肺炎链球菌耐药性检测

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文章编号:1002-2694(2010) 03-0255-04

肺炎链球菌耐药性检测及其

对大环内酯类抗生素耐药机制的研究3

潘方平1, 吴璐怡2, 叶云飞2, 孙爱华2

摘　要:目的　了解浙江地区肺炎链球菌临床菌株对临床常用抗生素耐药性以及肺炎链球菌对大环内酯类抗生素耐药机制。方法　从浙江省不同地区病人临床标本中分离并鉴定肺炎链球菌138株。采用K 2B 纸片法和E 2test 检测上述肺炎链球菌临床菌株对9种抗生素的敏感性。采用PCR 检测上述菌株中与大环内酯类抗生素耐药性密切相关的ermB 和mef E 基因携带情况。分析ermB 和mef E 基因携带、分布状况与红霉素耐药性关系。结果　138株肺炎链球菌临床菌株中, 对红霉素耐药率高达93. 5%(129/138) , 对头孢噻肟、头孢呋辛、阿莫西林和左氧氟沙星的耐药率较低(2. 9%～4. 3%) 。上述菌株er 2

mB 基因检测阳性率(91. 3%, 126/138) 明显高于mef E 基因(33. 3%, 46/138) (P

带。不携带ermB 和mef E 基因菌株均对红霉素敏感, 仅携带mef E 基因菌株对红霉素耐药率(62. 5%) 明显低于同时携带两种基因菌株耐药率(100%) 及仅携带ermB 基因菌株耐药率(97. 7%) (P

关键词:肺炎链球菌; 耐药性; ermB 基因; mef E 基因　　中图分类号:R378.1　文献标识码:A　　

R 2resistant mechanism of St re PAN Fang 2ping ,WU L u 2yi , YE Yun 2fei ,SUN Ai 2hua

(Facult y of B asic Medicine , Zhej iang Medical College , H angz hou 310053, China )

ABSTRACT :In order to understand the resistance against common antibiotics in clinic and macrolide antibiotic 2resistant mechanism of S t re ptococcus pneumoni ae (S. pneumoniae ) isolates in Zhejiang area , both K 2B slip method and E 2test were ap 2plied to determine the sensitivity of 138S. pneumoniae isolates to nine antibiotics , and the ermB and mef E genes in those iso 2lates which associated with macrolide antibiotics 2resistance closely were detected by PCR. Subsequently , correlation among er 2mB and mef E genes and the erythromycin resistance were analyzed. For these 138S. pneumoniae isolates , 93. 5%(129/138)

of the strains were resistant to erythromycin , but only 2. 9%～4. 3%strains were resistant to cefotaxim , cefuroxime , amoxicil 2lin and levofloxacin. The positive rate of ermB gene in the isolates (91. 3%, 126/138) was significantly higher than that of mef E gene (33. 3%, 46/138) (P

strains without ermB and mef E genes were sensitive to erythromycin. The erythromycin resistance rate (62. 5%) of mef E gene positive strains was remarkably lower than that of the mef E &ermB gene positive strains (100%) and the ermB gene posi 2tive strains (97. 7%) (P

　　KE Y WOR DS :S t re ptococcus pneumoniae ; drug resistance ; ermB gene ; mef E gene

　　肺炎链球菌(S t reptococcus p neumoni ae ) 是人类细菌性肺炎的主要病原体, 也可引起脑膜炎、败血症的中耳炎等疾病〔1〕。近年来, 许多国家和地区对β2内酰胺类及大环内酯类抗生素耐药的肺炎链球菌菌株流行日益广泛, 导致相关疾病发病率逐年升

　　3卫生部科研基金(W K J 2007222005) ; 浙江省大学生科技创新项目

(00004A00902)

　　通讯作者:孙爱华,Email :sunah123@126. com 　　作者单位:1.浙江省永嘉县乌牛镇卫生院, 温州　325103;

2. 浙江医学高等专科专科学校, 杭州　310053

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高〔224〕, 我国也不例外〔526〕。与β2内酰胺类抗生素不同, 大环内酯类抗生素不易引起过敏反应, 因而在临床上使用日趋增加, 导致大环内酯类抗生素耐药性肺炎链球菌株普遍流行且具有明显的地区差异〔2,5〕。有文献报道, 肺炎链球对大环内酯类抗生素的耐药机制主要涉及ermB 和mef E 基因〔728〕。因此, 调查我国不同地区大环内酯类抗生素耐药性肺炎链球菌流行状况及其ermB 和mef E 基因相关耐药机制具有重要意义。　　本研究中, 我们收集了浙江省各个地区临床分离的138株肺炎链球菌, 采用药物敏感试验检测了上述菌株对9种临床常用抗生素的耐药性, 采用PCR 检测了上述菌株中ermB 和mef A 基因分布, 以初步了解本地区大环内酯类抗生素耐药性肺炎链球菌的流行情况及其主要耐药模式。1　材料与方法1. 1　材料1. 1. 1　菌株来源　138株肺炎链球菌临床菌株分离自2006年至2009年浙江省不同地区病人临床标本并经系统的细菌学鉴定。链球菌A TCC49619, 葡萄球菌A A 和

大肠埃希菌D H5

系提供。肺炎链球菌接种于含5%脱纤维羊血的

M H 琼脂平板上,37℃、5%CO 2条件下培养; 金黄色葡萄球菌和大肠埃希菌接种于M H 琼脂平板上37℃培养。1. 1. 2　主要试剂　各抗生素E 2test 条或纸片分别购自瑞典AB 2BioDisk 公司及杭州天和微生物制剂有限公司。M H 琼脂购自英国Oxoid 公司。细菌基因组DNA 提取试剂盒购自上海博彩生物科技有限公司(BioColor ) 。PCR 试剂盒、PCR 产物纯化试剂盒和T 2A 克隆试剂盒购自大连宝生物有限公司(Ta KaRa ) 。1. 2　方法

1. 2. 1　细菌基因组DNA 模板制备　将新鲜细菌

物〔10211〕。扩增ermB 基因片段(1114～1851bp ) 引

物序列:上游5’2GAA AAA GTA C TC AAC CAA A TA 23’, 下游5’2A GT AAC GGT AC T TAA A T T GT T 23’。扩增mef E 基因片段(1741～2006bp ) 引物序列:上游5’2agg gag at g aaa gaa gga 23’, 下游5’2A TA AAA T GG CAC CGA AA G CCC 23’。引物由上海英骏生物技术有限公司(Invit ro 2gen ) 合成。PCR 总体积为100μL , 内含2. 5mol/L 各dN TP 、250nmol/L 各引物、2. 5U Taq 2Pf u 酶(Ta KaRa ) 、100ng DNA 模板和1×PCR 缓冲液(p H8. 3) 。PCR 参数:94℃5min ; 94℃30s 、54℃30s 、72℃45s (mef E 基因片段) 或60s (ermB 基因片段) ,35个循环;72℃7min 。采用溴乙锭预染的1. 5%琼脂糖凝胶电泳检测PCR 产物, ermB 和

mef E 基因片段目的扩增片段预期大小分别为639

bp 和366bp 。

1. 2. 3　为了核实PCR

物的异性物纯化试剂盒(。按T 2A 克, 将提取ermB 和mef E pMD182T 载体中, 形成重组质粒pMD182T ermB 和pMD182T mef E , 转化入E.

α中扩增后, 采用小量碱变性法提取重组coli D H5

质粒〔9〕, 委托上海Invit rogen 公司测序。

1. 2. 4　药敏试验　采用K 2B 纸片法和E 2test 检测138肺炎链球菌临床菌株对9种抗生素的敏感性。E 2test 法严格按照产品说明书进行操作和判读结果, K 2B 纸片法参照NCCL S 标准判读结果〔12〕。实验中分别采用肺炎链球菌A TCC49619、金黄色葡萄球菌A TCC25923和大肠埃希菌A TCC25922株进行质量控制。1. 3　统计学分析　采用SSPS 11. 0统计软件, 对

ermB 和mef E 基因检测阳性率及耐药率进行χ检验, P

2. 1　ermB 和mef E 基因PCR 检测结果　肺炎链球菌临床菌株的ermB 和mef E 基因PCR 检测效果见图1和图2。138株肺炎链球菌菌株中,91. 3%(126/138) 检出ermB 基因, 33. 3%(46/138) 检出

mef E 基因, 其中38株ermB 和mef E 基因检测结

培养物3000r/min 离心, 取沉淀的菌体用0. 01mol/L 、p H7. 4的磷酸缓冲盐水(PBS ) 洗涤、离心3次后取沉淀。参照细菌基因组DNA 提取试剂盒(BioColor ) 说明书, 提取各菌株基因组DNA 。提取的DNA 溶于Tris 2HCl 2ED TA (TE ) 缓冲液中, 采用紫外分光光度法测定DNA 浓度和纯度〔9〕。1. 2. 2　PCR 　参考GenBank 中登录的ermB 基因(accession No. :AJ 243540) 和mef E 基因(acces 2sion No. :A F274302) 序列及相关文献设计引

果均阳性, ermB 基因携带率(91. 3%) 明显高于mef E 基因(33. 3%) (P

2. 2　ermB 和mef E 基因PCR 产物测序结果　9株肺炎链球菌临床菌株ermB 和mef E 基因片段PCR 产物测序结果见图3和图4。与GenBank 中

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ermB 基因(accession No. :AJ 243540) 和mef E 基

因(accession No. :A F274302) 序列比较, 除引物序列外上述肺炎链球菌临床菌株ermB 和mef E 基因片段核苷酸序列相似性分别为99. 16%～100%和99. 08%～100%

。

2. 3　药敏试验结果　138株肺炎链球菌临床菌株

中, 对红霉素耐药率高达93. 5%(129/138) , 对青霉素、喹奴普达/达福普汀的氯霉素和耐药率为18. 8%～42. 0%,但对头孢噻肟、头孢呋辛、阿莫西林和左氧氟沙星的耐药率较低(2. 9%～4. 3%) , 未发现耐万古霉素菌株(表1) 。

2. 4　ermB 和mef E 基因与红霉素耐药性关系　138株肺炎链球菌临床菌株中, 无ermB 及mef E 基因的所有4株菌株、2株仅含ermB 基因和2株仅含mef E 基因菌株对红霉素敏感, 其余菌株均对红霉素耐药(表2)

。

3　讨　论

　　青霉素是治疗革兰阳性肺炎链球菌感染性疾病的首选药物。由于青霉素可导致严重的药物过敏反应, 作为大环内酯类代表性抗生素的红霉素, 被广泛用于肺炎链球菌感染相关疾病。随着青霉素和红霉素的广泛应用, 临床上相关耐药肺炎链球菌菌株的

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表1　138株肺炎链球菌临床菌株对10种抗菌药物的耐

药率

T able 1　Drug resistant ratios against 10antib acterial drugs of

138S. pneumoniae isolates

药〔10〕。肺炎链球菌mef E 基因是细菌主动外排基

因操纵子元件, 编码一种能量依赖的膜药物外排泵蛋白, 可将14、15元环红霉素等大环内酯类抗生素泵出细菌细胞外, 使细菌产生低水平耐药性〔10211〕。为了解本地区肺炎链球菌临床菌株ermB 和mef E

敏感

抗菌药物红霉素氯霉素

喹奴普达/达福普汀青霉素头孢噻肟头孢呋辛左氧氟沙星阿莫西林维酸万古霉素

株数

(n ) [***********]134138

耐药株数

(n )

敏感率

(%)

耐药率

(%) 93. 5342. 027. 518. 82. 94. 34. 32. 90

5. 858. 072. 581. 297. 195. 795. 797. 1100

[1**********]640

基因携带率, 我们采用PCR 对上述菌株两种目的基因进行了检测, 测序结果表明, 扩增产物确为ermB 或mef E 基因,99. 08%～100%序列相似性提示该两个基因序列极为保守。PCR 结果显示,138株肺炎链球菌临床菌株中, ermB 基因携带率很高(91. 3%) , mef E 基因携带率较低(33. 3%) ,27. 5%菌株(38/138) 同时携带上述两种基因, 表明ermB 基因

是本地区肺炎链球菌临床菌株红霉素耐药相关优势基因(P

　　肺炎链球菌对红霉素耐药机制在不同国家和地区颇有差异。在欧洲和亚洲, 肺炎链球菌对红霉素耐药性主要由ermB 〔526, 13215〕; 在, E 28138株肺炎和mef E 基因携带状态与红, 不携带上述两种基因菌株均对红霉素敏感, 仅携带mef E 基因菌株对红霉素耐药率(62. 5%) 明显低于同时携带两种基因菌株耐药率(100%) 及仅携带ermB 基因菌株耐药率(97. 7%) (P

〔1〕Pihlajamaki M , Kataja J , Seppala H , et al. Ribosomal mutations

in S t reptococcus pneumoniae clinical isolates 〔J 〕. Antimicrob A 2gent s Chemot her , 2002, 46(3) :6542658.

　　3:与其它抗生素比较P

表2　erm B 和me f E 基因与红霉素耐药相关性

T able 2　Correlation among erm B /mef E genes and erythro 2

mycin /clind amycin

靶基因携带与分布

ermB

mef E

红霉素

(n )

株数

(%) 10097. 762. 530

++--

+-+-

8884

0234

388650

　　3:与同时仅携带erm B 基因或同时携带erm B 和mef E 基因菌株比较P

分离率逐年升高〔226〕。在亚洲地区, 肺炎链球菌临床菌株对红霉素耐药现象尤其严重〔4〕, 我国重庆、上海

和青岛等地近年报道的肺炎链球菌对红霉素耐药率高达96. 0%～100%。本研究中, 浙江地区分离的138株肺炎链球菌临床菌株对红霉素耐药率也高达93. 5%(129/138) , 但对青霉素耐药率也为18. 8%, 对阿莫西林、头孢噻肟和头孢呋辛耐药率分

〔526〕

〔2〕Lee N Y , Song J H , K im S , et al. Carriage of antibiotic resistant

Pneumococci among Asian children :a multinational surveillance

by t he Asian Network for Surveillance of Resistant Pat hogens (ANSORP ) 〔J 〕. Clin Infect Dis , 2001, 32(12) :146321468.

别仅为2. 9%、2. 9%和4. 3%, 提示红霉素已不适合作为肺炎链球菌感染性疾病的临床药物β, 2内酰胺类及头孢菌素类可作为临床上治疗肺炎链球菌感染性疾病的一线药物。

　　肺炎链球菌ermB 基因编码红霉素耐药相关核糖体甲基化酶, 该基因通常定位在细菌染色体上, 其转座也通常发生在染色体与染色体之间, 在核糖体甲基化酶作用下, 细菌23SrRNA 第25位腺嘌呤残基N 26位甲基化, 降低了细菌核糖体与红霉素的结合力, 可介导细菌对所有大环内酯类的高水平耐

〔3〕Hogberg L , Henriques 2Normark B , Ringberg H , et al. The im 2

pact of active intervention on t he spread of penicillin 2resistant

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(下转第262页)

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高峰。门诊与住院病例诺如病毒检出率分别为42. 68%和25. 30%, 估计是由于诺如病毒性腹泻症状比轮状病毒性腹泻轻, 住院患者一般症状较重, 轮状病毒检出率高, 诺如病毒检出率低, 在门诊患者中情况则相反。40例1岁以下病毒性腹泻患儿(住院36例、门诊4例) , 诺如病毒的检出率达27. 50%, 住院患儿检出率为27. 78%(10/36) , 虽然未进一步排除轮状病毒、札如病毒、肠道腺病毒等其他肠道病毒感染所致, 但提示诺如病毒乃为本地区婴儿腹泻的重要病原, 在婴幼儿冬春季腹泻临床诊断和治疗中, 除轮状病毒外还应关注诺如病毒感染。　　本研究还显示, 厦门城市与农村地区的病毒性腹泻患者诺如病毒感染无显著性差异, 可能与几年来厦门地区的城市化建设和社会经济的快速发展缩小了城乡居民在生活水平与享有卫生服务之间的差距有关。而厦门岛内的病毒性腹泻患者诺如病毒感染率比岛外的低的研究结果, 则可能与厦门岛内居

民的文化程度、经济条件、个人卫生习惯以及岛内良好的卫生环境、城市基础设施建设、卫生城市管理等有密切关联, 对其影响因素有待进一步研究, 它将有助于科学制定防控策略和更有针对性的防控措施。参考文献:

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收稿日期:20092072; 修回日期:2009212216

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收稿日期:2009212205; 修回日期:[1**********]