破骨细胞的诱导培养
1. 和仪器，技术相关的危害物质
∙ 无
2. 准备工作
仪器和耗材：
∙ TDGC2J超净工作台（苏州净化设备厂）
∙ AUTOCLAVE MLS-3780高压灭菌锅（SANYO）
∙ DGG-9140B型电热烘干箱（上海森信实验仪器有限公司）
∙ DK-8D型水浴锅（上海精宏实验设备有限公司）
∙ SZ-93纯水蒸馏器（上海亚荣生化仪器厂）
∙ COIC XDS-1B倒置显微镜
∙ MCO-15AC CO2 INCUBATOR(细胞培养箱，日本Sanyo)
∙ 移液器(Gilson公司 )
∙ 废液缸
∙ 10μl,200μl,1000μl无菌枪头
∙ 一次性无菌吸头
∙ 细胞计数板，盖玻片
∙ 96孔细胞培养板
∙ -20℃/4℃冰箱（海尔）
∙ 细胞培养瓶（25cm2）
∙ 采血管
试剂：
∙ DMEM(无血清)
∙ 无菌水
∙ 含诱导因子的带胎牛血清DMEM(血清20%，GM-CSF 25ng/ml，RANKL 30ng/ml)平时于-20℃冰箱中保存。
∙ PBS
3. 操作者防护措施
∙ 实验服
∙ 手套
∙ 注意面部防护
4. 工作区域
∙ 超净工作台
5. 流程
准备工作：
操作步骤：
1. 细胞铺板：提取的单核淋巴细胞计数后按每孔2×104个细胞铺96孔板，每孔加DMEM培养基200μL,孵育5h。
OI Standard Operating Procedure
版本号： V1 创建日期：9/3/2011 创建者: 杨小萌 校对日期： 校对者: Page 1 of 2
2. 弃培养液，加带血清的DMEM,200μl/孔，孵育24h。
3. （细胞消化：弃培养液，会有贴壁细胞，加0.25%胰蛋白酶40μL,晃动混均,37℃消化3-5min，代细胞将近脱落时，加完全培养液终止消化。反复吹打细胞，1500r/7min。收集细胞沉淀加完全培养基重悬。→对于成骨细胞等可以，对于破骨细胞，一是比较难消化，二是消化后难贴壁。）将每孔分为4个视野，在显微镜下计数。
4. 弃培养液，加含诱导因子的DMEM200μl/孔，孵育，每三天换一次液。
5. 到出现破骨细胞时再进行计数。
清洁流程
∙ 75%乙醇擦拭超净工作台
∙ 紫外照射30分钟
6. 废物、废液处理
∙ 84消毒液清洗废液缸，废弃物集中处理
OI Standard Operating Procedure
版本号： V1 创建日期：9/3/2011 创建者: 杨小萌 校对日期： 校对者: Page 2 of 2
破骨细胞的诱导培养
1. 和仪器，技术相关的危害物质
∙ 无
2. 准备工作
仪器和耗材：
∙ TDGC2J超净工作台（苏州净化设备厂）
∙ AUTOCLAVE MLS-3780高压灭菌锅（SANYO）
∙ DGG-9140B型电热烘干箱（上海森信实验仪器有限公司）
∙ DK-8D型水浴锅（上海精宏实验设备有限公司）
∙ SZ-93纯水蒸馏器（上海亚荣生化仪器厂）
∙ COIC XDS-1B倒置显微镜
∙ MCO-15AC CO2 INCUBATOR(细胞培养箱，日本Sanyo)
∙ 移液器(Gilson公司 )
∙ 废液缸
∙ 10μl,200μl,1000μl无菌枪头
∙ 一次性无菌吸头
∙ 细胞计数板，盖玻片
∙ 96孔细胞培养板
∙ -20℃/4℃冰箱（海尔）
∙ 细胞培养瓶（25cm2）
∙ 采血管
试剂：
∙ DMEM(无血清)
∙ 无菌水
∙ 含诱导因子的带胎牛血清DMEM(血清20%，GM-CSF 25ng/ml，RANKL 30ng/ml)平时于-20℃冰箱中保存。
∙ PBS
3. 操作者防护措施
∙ 实验服
∙ 手套
∙ 注意面部防护
4. 工作区域
∙ 超净工作台
5. 流程
准备工作：
操作步骤：
1. 细胞铺板：提取的单核淋巴细胞计数后按每孔2×104个细胞铺96孔板，每孔加DMEM培养基200μL,孵育5h。
OI Standard Operating Procedure
版本号： V1 创建日期：9/3/2011 创建者: 杨小萌 校对日期： 校对者: Page 1 of 2
2. 弃培养液，加带血清的DMEM,200μl/孔，孵育24h。
3. （细胞消化：弃培养液，会有贴壁细胞，加0.25%胰蛋白酶40μL,晃动混均,37℃消化3-5min，代细胞将近脱落时，加完全培养液终止消化。反复吹打细胞，1500r/7min。收集细胞沉淀加完全培养基重悬。→对于成骨细胞等可以，对于破骨细胞，一是比较难消化，二是消化后难贴壁。）将每孔分为4个视野，在显微镜下计数。
4. 弃培养液，加含诱导因子的DMEM200μl/孔，孵育，每三天换一次液。
5. 到出现破骨细胞时再进行计数。
清洁流程
∙ 75%乙醇擦拭超净工作台
∙ 紫外照射30分钟
6. 废物、废液处理
∙ 84消毒液清洗废液缸，废弃物集中处理
OI Standard Operating Procedure
版本号： V1 创建日期：9/3/2011 创建者: 杨小萌 校对日期： 校对者: Page 2 of 2