啶转化为胸腺嘧啶;而甲基化的胞嘧啶不受亚硫酸氢钠影响,保持不变。这样DNA片段甲基化状态的差异转化为碱基序列的差异。通过区分后者就可间接判断样品中的胞嘧啶甲基化与否。有报道称靠近甲基化CpG位点的非甲基化胞嘧啶对亚硫酸氢钠敏感性较低。

[18]

2.3.1　亚硫酸氢钠联合限制性内切酶分析法　亚硫酸氢钠联合限制性内切酶分析法(com2binedbisulfiterestrictionanalysis,COBRA),是指先用亚硫酸氢钠处理DNA,然后对检测部位进行PCR扩增,再选用可切开检测位点的限制性内切酶酶切PCR产物:若其识别序列中的胞嘧啶被甲基化,因胞嘧啶保持不变,该位点仍能被限制性内切酶酶切;若未甲基化,则胞嘧啶转化成胸腺嘧

[19]

啶,该位点不再被原来的限制性内切酶识别。最后进行电泳及分析,根据电泳条带的不同位置及亮度即可检测出DNA的甲基化状态及甲基化

[19]

程度。本法能定量检测微量DNA样品特定基因位点的甲基化状态,但其定量信息的准确性取决于亚硫酸盐处理DNA样品是否完全,且甲基化分析也受限于种类不多的限制性内切酶的酶切位点。检测结果为阴性并不完全排除样品DNA中发生甲基化的可能性。2.3.2　甲基化敏感的单核苷酸引物延伸法(MS

[20]

-SNuPE)　甲基化敏感的单核苷酸引物延伸法(methylationsensitivesinglenucleotideprimerex2tension,MS-SNuPE)能检测任何序列上特定胞嘧啶的甲基化状态,且不需要克隆和测序PCR产物。该方法的原理是:DNA经亚硫酸氢钠处理后作为模板,用特殊设计的引物扩增目的片段,扩增反应会在待检甲基化位点的前一个核苷酸处终止;扩增后的DNA经纯化后分别与放射标记的dCTP或dTTP在DNA聚合酶作用下共孵育,如果待检位点是甲基化的,dCTP将会在延伸反应中掺入,反之dTTP会掺入。测定dCTP和dTTP的掺入量,即可分析出该位点的甲基化状况。引物设计和DNA的完全处理是该方法的关键。此法具有高度敏感性和特异性,只需少量的DNA样本。将甲基化敏感的单核苷酸引物延

伸法联合离子反相高效液相色谱技术,基于引物延伸产物的不同质量和疏水性,可以分辨和定量DNA的CpG位点甲基化状况。这种方法能在一个反应中同时快速检测多个位点,且不必克隆和El-Maarri等

[21]

[20]

测序PCR产物。2.3.3　甲基化特异性PCR(MSP)　甲基化特异性PCR(methylation-specificPCR,MSP)是Herman等首先提出的一种检测基因组DNA甲基化水平的常用方法。该法原理是DNA经亚硫酸氢钠处理后,非甲基化的胞嘧啶转变为尿嘧啶,而甲基化的胞嘧啶保持不变。在PCR反应时,设计两套不同的引物对:其一引物序列针对经亚硫酸氢钠处理后的甲基化DNA链设计,若用该对引物能扩增出片段,说明该检测位点发生了甲基化;另一引物针对经亚硫酸氢钠处理后的非甲基化DNA链设计,若用该对引物能扩增出片段,说明该检测位点没有甲基化。两对引物都具有很高的特异性,

[22]

与未经处理的DNA序列无互补配对。MSP作为一种高效、特异、敏感(检测灵敏度达105μg)的分子分析诊断遗传学实验方法,可检出多种甲基化作用且可用于石蜡包埋样品的分析。MSP的引物序列中必须含有一个或一个以上的CpG岛,以保证引物的特异性。引物覆盖序列中CpG岛所占比例越高,甲基化DNA检出率越高,同时引物设计应该尽可能与普通PCR的引物设计原则相符合。不足之处在于:(1)引物的选择和设计非常关键,否则易导致假阳性;(2)如果亚硫酸氢钠对DNA处理不完全,也易导致假阳性。可通过限制性内切酶酶解法检验PCR产物作进一步判[23]

断。(3)MSP法是以引物中所有CpG位点胞嘧啶均以完全甲基化为前提设计的,而事实上甲基化的CpG岛中却并非每个CpG位点都完全甲基化,所以,MSP法常常存在目标片段难扩增,或者特异性差等问题,不能反映整个CpG岛甲基化状[24]

态。

2.3.4　亚硫酸盐测序法(bisulfiteDNAsequenc2

[16]

ing)　该技术是检测基因组DNA上胞嘧啶单

[25]

核苷酸甲基化相对高效的方法,即在DNA经亚硫酸氢钠处理及扩增后,对扩增片段进行测序。利用该方法时要注意DNA应被亚硫酸氢钠充分处理,此方法通过测序可获得样品DNA中特定序列的全部甲基化信息。该技术的广泛应用,大大加深了我们对有关特定基因控制区CpG岛异常甲基化与肿瘤发生相互关系的认识。但是此方法需要大量的PCR和测序,较为繁琐、昂贵。2.3.5　亚硫酸盐降低CG含量的PCR用于脆性X染色体诊断　脆性X染色体的分子机制为位于FMR1的启动子CGG拷贝数过多及过度甲基化,

151

[26,27]

[22]

从而完全抑制此基因表达。正常情况下,CGG的数目在5～50之间。无症状个体(pre-mutation)可含有50～200拷贝。当CGG拷贝数大于200时,即为脆性X染色体患者。

脆性X染色体的诊断主要采用较费时的

[28]

Southern杂交。1999年,Panagopoulos报道了亚硫酸盐降低CG含量的PCR用于脆性X染色体诊断得PCR方法。由于亚硫酸盐能使相应区域的DNA反义链中的CCG转变为UCG,PCR反应时即成为TCG,从而使甲基化CGG重复序列的GC比

例由100%降为66%。该方法对其他疾病的诊断没有广泛性的借鉴价值,但就脆性X染色体诊断而言,则极大地简化了诊断过程。但是含超长CGG拷贝携带者及含两个正常相同CGG拷贝的

等位基因时,PCR产物都是单一条带。所以该方

[29]

法对PCR会出现假阴性。最近,Zhou等人在上述方法的基础之上,引入TCG重复序列特异性引物的三链PCR法克服了假阴性问题,从而使此方法可以替代Southern杂交,简化了脆性X染色体的诊断(见图1)

。

图1　检测FMR1上CGG重复序列甲基化状态的三链PCR法

A、在非甲基化位点上,CGG重复序列及其两侧序列(红色和蓝色)上的C在亚硫酸氢钠的作用下转化成U,U在随后的PCR过程中

被替换成T。B、分别根据反义链上非甲基化位点和甲基化位点设计引物。若正常(NL)和前突变(PM)位点呈非甲基化状态,引物对non

-Met-F和non-Met-R将扩增出产物;若NL、PM和全突变(FM)(重复序列可达350以上)位点呈甲基化状态,引物对Met-F和Met-R

将扩增出产物。因为FM位点太长,用引物对Met-FΠR难以扩增出产物,所以使用三条引物mTP-F、mTP-R和Tail-R对其位点进行扩增。C、上图为从非甲基化位点扩增出的PCR产物的琼脂糖凝胶电泳结果;中图为从甲基化位点扩增出的PCR产物的琼脂糖凝胶电泳结果;下图为分别从男性和女性各种基因型的FMR1上扩增出的mTP-PCR产物的电泳结果。M-TP-PCR时超过300bp的模糊带

(SMAER)提示有前突变或全突变

3　结　　语

DNA甲基化是一种十分重要的基因表达调

控机制,在生物进化、物种繁衍和个体生存诸方面

均具有广泛的作用。深入研究甲基化与基因印迹调控与有性生殖、衰老、恶性肿瘤的发生的关系,152

不但有助于阐明基因印迹调控的内在机制,同时

也将提高相关疾病的临床诊断和治疗水平。就DNA甲基化检测而言,首先需要考虑的是待测对象是特定基因还是基因组。由于各种方法各有其优缺点,较准确的基础研究和临床筛查,对所需方法的要求亦不一样。本文提供的内容,希望能有助该领域的应用研究,和促进相关新技术的开发。

可以预期,在不久的未来,基因组DNA甲基化水平的检测,将作为个体化医药学中常规指标而应用于临床。参考文献:

[1]　MonkM.Epigeneticprogrammingofdifferentialgeneexpressionin

developmentandevolution[J].DevGenet,1995,17(3):188-197.

[2]　TyckoB.Epigeneticgenesilencingincancer[J].JClinInvest,

2000,105(4):40l-407.

[3]　StrainL,WarnerJP,JohnstonT,etal.Ahumanparthenogenetic

chimaera[J].NatGenet,1995,11(2):164-169.

[4]　SuraniMA.Parthenogenesisinman[J].NatGenet,1995,11

(2):111-113.

[5]　BaylinSB,HermanJG,GraftJR,etal.AlterationsinDNAmeth2

ylation:afundamentalaspectofneoplasia[J].AdvCancerRes,1998,72:141-196.

[6]　EhrlichM.DNAmethylationincancer:toomuchbutalsotoolittle

[J].Oncogene,2002,21(35):5400-5413.

[7]　BurbeeDG,ForgacsE,Zochbauer—MulerS,etal.Epigenetic

inactivationofRASSF1Ainlungandbreastcancersandmalignantphenotypesuppression[J].JNatlCancerlnst,2001,93(9):691-699.

[8]　VachtenheimJ,HorakovaI,NovotnaH.HypomethylationofCCGc

sitesinthe3’regionofH—rasprotooncogeneisfrequentandisas2sociatedwithH—rasallelelossinnon—smallcelllungcancer[J].CancerRes,1994,54(5):1145-1148.

[9]　NeddermannP,GallinariP,LettieriT,etal.Cloningandexpres2

sionofhumanG/Tmismatch—specificthymine—DNAglycosylase[J].JBiolChem,1996,271(22):12767-12774.

[10]　TommasiS,DenissenkoMF,PfeiferGP.Sunlightinducespyrimi2

dinedimerspreferentiallyat5-methylcytosinebases[J].CancerRes,1997,57(21):4727-4730.

[11]　ChenJX,ZhengY,WestM,etal.Carcinogenspreferentially

bindatmethylatedCpGinthep53mutationalhotspots[J].Can2cerRes,1998,58(10):2070-2075.

[12]　NuovoGJ,PlaiaTW,BelinskySA,etal.Insitudetectionofthe

hypermethylation—inducedinactivationofthep16geneasanear2lyeventinoncogenesis[J].ProcNatlAcadSciUSA,1999,96(22):12754-12759.

[13]　SoaresJ,PintoAE,CunhaCV,etal.GlobalDNAhypermethyl2

ationinbreastcarcinoma:correlationwithprognosticfactorsandtumorprogression[J].Cancer,l999,85(1):112-118.[14]　BiancoT,Chenevix—TrenchG,WalshDC,etal.Tumour-specificdistributionofBRCA1promoterregionmethylationsup2portsapathogeneticroleinbreastandovariancancer[J].Carci2nogenesis,2000,21(2):147-151.

[15]　房静远.上海医学,1996,19(1):1-4.

[16]　FrommerJG,McDonaldLE,MillarDS,etal.Agenomicse2

quencingprotocolthatyieldsapositivedisplayof52methylcytosineresiduesinindividualDNAstrands[J].ProcNatlAcadSciUSA,1992,89(5):1827-1831.

[17]　LiangG,GonzalgoML,SalemC,etal.IdentificationofDNA

methylationdifferencesduringtumorigenesisbymethylation-sen2sitivearbitrarilyprimedpolymerasechainreaction[J].Methods,2002,27(2):150-155.

[18]　SadriR,HornsbyPJ.RapidanalysisofDNAmethylationusing

newrestrictionenzymesitescreatedbybisulfitemodification[J].NucleicAcidsRes,1996,24(24):5058-5059.

[19]　XiongZ,LairdPW.COBRA:asensitiveandquantitativeDNA

methylationassay[J].NucleicAcidsRes,1997,25(12):2532-2534.

[20]　GonzalgoML,JonesPA.Rapidquantitationofmethylationdiffer2

encesatspecificsitesusingmethylationsensitivesinglenucleotideprimerextension(Ms-SNuPE)[J].NucleicAcidsRes,1997,25(12):2529-2531.

[21]　El-MaarriO,HerbiniauxU,WalterJ,etal.Arapid,quanti2

tative,non-radioactivebisulfite-SNuPE-IPRPHPLCassayformethylationanalysisatspecificCpGsites[J].NucleicAcidsRes,2002,30(6):e25.

[22]　HermanJG,GraffJR,MyohanenS,etal.Methylation-specific

PCR:anovelPCRassayformethylationstatusofCpGislands[J].ProcNatlAcadSciUSA,1996,93:9821-9826.

[23]　LiQ,AhujaN,BurgerPC,etal.Methylationandsilencingofthe

Thrombospondin-1promoterinhumancancer[J].Oncogene,1999,18:3284-3289.

[24]　DengG.MethylationofCpGinasmallregionofthehMLH1pro2

moterinvariablycorrelateswiththeabsenceofgeneexpression[J].CancerRes,1999,59(9):2029-2033.

[25]　GriggG.Sequencing5-methylcytosineresiduesingenomicDNA

[J].Bioessays,1994,16(6):431-436.

[26]　HiltunenMO,AlhonenL,KoistinahoJ,etal.Hypermethylation

oftheAPC(adenomatouspolyposiscoli)genepromoterregioninhumancolorectalcarcinoma[J].IntJCancer,1997,70(6):644-648.

[27]　MelkiJR.ConcurrentDNAhypermethylationofmultiplegenesin

acutemyeloidleukemia[J].CancerRes,1999,59(15):3730-3740.

[28]　PanagopoulosL,LassenC,KristofferssonU,etal.Amethylation

PCRapproachfordetectionoffragileXsyndrome[J].HumMu2tat,1999,14(1):71-79.

[29]　ZhouY,LawHY,BoehmCD,etal.RobustfragileX(CGG)n

genotypeclassificationusingamethylationspecifictriplePCRas2say[J].JMedGenet,2004,41:e45.

(收稿日期:2005-03-22)

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第33卷第2期南华大学学报・医学版

2005年4月DNA甲基化的生物学意义及其检测方法

周翠兰

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,殷宇芳

13

,张　佳,陈琳玲,肖　莉,廖端芳,李　凯

11111,2

,高汉林

1,2

(1.南华大学SNP研究所,湖南衡阳421001;2.希望城国家医学中心,加利福尼亚,美国)

摘　要:DNA甲基化是基因表达调控中一种常见而又重要的机制,参与细胞分化与增殖、生物体老

化、肿瘤发生等多种重要生命活动。文章简要叙述了DNA甲基化异常的病理学意义,分类介绍了目前主要的甲基化检测方法。希望对相关领域的研究有所助益。

关键词:甲基化;　单亲遗传病;　肿瘤;　老化;　甲基化检测中图分类号:Q786　　　文献标识码:A　　　文章编号:1672-7444(2005)02-0148-06

BiologicalImplicationsofDNAMethylation

andDNAMethylationAssays

ZHOUCui-lan,YINYu-fang,ZHANGJia,etal

(DepartmentofSNP,NanhuaUniversity,Hengyang,Hunan421001,China)

Abstract:　DNAmethylationplaysavarietyofcrucialrolesincelldivisionandproliferation,developmentandagingoflife,developmentofgeneticdiseasesrelatedtouniparentaldisomy,andcarcinogenesis.Asoneofthemajorepigeneticmechanisms,DNAemthylationanalysishasbeenoneofthefocusesinthepost-genomicera.ThispaperbrieflyintroducedthebiologicalimpactsofDNAmethylationanddiscussedthecurrentlyavailableDNAmeth2ylation-relatedassaysinmoredetail.InadditiontotheanalysisofDNAmethylationlevelofindividualgene,aglobalmethylationlevelisexpectedtobearoutineindexinindividualizedmedicineinevaluatingcancersusceptibil2ityandagingstatusinthenearfuture.

Keywords:DNAmethylation;　uniparentalgeneticdiseases;　cancinogenesis;　aging;　DNAmethylationassay

　　DNA甲基化是最常见的复制后及转录后修饰方式之一,在基因表达调控、发育调节、基因组

[1]

印迹等方面发挥重要作用。甲基化是指由DNA甲基转移酶介导,在胞嘧啶的第5位碳原子上加上一甲基基团,使之变成5-甲基胞嘧啶(5-mC)的化学修饰过程。基因组正常甲基化模式改变与

[2]

某些遗传病和肿瘤的发生密切相关。在各种疾

病的致病机制中,甲基化模式异常这一因素所起的作用各不相同。主要分为两类:(1)DNA甲基化直接造成基因失活。(2)甲基被加在突出的组蛋白尾部氨基端,使染色质构象改变,并藉此影响邻近基因的活性甚至更大范围的染色体行为。本文仅就上述第一点与相关生物学意义及甲基化检测方法予以讨论。

通讯作者:高汉林,南华大学SNP研究所,医学博士Π哲学博士,研究方向:分子遗传学.3此二位作者对本文具有相同贡献,为并列第一作者.

148

1　DNA甲基化的生物学意义

本文仅就当今医学界关注的热点:DNA甲基化与单亲遗传病、肿瘤以及老化进行了讨论。1.1　基因甲基化与单亲遗传病　单亲遗传病是

部性的高甲基化通过诱导基因突变、基因缺失

[7]

、

启动子区高甲基化导致基因表达抑制,使抑癌基因丧失功能。其中,局部性的高甲基化诱导基因突变有多方面原因:一是甲基化后的胞嘧啶更易发生内源性突变,如无酶脱氨的几率增加复

[6]

[8]

;二是

指由非孟德尔遗传方式引起的人类的遗传病。其中非孟德尔遗传方式指子代中本应包含双亲遗传信息的等位基因,丢失了一方亲本的遗传信息而仅保留了剩余一方亲本的信息。导致双亲遗传信息一方丢失的可能原因主要有以下四种:(1)父源或母源染色体缺失;(2)单亲二倍体的形成;(3)印记中心缺陷;(4)对称性移转。但非孟德尔遗传方式并非一定导致单亲遗传病的发生。事实上,染色体部分片段甚至整条染色体的单亲遗传亦非罕见现象。多数情况下,这些个体均可为正常表现型。此外,全基因组的单亲遗传,还可以造成镶嵌体的出现

[3,4]

突变后产生的T:G不易被错配修复机制识别恢

;三是其外源性突变几率增高,如对紫外线的

[9]

物理损伤更加敏感加等

[10]

,对化学致癌物的亲和力增

。

另一方面,全基因组的低甲基化可促使癌基因活化,使逆转座子的转录活性增强及基因的不稳定性增加。如去甲基化可能引起癌基因的非扩增性的过度表达

[11]

。除常见肿瘤之外,另有四类

特殊的肿瘤,即卵巢囊肿、葡萄胎、部分睾丸肿瘤和异位寄生囊肿,也与单亲遗传和DNA甲基化相关。

1.3　基因甲基化与老化　随着年龄的老化,基因

。

正常情况下存在部分与疾病相关的等位基因。其父源与母源甲基化模式不同,几乎所有与单亲遗传疾病相关的等位基因都有一些序列仅父源一方或仅母源一方发生甲基化,这些序列被称为“差异甲基化区域”。单亲遗传病发生与否,关键在于非孟德尔遗传方式是否发生在“差异甲基化区域”上。这是因为:甲基化的基因不表达或表达程度很低,因而基因的正常表达必须依赖于特定亲本(非甲基化一方)等位基因的正常表达。如果等位基因中非甲基化一方这段本来应有活性的基因片段出现异常或未能完整地遗传给子代,则会引起一系列人类疾病,并决定相关疾病的外显率、表现度,甚至遗传方式。主要代表有:贝克威思-威德曼综合征(Beckwith-WiedemannSyn2drome,BWS),普拉德威利综合征(Prader-WilliSyndrome,PWS),安格曼综合征(Angelmansyn2drome,AS)和特纳综合征(TURNER,TS)等。而等

组总体DNA甲基化水平逐渐降低。这一甲基化水平的变化,是否仅与老化有关,还是也参与老化过程中的肿瘤高发,尚有待进一步研究。不过,对基因组总体DNA甲基化水平进行监测,将可能成为未来个体化医药学中一种常用的医学指标。

2　基因甲基化的检测方法

CpG岛的局部高甲基化的出现往往早于细胞

的恶性增生,因此对DNA甲基化的检测可用于肿瘤发生的早期预测加而更加明显

[13]

[12]

;全基因组的低甲基化也伴

随癌症的发生而出现,且随着肿瘤恶性程度的增

,因此它也是诊断病情的重要指

标之一;甲基化检测还是肿瘤类型鉴别诊断的辅助手段,可用于癌症发生中的抑癌基因特异性失活的检测

[14]

。

虽然对甲基化生物学意义的认识已长达半个世纪,但对基因甲基化的相关检测方法的研究在近十年才得以重视。根据不同检测方法的原理及其发展先后,大致可分为三类:(1)将DNA降解为单核苷酸而后采用化学分析仪器如液相色谱或质谱对甲基化与非甲基化的胞嘧啶进行区分;(2)用序列特异性甲基化内切酶使DNA部份降解,通过Southern印迹区分甲基化与非甲基化的相关序列;(3)利用亚硫酸氢钠(BISULFITE)预处理DNA,直

位基因中甲基化一方出现异常并不导致单亲遗传病发生。

1.2　基因甲基化与肿瘤　基因组甲基化模式异

常(包括DNA过低甲基化和CpG岛高甲基化)与肿瘤发生一直是医学界关注热点之一。细胞周期、DNA修复、血管生成和凋亡等都涉及到相关基因的甲基化。肿瘤细胞DNA总体甲基化水平低于正常细胞,但某些特定基因(如肿瘤抑制基因)CpG岛却处于高甲基化状态

[2,5,6]

。一方面,局接通过引物延伸反应或耦联其他机制对甲基化与

149

非甲基化的胞嘧啶进行区分。

液相色谱或质谱法适用于全基因组DNA甲基化检测。此外利用不能酶切甲基化位点的限制性内切酶,分别消化处理待测基因组DNA和甲基化状态已知的对照组基因组DNA,电泳分离酶切片段,得出两张限制性内切酶图谱,通过比较待测组图谱与对照组图谱差异,也可获得全基因组甲基化状态。但这种方法较为粗略,要求两组的甲基化程度有明显的区别,假阳性较高。其余检测

方法主要用于特定DNA片段的甲基化检测。

在目前有关甲基化的研究中,以亚硫酸氢钠预处理法应用最为广泛。而亚硫酸氢钠预处理法,又可根据其区分甲基化与未甲基化的原理不同而进一步分为三亚类:主要包括亚硫酸氢钠联合限制性内切酶分析法,引物延伸反应界导的甲基化分析法(单碱基延伸,甲基化特异性PCR和实时PCR),以及亚硫酸氢钠预处理DNA的PCR产物的测序分析。各种方法的比较见表1。

表1　甲基化检测方法比较

　　　　　检测方法

1.高效液相色谱(HPLC)或质谱法

2.甲基化敏感的限制性内切酶联用Southern印迹杂交法3.亚硫酸氢钠(BISULFITE)预处理法

优缺点

灵敏;无法了解甲基化位置信息

简便,可实现高通量检测;检测位点受限,易产生假阳性

灵敏,其中部分方法可定量;易产生假阳性

　　a.亚硫酸氢钠联合限制性内切酶分析法(COBRA)

　　b.引物延伸反应介导的甲基化分析法(MS-SNuPE、MSP等)　　c.亚硫酸盐测序

　注:1类检测方法适用于基因组甲基化状态检测;2、3类检测方法适用于特定DNA片段甲基化状态检测

2.1　高效液相色谱(HPLC)法　用酸或酶将DNA

裂解为五类单核苷酸(包括5-mC)。因五类核苷

酸在极性溶液中的溶解度不同,在经过非极性的过滤柱时,出柱时间也不同,用波长260nm的紫外光测定流出液的吸收峰并定量。此法灵敏度为

[15]

碱基。此法是目前测定基因组DNA中5-mC总量最标准的方法,但不能了解甲基化的位置和状态信息且对DNA纯度要求较高。

2.2　甲基化敏感的限制性内切酶联用Southern印迹杂交法　限制性内切酶可分为对甲基敏感的限制性内切酶和对甲基不敏感的限制性内切酶两种。以对甲基敏感的限制性内切酶作用于待检DNA,未甲基化的DNA序列被酶解;甲基化的DNA虽碱基序列与限制性内切酶的识别序列一致,但因序列上存在甲基,不能被酶切。而不论DNA序列甲基化与否都能被对甲基不敏感的限制性内切酶消化。

根据上述原理,将样品DNA分为两组,分别用不同类型酶处理。用对甲基不敏感的限制性内切酶处理一组相当于平行对照。酶切处理后的产物经电泳分离后,用标记的探针对目的片段作Southern杂交。根据两组经不同处理的DNA样品杂交条带位置差异判断该位点的甲基化状态。对于部分甲基化的情况,会见到大小混杂的片断,其150

相对密度与甲基化的程度成正比。该方法较简便、成本低,可进行自动化和高通量基因检测,能通过内切酶的识别位点来反映甲基化的精确定位。但此法需要较多的样本,只能检测有限的含酶切位点的DNA甲基化状态,且有可能因为酶切反应的不完全而产生假阳性。用PCR扩增消化后的DNA模板可改良上述方法,大大增加该方法

[16]

的敏感性。该改良方法的基本原理是待检DNA分别经敏感性限制性内切酶和非敏感性限制性内切酶酶切后,根据待检甲基化位点外侧的DNA序列设计引物进行PCR扩增。用对甲基化敏感的限制性内切酶处理的一组DNA样品若扩增出含有甲基化位点的片段,则表示该组样品在相应限制性内切酶位点上存在甲基化;若不能扩增出含有甲基化位点的片段,则表示相应限制性内切酶位点上不存在甲基化。鉴于此法不能反映

[17]

出整个CpG岛甲基化状态,Liang等进一步将限制性酶切法和随机引物PCR相结合,以实现快速、高效地筛选基因组DNA甲基化异常片段,并分离与这些变化相关的特异性DNA序列。2.3　亚硫酸氢钠(BISULFITE)预处理法　采用亚硫酸盐对目标DNA进行化学修饰,为研究DNA甲基化提供了一种全新的方案。DNA经亚硫酸氢钠预处理后,非甲基化胞嘧啶转化为尿嘧啶,随

后作PCR扩增,此过程进一步将模板上的尿嘧啶转化为胸腺嘧啶;而甲基化的胞嘧啶不受亚硫酸氢钠影响,保持不变。这样DNA片段甲基化状态的差异转化为碱基序列的差异。通过区分后者就可间接判断样品中的胞嘧啶甲基化与否。有报道称靠近甲基化CpG位点的非甲基化胞嘧啶对亚硫酸氢钠敏感性较低。

[18]

2.3.1　亚硫酸氢钠联合限制性内切酶分析法　亚硫酸氢钠联合限制性内切酶分析法(com2binedbisulfiterestrictionanalysis,COBRA),是指先用亚硫酸氢钠处理DNA,然后对检测部位进行PCR扩增,再选用可切开检测位点的限制性内切酶酶切PCR产物:若其识别序列中的胞嘧啶被甲基化,因胞嘧啶保持不变,该位点仍能被限制性内切酶酶切;若未甲基化,则胞嘧啶转化成胸腺嘧

[19]

啶,该位点不再被原来的限制性内切酶识别。最后进行电泳及分析,根据电泳条带的不同位置及亮度即可检测出DNA的甲基化状态及甲基化

[19]

程度。本法能定量检测微量DNA样品特定基因位点的甲基化状态,但其定量信息的准确性取决于亚硫酸盐处理DNA样品是否完全,且甲基化分析也受限于种类不多的限制性内切酶的酶切位点。检测结果为阴性并不完全排除样品DNA中发生甲基化的可能性。2.3.2　甲基化敏感的单核苷酸引物延伸法(MS

[20]

-SNuPE)　甲基化敏感的单核苷酸引物延伸法(methylationsensitivesinglenucleotideprimerex2tension,MS-SNuPE)能检测任何序列上特定胞嘧啶的甲基化状态,且不需要克隆和测序PCR产物。该方法的原理是:DNA经亚硫酸氢钠处理后作为模板,用特殊设计的引物扩增目的片段,扩增反应会在待检甲基化位点的前一个核苷酸处终止;扩增后的DNA经纯化后分别与放射标记的dCTP或dTTP在DNA聚合酶作用下共孵育,如果待检位点是甲基化的,dCTP将会在延伸反应中掺入,反之dTTP会掺入。测定dCTP和dTTP的掺入量,即可分析出该位点的甲基化状况。引物设计和DNA的完全处理是该方法的关键。此法具有高度敏感性和特异性,只需少量的DNA样本。将甲基化敏感的单核苷酸引物延

伸法联合离子反相高效液相色谱技术,基于引物延伸产物的不同质量和疏水性,可以分辨和定量DNA的CpG位点甲基化状况。这种方法能在一个反应中同时快速检测多个位点,且不必克隆和El-Maarri等

[21]

[20]

测序PCR产物。2.3.3　甲基化特异性PCR(MSP)　甲基化特异性PCR(methylation-specificPCR,MSP)是Herman等首先提出的一种检测基因组DNA甲基化水平的常用方法。该法原理是DNA经亚硫酸氢钠处理后,非甲基化的胞嘧啶转变为尿嘧啶,而甲基化的胞嘧啶保持不变。在PCR反应时,设计两套不同的引物对:其一引物序列针对经亚硫酸氢钠处理后的甲基化DNA链设计,若用该对引物能扩增出片段,说明该检测位点发生了甲基化;另一引物针对经亚硫酸氢钠处理后的非甲基化DNA链设计,若用该对引物能扩增出片段,说明该检测位点没有甲基化。两对引物都具有很高的特异性,

[22]

与未经处理的DNA序列无互补配对。MSP作为一种高效、特异、敏感(检测灵敏度达105μg)的分子分析诊断遗传学实验方法,可检出多种甲基化作用且可用于石蜡包埋样品的分析。MSP的引物序列中必须含有一个或一个以上的CpG岛,以保证引物的特异性。引物覆盖序列中CpG岛所占比例越高,甲基化DNA检出率越高,同时引物设计应该尽可能与普通PCR的引物设计原则相符合。不足之处在于:(1)引物的选择和设计非常关键,否则易导致假阳性;(2)如果亚硫酸氢钠对DNA处理不完全,也易导致假阳性。可通过限制性内切酶酶解法检验PCR产物作进一步判[23]

断。(3)MSP法是以引物中所有CpG位点胞嘧啶均以完全甲基化为前提设计的,而事实上甲基化的CpG岛中却并非每个CpG位点都完全甲基化,所以,MSP法常常存在目标片段难扩增,或者特异性差等问题,不能反映整个CpG岛甲基化状[24]

态。

2.3.4　亚硫酸盐测序法(bisulfiteDNAsequenc2

[16]

ing)　该技术是检测基因组DNA上胞嘧啶单

[25]

核苷酸甲基化相对高效的方法,即在DNA经亚硫酸氢钠处理及扩增后,对扩增片段进行测序。利用该方法时要注意DNA应被亚硫酸氢钠充分处理,此方法通过测序可获得样品DNA中特定序列的全部甲基化信息。该技术的广泛应用,大大加深了我们对有关特定基因控制区CpG岛异常甲基化与肿瘤发生相互关系的认识。但是此方法需要大量的PCR和测序,较为繁琐、昂贵。2.3.5　亚硫酸盐降低CG含量的PCR用于脆性X染色体诊断　脆性X染色体的分子机制为位于FMR1的启动子CGG拷贝数过多及过度甲基化,

151

[26,27]

[22]

从而完全抑制此基因表达。正常情况下,CGG的数目在5～50之间。无症状个体(pre-mutation)可含有50～200拷贝。当CGG拷贝数大于200时,即为脆性X染色体患者。

脆性X染色体的诊断主要采用较费时的

[28]

Southern杂交。1999年,Panagopoulos报道了亚硫酸盐降低CG含量的PCR用于脆性X染色体诊断得PCR方法。由于亚硫酸盐能使相应区域的DNA反义链中的CCG转变为UCG,PCR反应时即成为TCG,从而使甲基化CGG重复序列的GC比

例由100%降为66%。该方法对其他疾病的诊断没有广泛性的借鉴价值,但就脆性X染色体诊断而言,则极大地简化了诊断过程。但是含超长CGG拷贝携带者及含两个正常相同CGG拷贝的

等位基因时,PCR产物都是单一条带。所以该方

[29]

法对PCR会出现假阴性。最近,Zhou等人在上述方法的基础之上,引入TCG重复序列特异性引物的三链PCR法克服了假阴性问题,从而使此方法可以替代Southern杂交,简化了脆性X染色体的诊断(见图1)

。

图1　检测FMR1上CGG重复序列甲基化状态的三链PCR法

A、在非甲基化位点上,CGG重复序列及其两侧序列(红色和蓝色)上的C在亚硫酸氢钠的作用下转化成U,U在随后的PCR过程中

被替换成T。B、分别根据反义链上非甲基化位点和甲基化位点设计引物。若正常(NL)和前突变(PM)位点呈非甲基化状态,引物对non

-Met-F和non-Met-R将扩增出产物;若NL、PM和全突变(FM)(重复序列可达350以上)位点呈甲基化状态,引物对Met-F和Met-R

将扩增出产物。因为FM位点太长,用引物对Met-FΠR难以扩增出产物,所以使用三条引物mTP-F、mTP-R和Tail-R对其位点进行扩增。C、上图为从非甲基化位点扩增出的PCR产物的琼脂糖凝胶电泳结果;中图为从甲基化位点扩增出的PCR产物的琼脂糖凝胶电泳结果;下图为分别从男性和女性各种基因型的FMR1上扩增出的mTP-PCR产物的电泳结果。M-TP-PCR时超过300bp的模糊带

(SMAER)提示有前突变或全突变

3　结　　语

DNA甲基化是一种十分重要的基因表达调

控机制,在生物进化、物种繁衍和个体生存诸方面

均具有广泛的作用。深入研究甲基化与基因印迹调控与有性生殖、衰老、恶性肿瘤的发生的关系,152

不但有助于阐明基因印迹调控的内在机制,同时

也将提高相关疾病的临床诊断和治疗水平。就DNA甲基化检测而言,首先需要考虑的是待测对象是特定基因还是基因组。由于各种方法各有其优缺点,较准确的基础研究和临床筛查,对所需方法的要求亦不一样。本文提供的内容,希望能有助该领域的应用研究,和促进相关新技术的开发。

可以预期,在不久的未来,基因组DNA甲基化水平的检测,将作为个体化医药学中常规指标而应用于临床。参考文献:

[1]　MonkM.Epigeneticprogrammingofdifferentialgeneexpressionin

developmentandevolution[J].DevGenet,1995,17(3):188-197.

[2]　TyckoB.Epigeneticgenesilencingincancer[J].JClinInvest,

2000,105(4):40l-407.

[3]　StrainL,WarnerJP,JohnstonT,etal.Ahumanparthenogenetic

chimaera[J].NatGenet,1995,11(2):164-169.

[4]　SuraniMA.Parthenogenesisinman[J].NatGenet,1995,11

(2):111-113.

[5]　BaylinSB,HermanJG,GraftJR,etal.AlterationsinDNAmeth2

ylation:afundamentalaspectofneoplasia[J].AdvCancerRes,1998,72:141-196.

[6]　EhrlichM.DNAmethylationincancer:toomuchbutalsotoolittle

[J].Oncogene,2002,21(35):5400-5413.

[7]　BurbeeDG,ForgacsE,Zochbauer—MulerS,etal.Epigenetic

inactivationofRASSF1Ainlungandbreastcancersandmalignantphenotypesuppression[J].JNatlCancerlnst,2001,93(9):691-699.

[8]　VachtenheimJ,HorakovaI,NovotnaH.HypomethylationofCCGc

sitesinthe3’regionofH—rasprotooncogeneisfrequentandisas2sociatedwithH—rasallelelossinnon—smallcelllungcancer[J].CancerRes,1994,54(5):1145-1148.

[9]　NeddermannP,GallinariP,LettieriT,etal.Cloningandexpres2

sionofhumanG/Tmismatch—specificthymine—DNAglycosylase[J].JBiolChem,1996,271(22):12767-12774.

[10]　TommasiS,DenissenkoMF,PfeiferGP.Sunlightinducespyrimi2

dinedimerspreferentiallyat5-methylcytosinebases[J].CancerRes,1997,57(21):4727-4730.

[11]　ChenJX,ZhengY,WestM,etal.Carcinogenspreferentially

bindatmethylatedCpGinthep53mutationalhotspots[J].Can2cerRes,1998,58(10):2070-2075.

[12]　NuovoGJ,PlaiaTW,BelinskySA,etal.Insitudetectionofthe

hypermethylation—inducedinactivationofthep16geneasanear2lyeventinoncogenesis[J].ProcNatlAcadSciUSA,1999,96(22):12754-12759.

[13]　SoaresJ,PintoAE,CunhaCV,etal.GlobalDNAhypermethyl2

ationinbreastcarcinoma:correlationwithprognosticfactorsandtumorprogression[J].Cancer,l999,85(1):112-118.[14]　BiancoT,Chenevix—TrenchG,WalshDC,etal.Tumour-specificdistributionofBRCA1promoterregionmethylationsup2portsapathogeneticroleinbreastandovariancancer[J].Carci2nogenesis,2000,21(2):147-151.

[15]　房静远.上海医学,1996,19(1):1-4.

[16]　FrommerJG,McDonaldLE,MillarDS,etal.Agenomicse2

quencingprotocolthatyieldsapositivedisplayof52methylcytosineresiduesinindividualDNAstrands[J].ProcNatlAcadSciUSA,1992,89(5):1827-1831.

[17]　LiangG,GonzalgoML,SalemC,etal.IdentificationofDNA

methylationdifferencesduringtumorigenesisbymethylation-sen2sitivearbitrarilyprimedpolymerasechainreaction[J].Methods,2002,27(2):150-155.

[18]　SadriR,HornsbyPJ.RapidanalysisofDNAmethylationusing

newrestrictionenzymesitescreatedbybisulfitemodification[J].NucleicAcidsRes,1996,24(24):5058-5059.

[19]　XiongZ,LairdPW.COBRA:asensitiveandquantitativeDNA

methylationassay[J].NucleicAcidsRes,1997,25(12):2532-2534.

[20]　GonzalgoML,JonesPA.Rapidquantitationofmethylationdiffer2

encesatspecificsitesusingmethylationsensitivesinglenucleotideprimerextension(Ms-SNuPE)[J].NucleicAcidsRes,1997,25(12):2529-2531.

[21]　El-MaarriO,HerbiniauxU,WalterJ,etal.Arapid,quanti2

tative,non-radioactivebisulfite-SNuPE-IPRPHPLCassayformethylationanalysisatspecificCpGsites[J].NucleicAcidsRes,2002,30(6):e25.

[22]　HermanJG,GraffJR,MyohanenS,etal.Methylation-specific

PCR:anovelPCRassayformethylationstatusofCpGislands[J].ProcNatlAcadSciUSA,1996,93:9821-9826.

[23]　LiQ,AhujaN,BurgerPC,etal.Methylationandsilencingofthe

Thrombospondin-1promoterinhumancancer[J].Oncogene,1999,18:3284-3289.

[24]　DengG.MethylationofCpGinasmallregionofthehMLH1pro2

moterinvariablycorrelateswiththeabsenceofgeneexpression[J].CancerRes,1999,59(9):2029-2033.

[25]　GriggG.Sequencing5-methylcytosineresiduesingenomicDNA

[J].Bioessays,1994,16(6):431-436.

[26]　HiltunenMO,AlhonenL,KoistinahoJ,etal.Hypermethylation

oftheAPC(adenomatouspolyposiscoli)genepromoterregioninhumancolorectalcarcinoma[J].IntJCancer,1997,70(6):644-648.

[27]　MelkiJR.ConcurrentDNAhypermethylationofmultiplegenesin

acutemyeloidleukemia[J].CancerRes,1999,59(15):3730-3740.

[28]　PanagopoulosL,LassenC,KristofferssonU,etal.Amethylation

PCRapproachfordetectionoffragileXsyndrome[J].HumMu2tat,1999,14(1):71-79.

[29]　ZhouY,LawHY,BoehmCD,etal.RobustfragileX(CGG)n

genotypeclassificationusingamethylationspecifictriplePCRas2say[J].JMedGenet,2004,41:e45.

(收稿日期:2005-03-22)

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