酶的主要提取方法及其优缺点
生物工程09-1班 杨桠楠[1**********]
1、有机溶剂沉淀是利用酶与其他杂质在有机溶剂中的溶解度不同，通过添加一定量的某种有机溶剂，使酶或杂质沉淀析出，从而使酶与杂质分离的。
优点：1）分辨率比盐析法高2） 沉淀不需脱盐3）溶剂易蒸发，沉淀易离心
缺点：1）有机溶剂易燃、易爆，对安全要求较高。2）对某些具有生物活性的大分子容易引起变性失活，操作需在低温下进行。沉淀析出后要尽快分离，尽量减少有机溶剂对酶活力的影响。
2、等电点沉淀是利用两性电解质在等电点时溶解度最低，以及不同的两性电解质有不同的等电点这一特性，通过调节溶液的pH值，使酶或杂质沉淀析出，从而使酶与杂质分离的 优点：1）大多数蛋白质的pI都在偏酸性范围内2）无机酸（如磷酸、盐酸、硫酸）价格较低3）无需除掉多余酸即可进行下一步纯化
缺点：1）酸化时，容易引起蛋白质失活
3、有机聚合物沉淀法(复合沉淀法)是在酶液中加入某些物质，使它与酶形成复合物而沉淀下来，从而使酶与杂质分离的。
优点：1）操作条件温和，不易引起生物大分子变性。2）沉淀效能高，使用少量的PEG即可沉淀相当多的生物大分子。3）沉淀后有机聚合物容易去除。
4、盐析沉淀法利用不同蛋白质在不同的盐浓度条件下溶解度不同的特性，通过在酶液中添加一定浓度的中性盐，使酶或杂质从溶液中析出沉淀，从而使酶与杂质分离
常用的盐析剂: 硫酸铵
优点：1）盐析能力强。2）在水中溶解度最大（25℃时为4.1mol/L）。而温度系数最小（对温度不敏感）。3）价格便宜。浓度高时也不会引起蛋白质和酶生物活性的丧失，抽提效果好。 缺点：1）缓冲能力差2）NH4＋的存在干扰蛋白质的测定3）得到的样品欲继续纯化时，需花一定时间脱盐。
5、双水相萃取技术是用两种不相溶的亲水性高分子聚合物水溶液，如聚乙二醇（PEG）和葡聚糖（Dextran）进行萃取。由于形成的两相均有很高的含水量（达70%〜90%），故称“双水相”系统。
优点：1）每一水相中均有很高的含水量，为酶等生物物质提供了一个良好的环境；2）PEG、
Dextran和无机盐对酶等无毒害作用，不会引起变性。3）平衡时间短、含水量高、截面张力小，特别适合于生物活性物质的分离纯化。4）操作简便5）易于放大
缺点：1）系统中水的含量高，分离后的物质浓度低，需经过浓缩等以提高浓度。2）含有高分子聚合物或盐类，在分离后需要进一步进行分离纯化，以除去高分子聚合物和盐类等杂质。
6、反胶团萃取是指表面活性剂（由亲水的极性基团和疏水的非极性基团两部分组成）分散在连续有机溶剂中自发形成的一种稳定的纳米级的聚集体进而达到分离的目的的。
优点：1）萃取率和反萃取率高。2）分离浓缩同时进行，溶剂可反复利用。3）解决胞内酶在非细胞环境中迅速失活问题。4）破壁功能，直接从完整细胞提取酶蛋白。5）成本低。6）极性“水池”具有较强的溶解能力。7）生物大分子由于具有较强的极性，可溶解于极性水核中，防止与外界有机溶剂接触，减少变性作用。8）由于“水池”的尺度效应，可以稳定蛋白质的立体结构，增加其结构的刚性，提高其反应性能。
7、超临界萃取是利用超临界流体的溶解能力与其密度的关系，即利用压力和温度对超临界流体溶解能力的影响而进行的。在超临界状态下，超临界流体具有很好的流动性和渗透性，将超临界流体与待分离的物质接触，使其有选择性地把极性大小、沸点高低和分子量大小的成分依次萃取出来。超临界流体（SCF）：当一种流体处于其临界点的温度和压力之下时。两相变为一相。
优点：1）密度接近液体－－萃取能力强2）粘度接近气体－－传质性能好3）超临界流体在超临界状态时具有密度大、粘度小、扩散系数大等优良的传质特性而成功开发的。4）具有提取率高、产品纯度好、流程简单、能耗低等优点。
最常用的超临界流体是CO2
优点：1）临界条件温和2）产品分离简单3）无毒、无害不燃无腐蚀4）性价格便宜 缺点：设备投资大
8、差速离心是采用不同的离心速度和离心时间，使沉降速度不同的颗粒分批分离的方法。 优点：操作简单，离心后用倾倒法即可将上清液与沉淀分开，并可使用容量较大的角式转子。缺点：1）分离效果差，不能一次得到纯颗粒。2）壁效应严重，特别是当颗粒很大或浓度很高时，在离心管一侧会出现沉淀。3）颗粒被挤压，离心力过大，离心时间过长会使颗粒变形，聚集而失活。
9、密度梯度离心（速度区带离心）样品在密度梯度介质中进行离心，使沉降系数比较接近的组分得以分离的一种区带分离方法。
优点：一次离心就能同时纯化不同大小的颗粒，而不必分开进行。
缺点：1）离心时间要严格控制，既有足够的时间使各种粒子在介质梯度中形成区带，又要控制在任一粒子达到沉淀前。如果离心时间过长，所有的样品可全部到达离心管底部；离心时间不足，样品还没有分离。2） 此法是一种不完全的沉降，沉降受物质本身大小的影响较大，一般是应用在物质大小相异而密度相同的情况。
10、等密度梯度离心（平衡等密度离心）是根据颗粒的密度不同而进行分离，离心时，在离心介质的密度梯度范围内，不同密度的物质颗粒或向下沉降，或向上漂浮，达到与其相同的密度时不再移动，形成区带。
优点：1）适用于分离大小相近而密度不同的样品2）不需粘性介质3）颗粒的最终分布与其大小和质量无关，只受其浮力密度影响；4）样品可以和整个梯度相混合；5）样品装载容积比密度梯度离心大。
缺点：离心过程很长
11、常压过滤是以液位差为推动力。过滤装置竖直安装，悬浮液置于过滤介质的上方，由于存在液位差，在重力的作用下，滤出液通过过滤介质流向下方，大颗粒物质被截留在介质表面。
优点：常压过滤设备简单，操作方便易行。
缺点：过滤速度较慢，分离效果较差，难以大规模连续使用。
12、加压过滤是以压力泵或压缩空气为过滤的推动力。在生产中常用的各种压滤机；还可采用添加助滤剂，降低悬浮液粘度和适当提高温度等措施。
优点：设备比较简单，过滤速度较快，效果较好，在生产中广泛使用。
13、减压过滤又称真空过滤或抽滤，是通过在过滤介质的下方抽真空的方法，增加过滤介质上下方之间的压差，推动液体通过过滤介质，而把大颗粒截留的过滤方法。
缺点：需要配备有抽真空系统，而且压力差最高不超过0.1Mpa，故多用于粘性不大的物料的过滤分离。
14、浓度梯度凝胶电泳通常采用聚丙烯酰胺凝胶。从凝胶顶部到底部丙烯酰胺的浓度呈梯度变化，如通常顶部凝胶浓度为5％，底部凝胶浓度为25％。凝胶梯度是通过梯度混合器形成的，高浓度的丙烯酰胺溶液首先加入到玻璃平板中，而后溶液浓度呈梯度下降，因此在凝胶的顶部孔径较大，而在凝胶的底部孔径较小。主要用于测定球蛋白类组分的分子质量。对纤维蛋白将产生较大的误差。
优点：1）比单一浓度凝胶的分离范围更宽，可以同时分离较大范围分子量的蛋白质。2）梯度凝胶孔径范围比单一凝胶大，例如用4％～30％的梯度胶可以分离分子量5万～200万的
蛋白质。3）梯度凝胶可以分辨分子量相差较小，在单一浓度凝胶中不能分辨的蛋白质。4）可以直接测定天然状态蛋白质的分子量而不需要解离为亚基，因此这一方法可以与SDS-PAGE测定分子量的方法互为补充。
15、聚丙烯酰胺等电聚焦电泳(Isoelectric Focusing-PAGE，简称IEF-PAGE)：利用各种蛋白质pI不同，以聚丙烯酰胺凝胶为电泳支持物，并在其中加入两性电解质载体(carrier ampholytes)，两性电解质载体在电场作用下，按各自pI形成从阳极到阴极逐渐增加的平滑和连续的pH梯度。在电场作用下，蛋白质在此pH梯度凝胶中泳动，当迁移至pH值等于pI处时，就不再泳动，而被浓缩成狭窄的区带。
运用：酶的等电点的测定、蛋白质的分离。
优点：1）分辨率高2）随时间延长，区带越来越窄3）样品混合液可以加到电泳系统的任何部位4）浓度很低的样品都可以分离5）可以准确测定酶、蛋白质、多肽等两性电解质的等电点
等电聚焦电泳缺点：1）电泳过程使用无盐溶液，此条件下有些会产生沉淀2）电泳后样品聚焦在各自等电点处，此条件下有些会产生沉淀
16、离子交换凝胶以交联葡聚糖凝胶（Sephadex gel）作为交换剂母体，再引入不同的活性基因，制成各种类型的离子交换葡聚糖。
优点：对生物活性物质是一个十分温和的环境（又兼备分子筛效应），交换容量很大，是上述的3～4倍，装柱后流动相在柱内，流动的阻力较小，流速理想，最适用于大分子的分离纯化。
17、凝胶柱层析是利用凝胶层析介质(固定相)交联度的同所形成的网状孔径的大小，在层析时能阻止比网孔直径大的生物大分子通过。利用流动相中溶质的分子量大小差异而进行分离的一种方法，称之为排阻层析。
优点：1）分离条件温和，因此不易引起生物样品的变性失活；2）每次分离操作之后，层析剂无需再生就可重复利用；3）工作范围广，分离的分子质量范围可从几百到数百万；4）设备简单，分离机理简单，易于操作；5）样品回收率高，几乎可达100%。
缺点：凝胶层析上样量小，操作压力不能高，流速较慢。
18、吸附层析（Adsorption Chromatography）是利用吸附剂对不同物质的吸附力不同，而使混合液中的各组分分离的方法。
优点：1） 不用或少用有机溶剂2） 操作简便、安全、设备简单3） 生产过程pH 变化小4）从稀溶液分离溶质5） 吸附剂对溶质的作用小
缺点1） 吸附平衡为非线性2）选择性较差
19、疏水层析是亲水性蛋白质（酶）表面均含有一定量的疏水性基团，尽管在水溶液中蛋白质（酶）具有将疏水性基团折叠在分子内部而表面显露极性和荷电基团的趋势，但总会有一些疏水性基团或极性基团的疏水部位暴露在蛋白质（酶）表面。这部分疏水基团可与亲水性固定相表面偶联的短链烷基、苯基等弱疏水基会发生疏水性相互作用，被固定相（疏水性吸附剂）所吸附。
优点：1）疏水柱层析可直接分离盐析后或高盐洗脱下来的蛋白质、酶等生物大分子溶液；2）分辨率很高、流速快、加样量大；3）疏水性吸附剂种类多，选择余地大，价格与离子交换剂相当。
20、亲和层析(affinity chromatography) 是在固定相载体表面偶联具有特殊亲和作用的配基这些配基可以与流动相中溶质分子发生可逆的特异性结合而进行分离的一种方法，称之为亲和层析。
优点：1）在生物制品分离和分析领域有宽广的应用开发前景。2）简便、快速、专一和高
3）应用十分广泛，已普及到生命科学的各个领域。
应用：1）分离和纯化各种生物分子2）分离纯化各种功能细胞3）用于各种生化成分的分析检测
21、分配柱层析是利用被分离物质中各成分在两种不相混溶的液体之间的分配系数不同而使混合物得到分离。
优点：1）载体来源容易2）分离成本低3）流速快4）适用于分离极性比较大、在有机溶剂中溶解度小的成分，或极性很相似的成分。
酶的主要提取方法及其优缺点
生物工程09-1班 杨桠楠[1**********]
1、有机溶剂沉淀是利用酶与其他杂质在有机溶剂中的溶解度不同，通过添加一定量的某种有机溶剂，使酶或杂质沉淀析出，从而使酶与杂质分离的。
优点：1）分辨率比盐析法高2） 沉淀不需脱盐3）溶剂易蒸发，沉淀易离心
缺点：1）有机溶剂易燃、易爆，对安全要求较高。2）对某些具有生物活性的大分子容易引起变性失活，操作需在低温下进行。沉淀析出后要尽快分离，尽量减少有机溶剂对酶活力的影响。
2、等电点沉淀是利用两性电解质在等电点时溶解度最低，以及不同的两性电解质有不同的等电点这一特性，通过调节溶液的pH值，使酶或杂质沉淀析出，从而使酶与杂质分离的 优点：1）大多数蛋白质的pI都在偏酸性范围内2）无机酸（如磷酸、盐酸、硫酸）价格较低3）无需除掉多余酸即可进行下一步纯化
缺点：1）酸化时，容易引起蛋白质失活
3、有机聚合物沉淀法(复合沉淀法)是在酶液中加入某些物质，使它与酶形成复合物而沉淀下来，从而使酶与杂质分离的。
优点：1）操作条件温和，不易引起生物大分子变性。2）沉淀效能高，使用少量的PEG即可沉淀相当多的生物大分子。3）沉淀后有机聚合物容易去除。
4、盐析沉淀法利用不同蛋白质在不同的盐浓度条件下溶解度不同的特性，通过在酶液中添加一定浓度的中性盐，使酶或杂质从溶液中析出沉淀，从而使酶与杂质分离
常用的盐析剂: 硫酸铵
优点：1）盐析能力强。2）在水中溶解度最大（25℃时为4.1mol/L）。而温度系数最小（对温度不敏感）。3）价格便宜。浓度高时也不会引起蛋白质和酶生物活性的丧失，抽提效果好。 缺点：1）缓冲能力差2）NH4＋的存在干扰蛋白质的测定3）得到的样品欲继续纯化时，需花一定时间脱盐。
5、双水相萃取技术是用两种不相溶的亲水性高分子聚合物水溶液，如聚乙二醇（PEG）和葡聚糖（Dextran）进行萃取。由于形成的两相均有很高的含水量（达70%〜90%），故称“双水相”系统。
优点：1）每一水相中均有很高的含水量，为酶等生物物质提供了一个良好的环境；2）PEG、
Dextran和无机盐对酶等无毒害作用，不会引起变性。3）平衡时间短、含水量高、截面张力小，特别适合于生物活性物质的分离纯化。4）操作简便5）易于放大
缺点：1）系统中水的含量高，分离后的物质浓度低，需经过浓缩等以提高浓度。2）含有高分子聚合物或盐类，在分离后需要进一步进行分离纯化，以除去高分子聚合物和盐类等杂质。
6、反胶团萃取是指表面活性剂（由亲水的极性基团和疏水的非极性基团两部分组成）分散在连续有机溶剂中自发形成的一种稳定的纳米级的聚集体进而达到分离的目的的。
优点：1）萃取率和反萃取率高。2）分离浓缩同时进行，溶剂可反复利用。3）解决胞内酶在非细胞环境中迅速失活问题。4）破壁功能，直接从完整细胞提取酶蛋白。5）成本低。6）极性“水池”具有较强的溶解能力。7）生物大分子由于具有较强的极性，可溶解于极性水核中，防止与外界有机溶剂接触，减少变性作用。8）由于“水池”的尺度效应，可以稳定蛋白质的立体结构，增加其结构的刚性，提高其反应性能。
7、超临界萃取是利用超临界流体的溶解能力与其密度的关系，即利用压力和温度对超临界流体溶解能力的影响而进行的。在超临界状态下，超临界流体具有很好的流动性和渗透性，将超临界流体与待分离的物质接触，使其有选择性地把极性大小、沸点高低和分子量大小的成分依次萃取出来。超临界流体（SCF）：当一种流体处于其临界点的温度和压力之下时。两相变为一相。
优点：1）密度接近液体－－萃取能力强2）粘度接近气体－－传质性能好3）超临界流体在超临界状态时具有密度大、粘度小、扩散系数大等优良的传质特性而成功开发的。4）具有提取率高、产品纯度好、流程简单、能耗低等优点。
最常用的超临界流体是CO2
优点：1）临界条件温和2）产品分离简单3）无毒、无害不燃无腐蚀4）性价格便宜 缺点：设备投资大
8、差速离心是采用不同的离心速度和离心时间，使沉降速度不同的颗粒分批分离的方法。 优点：操作简单，离心后用倾倒法即可将上清液与沉淀分开，并可使用容量较大的角式转子。缺点：1）分离效果差，不能一次得到纯颗粒。2）壁效应严重，特别是当颗粒很大或浓度很高时，在离心管一侧会出现沉淀。3）颗粒被挤压，离心力过大，离心时间过长会使颗粒变形，聚集而失活。
9、密度梯度离心（速度区带离心）样品在密度梯度介质中进行离心，使沉降系数比较接近的组分得以分离的一种区带分离方法。
优点：一次离心就能同时纯化不同大小的颗粒，而不必分开进行。
缺点：1）离心时间要严格控制，既有足够的时间使各种粒子在介质梯度中形成区带，又要控制在任一粒子达到沉淀前。如果离心时间过长，所有的样品可全部到达离心管底部；离心时间不足，样品还没有分离。2） 此法是一种不完全的沉降，沉降受物质本身大小的影响较大，一般是应用在物质大小相异而密度相同的情况。
10、等密度梯度离心（平衡等密度离心）是根据颗粒的密度不同而进行分离，离心时，在离心介质的密度梯度范围内，不同密度的物质颗粒或向下沉降，或向上漂浮，达到与其相同的密度时不再移动，形成区带。
优点：1）适用于分离大小相近而密度不同的样品2）不需粘性介质3）颗粒的最终分布与其大小和质量无关，只受其浮力密度影响；4）样品可以和整个梯度相混合；5）样品装载容积比密度梯度离心大。
缺点：离心过程很长
11、常压过滤是以液位差为推动力。过滤装置竖直安装，悬浮液置于过滤介质的上方，由于存在液位差，在重力的作用下，滤出液通过过滤介质流向下方，大颗粒物质被截留在介质表面。
优点：常压过滤设备简单，操作方便易行。
缺点：过滤速度较慢，分离效果较差，难以大规模连续使用。
12、加压过滤是以压力泵或压缩空气为过滤的推动力。在生产中常用的各种压滤机；还可采用添加助滤剂，降低悬浮液粘度和适当提高温度等措施。
优点：设备比较简单，过滤速度较快，效果较好，在生产中广泛使用。
13、减压过滤又称真空过滤或抽滤，是通过在过滤介质的下方抽真空的方法，增加过滤介质上下方之间的压差，推动液体通过过滤介质，而把大颗粒截留的过滤方法。
缺点：需要配备有抽真空系统，而且压力差最高不超过0.1Mpa，故多用于粘性不大的物料的过滤分离。
14、浓度梯度凝胶电泳通常采用聚丙烯酰胺凝胶。从凝胶顶部到底部丙烯酰胺的浓度呈梯度变化，如通常顶部凝胶浓度为5％，底部凝胶浓度为25％。凝胶梯度是通过梯度混合器形成的，高浓度的丙烯酰胺溶液首先加入到玻璃平板中，而后溶液浓度呈梯度下降，因此在凝胶的顶部孔径较大，而在凝胶的底部孔径较小。主要用于测定球蛋白类组分的分子质量。对纤维蛋白将产生较大的误差。
优点：1）比单一浓度凝胶的分离范围更宽，可以同时分离较大范围分子量的蛋白质。2）梯度凝胶孔径范围比单一凝胶大，例如用4％～30％的梯度胶可以分离分子量5万～200万的
蛋白质。3）梯度凝胶可以分辨分子量相差较小，在单一浓度凝胶中不能分辨的蛋白质。4）可以直接测定天然状态蛋白质的分子量而不需要解离为亚基，因此这一方法可以与SDS-PAGE测定分子量的方法互为补充。
15、聚丙烯酰胺等电聚焦电泳(Isoelectric Focusing-PAGE，简称IEF-PAGE)：利用各种蛋白质pI不同，以聚丙烯酰胺凝胶为电泳支持物，并在其中加入两性电解质载体(carrier ampholytes)，两性电解质载体在电场作用下，按各自pI形成从阳极到阴极逐渐增加的平滑和连续的pH梯度。在电场作用下，蛋白质在此pH梯度凝胶中泳动，当迁移至pH值等于pI处时，就不再泳动，而被浓缩成狭窄的区带。
运用：酶的等电点的测定、蛋白质的分离。
优点：1）分辨率高2）随时间延长，区带越来越窄3）样品混合液可以加到电泳系统的任何部位4）浓度很低的样品都可以分离5）可以准确测定酶、蛋白质、多肽等两性电解质的等电点
等电聚焦电泳缺点：1）电泳过程使用无盐溶液，此条件下有些会产生沉淀2）电泳后样品聚焦在各自等电点处，此条件下有些会产生沉淀
16、离子交换凝胶以交联葡聚糖凝胶（Sephadex gel）作为交换剂母体，再引入不同的活性基因，制成各种类型的离子交换葡聚糖。
优点：对生物活性物质是一个十分温和的环境（又兼备分子筛效应），交换容量很大，是上述的3～4倍，装柱后流动相在柱内，流动的阻力较小，流速理想，最适用于大分子的分离纯化。
17、凝胶柱层析是利用凝胶层析介质(固定相)交联度的同所形成的网状孔径的大小，在层析时能阻止比网孔直径大的生物大分子通过。利用流动相中溶质的分子量大小差异而进行分离的一种方法，称之为排阻层析。
优点：1）分离条件温和，因此不易引起生物样品的变性失活；2）每次分离操作之后，层析剂无需再生就可重复利用；3）工作范围广，分离的分子质量范围可从几百到数百万；4）设备简单，分离机理简单，易于操作；5）样品回收率高，几乎可达100%。
缺点：凝胶层析上样量小，操作压力不能高，流速较慢。
18、吸附层析（Adsorption Chromatography）是利用吸附剂对不同物质的吸附力不同，而使混合液中的各组分分离的方法。
优点：1） 不用或少用有机溶剂2） 操作简便、安全、设备简单3） 生产过程pH 变化小4）从稀溶液分离溶质5） 吸附剂对溶质的作用小
缺点1） 吸附平衡为非线性2）选择性较差
19、疏水层析是亲水性蛋白质（酶）表面均含有一定量的疏水性基团，尽管在水溶液中蛋白质（酶）具有将疏水性基团折叠在分子内部而表面显露极性和荷电基团的趋势，但总会有一些疏水性基团或极性基团的疏水部位暴露在蛋白质（酶）表面。这部分疏水基团可与亲水性固定相表面偶联的短链烷基、苯基等弱疏水基会发生疏水性相互作用，被固定相（疏水性吸附剂）所吸附。
优点：1）疏水柱层析可直接分离盐析后或高盐洗脱下来的蛋白质、酶等生物大分子溶液；2）分辨率很高、流速快、加样量大；3）疏水性吸附剂种类多，选择余地大，价格与离子交换剂相当。
20、亲和层析(affinity chromatography) 是在固定相载体表面偶联具有特殊亲和作用的配基这些配基可以与流动相中溶质分子发生可逆的特异性结合而进行分离的一种方法，称之为亲和层析。
优点：1）在生物制品分离和分析领域有宽广的应用开发前景。2）简便、快速、专一和高
3）应用十分广泛，已普及到生命科学的各个领域。
应用：1）分离和纯化各种生物分子2）分离纯化各种功能细胞3）用于各种生化成分的分析检测
21、分配柱层析是利用被分离物质中各成分在两种不相混溶的液体之间的分配系数不同而使混合物得到分离。
优点：1）载体来源容易2）分离成本低3）流速快4）适用于分离极性比较大、在有机溶剂中溶解度小的成分，或极性很相似的成分。