1、目的：验证供试品有无抑菌活性，从而确认所采用的方法适合于该药品的微生物限度检查。 2、验证项目：①细菌、霉菌及酵母菌计数方法 ②控制菌检查方法
3、适用范围：适用于各剂型药品的微生物限度检查。 4、试验用菌种（菌株传代次数不得超过5代）：
枯草芽胞杆菌[CNCC（B）63501] 金黄色葡萄球菌[CNCC（B）26003] 大肠埃希菌[CNCC（B）44102] 白色念珠菌[CNCC（B）98001] 黑曲霉菌[CNCC（B）98003]
乙型副伤寒沙门菌[CNCC（B）50094] 5、验证方法 5.1 菌液制备
5.1.1 经37℃培养18-24小时，金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、基草芽胞杆菌、乙型副伤寒沙门菌营养肉汤培养物1ml＋9ml生理盐水10稀释至10-5-10-7为50-100个/ml，做活菌记数备用。
5.1.2 经25℃培养18-24小时的白色念珠菌霉菌液体培养物1ml＋9ml生理盐水稀释至10-5-10-7为50-100个/ml，做活菌记数备用。
5.1.3经25℃培养1周的黑曲霉菌斜面培养物，加3-5ml盐水洗下霉菌孢子，吸取出菌液，用标准比浊管比浊，与浊度相当后，取1ml＋9ml生理盐水，逐管10倍稀释至10-4-10-5为50-100个/ml，做活菌记数备用。 5.2 供试品制备
称取供试品10g或10ml，加pH7.0的无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml浓度为1：10供试液，分别人工上述6种试验菌株。 5.3 细菌、霉菌及酵母菌计数方法验证
5.3.1 至少应进行3次独立的平行试验，并分别计算各试验菌每次试验的回收率。 5.3.2 试验组：取供试品1：10稀释液1ml和50-100cfu试验菌，分别注入平皿中，立即倾注琼脂培养基，每株试验菌平行制备2个平皿，待凝固后，置规定培养温度培养24-72小时观察结果。
5.3.3 菌液组：测定每一株加的试验功数。
5.3.4 供试液对照组：取规定量供试液，按菌落数计数方法测定供试品本底菌数。
1
5.3.5 根据试验组、菌液组及供试液对照组平均菌落数计算试验组的菌回收率。回收率计算公式如下：
回收率=（试验组平均菌落数-供试品对照组平均菌落数）÷菌液组平均菌落数×100% 5.3.6 结果判断：在3次独立的平行试验中，若试验组的菌回收率均不低于70%，则照该供试液制备方法和计数法测定供试品的细菌、霉菌及酵母菌数；若任一次试验中试验组的菌回收率低于70%，应采用其它方法消除供试品的抑菌活性，并重新进行方法验证。 5.3.7 验证结果及确认
结论及评价：
执行人： 日期： 复核人： 日期： 5.4 控制菌检查方法验证
5.4.1 试验组：取规定量供试液及10-100cfu试验菌加入增菌液培养基中，依相应控制菌检查法进行检查。
2
5.4.2 阴性对照组：方法同试验组，验证大肠埃希菌、大肠菌群、沙门菌检查法时的阴性对照菌采用金黄色葡萄球菌；验证铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、梭菌检查法时的阴性对照菌采用大肠埃希菌。
5.4.3 至少应进行3次独立的平行试验。
5.4.4 结果判断：阴性菌对照组不得检出阴性对照菌。若试验组检出试验菌，按此供试液制备法和控制菌检查法进行供试品的该控制菌检查；若试验组未检出试验菌，应采用其它方法消除供试品的抑菌活性，并重新进行方法验证。 5.4.5 验证结果及确认
结论评价：
执行人： 日期： 复核人： 日期： 6 验证结论及评价：
总结人： 日期： 3
1、目的：验证供试品有无抑菌活性，从而确认所采用的方法适合于该药品的微生物限度检查。 2、验证项目：①细菌、霉菌及酵母菌计数方法 ②控制菌检查方法
3、适用范围：适用于各剂型药品的微生物限度检查。 4、试验用菌种（菌株传代次数不得超过5代）：
枯草芽胞杆菌[CNCC（B）63501] 金黄色葡萄球菌[CNCC（B）26003] 大肠埃希菌[CNCC（B）44102] 白色念珠菌[CNCC（B）98001] 黑曲霉菌[CNCC（B）98003]
乙型副伤寒沙门菌[CNCC（B）50094] 5、验证方法 5.1 菌液制备
5.1.1 经37℃培养18-24小时，金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、基草芽胞杆菌、乙型副伤寒沙门菌营养肉汤培养物1ml＋9ml生理盐水10稀释至10-5-10-7为50-100个/ml，做活菌记数备用。
5.1.2 经25℃培养18-24小时的白色念珠菌霉菌液体培养物1ml＋9ml生理盐水稀释至10-5-10-7为50-100个/ml，做活菌记数备用。
5.1.3经25℃培养1周的黑曲霉菌斜面培养物，加3-5ml盐水洗下霉菌孢子，吸取出菌液，用标准比浊管比浊，与浊度相当后，取1ml＋9ml生理盐水，逐管10倍稀释至10-4-10-5为50-100个/ml，做活菌记数备用。 5.2 供试品制备
称取供试品10g或10ml，加pH7.0的无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml浓度为1：10供试液，分别人工上述6种试验菌株。 5.3 细菌、霉菌及酵母菌计数方法验证
5.3.1 至少应进行3次独立的平行试验，并分别计算各试验菌每次试验的回收率。 5.3.2 试验组：取供试品1：10稀释液1ml和50-100cfu试验菌，分别注入平皿中，立即倾注琼脂培养基，每株试验菌平行制备2个平皿，待凝固后，置规定培养温度培养24-72小时观察结果。
5.3.3 菌液组：测定每一株加的试验功数。
5.3.4 供试液对照组：取规定量供试液，按菌落数计数方法测定供试品本底菌数。
1
5.3.5 根据试验组、菌液组及供试液对照组平均菌落数计算试验组的菌回收率。回收率计算公式如下：
回收率=（试验组平均菌落数-供试品对照组平均菌落数）÷菌液组平均菌落数×100% 5.3.6 结果判断：在3次独立的平行试验中，若试验组的菌回收率均不低于70%，则照该供试液制备方法和计数法测定供试品的细菌、霉菌及酵母菌数；若任一次试验中试验组的菌回收率低于70%，应采用其它方法消除供试品的抑菌活性，并重新进行方法验证。 5.3.7 验证结果及确认
结论及评价：
执行人： 日期： 复核人： 日期： 5.4 控制菌检查方法验证
5.4.1 试验组：取规定量供试液及10-100cfu试验菌加入增菌液培养基中，依相应控制菌检查法进行检查。
2
5.4.2 阴性对照组：方法同试验组，验证大肠埃希菌、大肠菌群、沙门菌检查法时的阴性对照菌采用金黄色葡萄球菌；验证铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、梭菌检查法时的阴性对照菌采用大肠埃希菌。
5.4.3 至少应进行3次独立的平行试验。
5.4.4 结果判断：阴性菌对照组不得检出阴性对照菌。若试验组检出试验菌，按此供试液制备法和控制菌检查法进行供试品的该控制菌检查；若试验组未检出试验菌，应采用其它方法消除供试品的抑菌活性，并重新进行方法验证。 5.4.5 验证结果及确认
结论评价：
执行人： 日期： 复核人： 日期： 6 验证结论及评价：
总结人： 日期： 3