丙型肝炎病毒抗体双抗原夹心法的应用探讨

丙型肝炎病毒抗体双抗原夹心法的应用探讨

【摘要】 目的 探讨丙型肝炎病毒抗体双抗原夹心法的应用。方法 分析包括血液筛查阴性标本420份, 质控标本430份。结果 对240份HCV 抗体阳性标本进行检测, 双抗原夹心法检测有3份标本未检出。3份样本经ChironRIBA 确认试剂检测, 结果为阳性。敏感性较高99.85%。结论 双抗原夹心丙型肝炎病毒抗体酶联免疫诊断试剂对所检测的质控标本的检测总符合率达99.85%,且敏感性和特异性均较好, 有望用于临床血液标本的筛查。

【关键词】 丙型肝炎; 病毒抗体双抗原夹心法; 应用

HCV 是输血后肝炎的重要病因, 主要通过血液或血液制品传播,HCV 感染呈世界性分布, 我国感染者约有4000万, 为控制HCV 经血液传播, 要求对献血者进行抗-HCV 的检测。常用的抗-HCV 检测试剂均采用间接酶联免疫法, 该方法中包被抗原的组成和质量是关键因素。近年来对抗-HCV 间接酶联免疫法试剂单独检测阳性, 且在临界值附近的样本, 用双抗原夹心酶联免疫法试剂检测均为阴性, 我们建立了双抗原夹心ELISA 方法[1]。改进HCV 的血清学诊断, 取得良好的效果, 现汇报如下。

1 材料和方法

1.1 血清标本 包括血液筛查阴性标本420份, 质控标本430份。

1.2 抗原的制备 嵌合表位抗原包括HCV-NS3-C-NS4-NS5, 以包涵体形式表达, 通过SP-SepharoseFF 或Q-Sepharose FF离子交换层析进行纯化, 将所收集的洗脱峰再用Sephadex G-50柱凝胶过滤,SDS-PAGE 鉴定抗原蛋白。

1.3 试剂 吉比爱及Ortho 丙肝病毒抗体酶联免疫诊断试剂检测。ChironRIBA 确认试剂。

1.4 双抗原夹心法 用50 mmol/L pH916 碳酸盐缓冲液(包被液) 稀释抗原至工作浓度。多肽抗原工作浓度为:结构区多肽15 Lg/ml,N S4区多0.5Lg/ml,N S5区多肽0.25 Lg/ml。基因工程表达抗原工作浓度C7 和C11 均为1 μg/ml。每孔加100 μl, 置37℃保温1h 后于4℃过夜。用含30%小牛血清PBST 封闭, 每孔加200 μl, 置37℃保温1 h。倒掉封闭液, 每孔加50 μl样品稀释液, 5 μl样品, 置37℃30 min。用PBST 洗板5次。用棋盘滴定法选择最适酶稀释度, 用稀释液将酶标记抗原稀释至工作浓度。每孔加50 μl, 置37℃保温15 min 。PBST 洗板5次。每孔加底物缓冲液50 μl, 显色剂( TMB ) 50Ll, 置37℃显色10 min 。每孔加2 mol/LH2SO 4 50 μl终止反应, 在Labsystem sM ult iskanM S 型酶标仪于450 nm测吸光度A 值, 标本450 nm的A 值大于或等于临界值(Cutoff value)者为阳性, 反之为阴性。

丙型肝炎病毒抗体双抗原夹心法的应用探讨

【摘要】 目的 探讨丙型肝炎病毒抗体双抗原夹心法的应用。方法 分析包括血液筛查阴性标本420份, 质控标本430份。结果 对240份HCV 抗体阳性标本进行检测, 双抗原夹心法检测有3份标本未检出。3份样本经ChironRIBA 确认试剂检测, 结果为阳性。敏感性较高99.85%。结论 双抗原夹心丙型肝炎病毒抗体酶联免疫诊断试剂对所检测的质控标本的检测总符合率达99.85%,且敏感性和特异性均较好, 有望用于临床血液标本的筛查。

【关键词】 丙型肝炎; 病毒抗体双抗原夹心法; 应用

HCV 是输血后肝炎的重要病因, 主要通过血液或血液制品传播,HCV 感染呈世界性分布, 我国感染者约有4000万, 为控制HCV 经血液传播, 要求对献血者进行抗-HCV 的检测。常用的抗-HCV 检测试剂均采用间接酶联免疫法, 该方法中包被抗原的组成和质量是关键因素。近年来对抗-HCV 间接酶联免疫法试剂单独检测阳性, 且在临界值附近的样本, 用双抗原夹心酶联免疫法试剂检测均为阴性, 我们建立了双抗原夹心ELISA 方法[1]。改进HCV 的血清学诊断, 取得良好的效果, 现汇报如下。

1 材料和方法

1.1 血清标本 包括血液筛查阴性标本420份, 质控标本430份。

1.2 抗原的制备 嵌合表位抗原包括HCV-NS3-C-NS4-NS5, 以包涵体形式表达, 通过SP-SepharoseFF 或Q-Sepharose FF离子交换层析进行纯化, 将所收集的洗脱峰再用Sephadex G-50柱凝胶过滤,SDS-PAGE 鉴定抗原蛋白。

1.3 试剂 吉比爱及Ortho 丙肝病毒抗体酶联免疫诊断试剂检测。ChironRIBA 确认试剂。

1.4 双抗原夹心法 用50 mmol/L pH916 碳酸盐缓冲液(包被液) 稀释抗原至工作浓度。多肽抗原工作浓度为:结构区多肽15 Lg/ml,N S4区多0.5Lg/ml,N S5区多肽0.25 Lg/ml。基因工程表达抗原工作浓度C7 和C11 均为1 μg/ml。每孔加100 μl, 置37℃保温1h 后于4℃过夜。用含30%小牛血清PBST 封闭, 每孔加200 μl, 置37℃保温1 h。倒掉封闭液, 每孔加50 μl样品稀释液, 5 μl样品, 置37℃30 min。用PBST 洗板5次。用棋盘滴定法选择最适酶稀释度, 用稀释液将酶标记抗原稀释至工作浓度。每孔加50 μl, 置37℃保温15 min 。PBST 洗板5次。每孔加底物缓冲液50 μl, 显色剂( TMB ) 50Ll, 置37℃显色10 min 。每孔加2 mol/LH2SO 4 50 μl终止反应, 在Labsystem sM ult iskanM S 型酶标仪于450 nm测吸光度A 值, 标本450 nm的A 值大于或等于临界值(Cutoff value)者为阳性, 反之为阴性。