蛋白表达及纯化策略
一.目录:
含组氨酸标签的蛋白诱导表达及纯化
GST-融合蛋白的纯白化策略
DEAE纯化蛋白策略
分子筛纯化蛋白策略
二.试剂:
所用试剂均购自上海生工
三.资料来源:
汪德强老师
四.撰写:
罗淼 牛司强
含组氨酸标签的蛋白的诱导表达及纯化
一. 用IPTG诱导启动子在大肠杆菌中表达克隆化基因 所需特殊试剂:1M IPTG
1. 将目的基因与IPTG诱导表达载体连接,构成重组质粒并转化相应的
表达用的大肠杆菌。将转化体铺于含相应抗生素的LB平板,37℃培养过夜。通过酶切序列分析等筛选带有插入片段的转化体。
2. 分别挑取对照菌和重组菌1个菌落,接种于1ml含有相应抗生素的LB
培养液中,37℃通气培养过夜。
3. 取100微升过夜培养物接种于5ml含有相应抗生素的LB培养液中(各
10份),适当的温度(20-37℃)震荡培养4小时,至对数中期(A550
=0.1-1.0)。
4. 对照菌和重组菌各取1ml未经诱导的培养物于离心管中,剩余培养物
中加入IPTG至终浓度分别为0.5,1.0,1.5,2.5,3.0,3.5,4.0,4.5,5.0mM相同的温度继续通气培养。
5. 在诱导的1,2,3,4,5个小时取1ml样品于Ep管中。
细菌的生长速率严重影响外源蛋白的表达,因此必须对接种菌量,诱导前细菌生长时间和诱导后细菌密度进行控制。生长过度或过速会加重细菌合成系统的负担,导致包涵体的形成。生长温度可能是影响大肠杆菌高度表达目的蛋白的最重要因素。低温培养能在一定程度上抑制包涵体的形成。IPTG的浓度对表达水平的影响也非常大。所以通过试验确定最佳的培养条件是很必要的。
6. 将所有样本室温最高速度离心1分钟,弃上清,沉淀重悬于100微升
1×SDS蛋白上样缓冲液中,100℃加热5分钟,室温最高速度离心1分钟,取15微升样品上样于SDS聚丙烯酰胺凝胶,用SDS-PAGE观察表达产物条带,从而确定优化的培养条件。
二. 大量表达靶蛋白
1. 取保存的重组大肠杆菌菌液150微升接种于30毫升含相应抗生素的
LB培养液中,在100毫升锥形瓶中,300rpm,37℃通气过夜培养。
2. 取16毫升过夜培养物接种于800ml含相应抗生素的LB培养液,在2L
的锥形瓶中用预实验所确定的最佳诱导温度,300rpm,通气培养4小时,至对数生长中期。
3. 以预实验确定的最佳IPTG浓度,最佳时间和最佳温度诱导表达靶蛋
白。
4. 收集菌液,4℃,5000g(5500rpm)离心15分钟收集沉淀,-70℃保
存。
三. 细菌破碎和蛋白质溶解
所需特殊试剂:
非变性裂解液:50mM NaH2PO4 ,300 mM Nacl ,10 mM咪唑,pH8.0 超声破碎液:50mM NaH2PO4 ,300 mM Nacl , pH8.0
1. 每200ml菌液离心所得沉淀以10ml非变性裂解液充分重悬,同时加
入蛋白酶抑制剂PMSF至终浓度1mM。
2. 超声破碎细菌,功率选择在稍低于溶液产生泡沫的水平。工作时间5
秒,间隙时间5秒,总时间20分钟(破碎时间一般不宜超过10分钟,菌量不超过1g)。整个超声过程中探头离烧杯底部1厘米为佳,烧杯置于冰浴中。
3. 超声破碎后,取1滴菌液于载玻片上,烤干后用结晶紫染色观察超声
破碎是否完全,大肠杆菌是否被破碎成球状或球杆状。破碎不完全可适当延长超声破碎时间。
4. 将细菌破碎液以10000rpm,30分钟,4℃离心,收集上清。用等同于
上清体积的超声破碎液重悬沉淀。
5. 分别取10微升上清和沉淀重悬液用于SDS-PAGE检测,以确定是包
涵体表达还是上清表达。其余置于-70℃保存。
四. Ni-NTA亲和纯化带组氨酸标签蛋白的纯化策略
(一)若为上清表达
所需特殊试剂:
非变性裂解液: 50mM NaH2PO4 ,300 mM Nacl ,10 mM咪唑,pH8.0 Wash buffer: 50mM NaH2PO4 , 300 mM Nacl ,20 mM咪唑,pH8.0 Elution buffer: 50mM NaH2PO4 ,300 mM Nacl ,250mM咪唑,pH8.0
1. 离心后上清蛋白与Ni-NTA混匀,冰水浴中于脱色摆床上轻摇1小时,
使之充分混匀结合。为了完全去除杂质,离心两次或离心后用0.4微米微孔滤膜过滤。
2. 将混合物转移至层析柱中,让液体自然流出,速度可稍慢(5-6秒/滴),
收集流出液体。可以取样进行SDS-PAGE,看蛋白挂柱情况。
3. 用Wash buffer 洗涤层析柱,洗涤量约为胶体积的50-100倍,以便充
分洗去杂蛋白。为了洗的更彻底,可以把胶混悬后再让液体流出,中间
可以重复数次。因为胶板结之后,洗涤效果可能会差些。
4. 用 Elution buffer 洗柱,用1.5mLEP管收集洗脱液,直至A280
5. 测定收集的洗涤液和洗脱液的A280,选择A280变化明显的管取样进行
SDS-PAGE,分析组氨酸标签蛋白的分布。根据A280和电泳图选择合并A280相近的管,弃掉没有目的蛋白的管。目的蛋白的脱盐处理可以用透析,也可以超滤,还可以过分子筛。如果需要更大的蛋白浓度,可以使用超滤的办法 。收集的蛋白-20℃保存。
说明:只经过Ni-NTA纯化,所得蛋白一般不纯,往往混有杂蛋白。这时可
以考虑进一步的纯化措施,比如DEAE,分子筛,疏水层析等。
(二)若为包涵体表达
所需特殊试剂:
细胞裂解液:50mM Tris-Hcl ,100 mM Nacl ,0.5%Triton X-100, pH 8.0 变性裂解液:10mM NaH2PO4 ,10mM Tris-Hcl,8M尿素,pH8.0 复性液: 100mM NaH2PO4,10mM Tris-Hcl,2 mM还原型谷光甘肽,
0.2 mM氧化型谷光甘肽
Wash buffer: 100mM NaH2PO4,10mM Tris-Hcl,pH6.3
Elution buffer: 100mM NaH2PO4,10mM Tris-Hcl,pH4.5
1. 将沉淀重悬液缓慢冻融离心,去上清,沉淀重悬于9倍体积的4℃细胞裂
解液,每克菌体加入4mg脱氧胆酸,悬液室温放置5分钟,4℃,12000rpm×15分钟。洗涤5次。
2. 每克沉淀重悬于9ml含0.1 mM PMSF,10 mM 2-巯基乙醇,2 mM还原
型谷光甘肽和0.2 mM氧化型谷光甘肽的变性裂解液中,调节pH在10.7,室温放置60分钟。
3. 再用盐酸调pH至8.0,室温放置30分钟。
4. 4℃,12000rpm×15分钟离心,留上清待用。沉淀重悬于100微升1×SDS
蛋白上样缓冲液中。取10微升上清加10微升2×SDS上样缓冲液,上清和沉淀分别进行SDS-PAGE,分析溶解程度。
5. 稀释透析复性:每毫升上清缓慢加入9毫升6M尿素的复性液中。装入
经10 mM NaOH和1.0 mM EDTA煮沸30分钟,蒸馏水洗涤干净的透析袋中。在4℃ 10倍以上体积含有2M尿素的复性液中透析5个小时。
6. 取出透析袋,再放入4℃ 10倍以上体积的复性液中透析过夜。
7. 取出透析袋中的蛋白,测定其A280,加入相应体积的Ni-NTA树脂混匀,
按与上清纯化相同的方法上柱纯化,但是Wash buffer和 Elution buffer用包涵体纯化的pH递减的缓冲液。
五.Ni-NTA 树脂的再生(Qiagen公司)
当Ni-NTA琼脂糖的颜色由浅蓝色变成灰褐色,此时Ni-NTA树脂需要再生后才能使用。
所需试剂:
再生缓冲液:6M盐酸胍+0.2M乙酸
2%SDS(m/V)
25%,30%,50%,75%的乙醇(V/V)
100mM EDTA,pH8.0
100mM NiSO4
裂解缓冲液A:
10mM NaH2PO4 +10mM Tris-Hcl +6M盐酸胍, pH8.0
裂解缓冲液B:
10mM NaH2PO4 +10mM Tris-Hcl +8M尿素,pH8.0
步骤如下:
1. 用下列试剂依次彻底冲洗层析柱:
2倍柱体积的再生缓冲液
5倍柱体积的双蒸水
3倍柱体积的2%SDS
1倍柱体积的25%的乙醇
1倍柱体积的50%的乙醇
1倍柱体积的75%的乙醇
5倍柱体积的100%的乙醇
经10 mM NaOH和1.0 mM EDTA煮沸30分钟,蒸馏水洗涤干净的透析袋中。在4℃ 10倍以上体积含有2M尿素的复性液中透析5个小时。
6. 取出透析袋,再放入4℃ 10倍以上体积的复性液中透析过夜。
7. 取出透析袋中的蛋白,测定其A280,加入相应体积的Ni-NTA树脂混匀,
按与上清纯化相同的方法上柱纯化,但是Wash buffer和 Elution buffer用包涵体纯化的pH递减的缓冲液。
五.Ni-NTA 树脂的再生(Qiagen公司)
当Ni-NTA琼脂糖的颜色由浅蓝色变成灰褐色,此时Ni-NTA树脂需要再生后才能使用。
所需试剂:
再生缓冲液:6M盐酸胍+0.2M乙酸
2%SDS(m/V)
25%,30%,50%,75%的乙醇(V/V)
100mM EDTA,pH8.0
100mM NiSO4
裂解缓冲液A:
10mM NaH2PO4 +10mM Tris-Hcl +6M盐酸胍, pH8.0
裂解缓冲液B:
10mM NaH2PO4 +10mM Tris-Hcl +8M尿素,pH8.0
步骤如下:
1. 用下列试剂依次彻底冲洗层析柱:
2倍柱体积的再生缓冲液
5倍柱体积的双蒸水
3倍柱体积的2%SDS
1倍柱体积的25%的乙醇
1倍柱体积的50%的乙醇
1倍柱体积的75%的乙醇
5倍柱体积的100%的乙醇
1倍柱体积的75%的乙醇
1倍柱体积的50%的乙醇
1倍柱体积的25%的乙醇
1倍柱体积的双蒸水
5倍柱体积的100mM EDTA
1倍柱体积的双蒸水
2倍柱体积的100mM NiSO4
2倍柱体积的双蒸水
2倍柱体积的再生缓冲液
2. 2倍柱体积的适当的裂解缓冲液(A或B)平衡Ni-NTA树脂
3. 将再生后的Ni-NTA树脂按1:1的比例保存在30%的乙醇中
GST-融合蛋白的纯化策略
所需特殊试剂:
PBS :140mM Nacl ,2.7mM Kcl ,10mM Na2HPO4,1.8mM KH2PO4
Elution buffer : 10 mM Glutathione ,50mM Tris-Hcl,pH8.0
1. 离心后上清加入预先用PBS平衡的400微升Glutathione-Sepharose-4B,
冰水浴中于脱色摆床上轻摇1小时,使之充分混匀结合。
2. 将混合物转移至层析柱中,让液体自然流出,速度可稍慢(5-6秒/滴),
收集流出液体。可以取样进行SDS-PAGE,看蛋白挂柱情况。
3. 用PBS洗涤层析柱,洗涤量约为胶体积的50-100倍,以便充分洗去杂
蛋白。为了洗的更彻底,可以把胶混悬后再让液体流出,中间可以重复数次。因为胶板结之后,洗涤效果可能会差些。
4. 用Elution buffer 洗柱,用1.5mLEP管收集洗脱液,直至A280
5. 测定收集的洗涤液和洗脱液的A280,选择A280变化明显的管取样进行
SDS-PAGE,分析目的蛋白的分布。根据A280和电泳图选择合并A280相近的管,弃掉没有目的蛋白的管。目的蛋白的脱盐处理可以用透析,也可以超滤,还可以过分子筛。如果需要更大的蛋白浓度,可以使用超滤
的办法。收集的蛋白-20℃保存。
说明:只经过GST纯化,所得蛋白一般不纯,往往混有杂蛋白。这时可以
考虑进一步的纯化措施,比如DEAE,分子筛,疏水层析等。
DEAE纯化蛋白策略
1. 平衡。在纯化之前,确保离子交换胶床已被平衡。通常用pH8.0的
20mM Tris-Hcl冲洗柱子3-5个柱体积,冲洗速度可以适当快些,比如30-50毫升/小时,直至达到平衡。缓冲液pH要求高于目的蛋白等电点2个左右pH单位。如果某一目的蛋白的等电点为6.5,这时选择pH8.5的
20mM Tris-Hcl缓冲液更为合适。
2. 上样。要求蛋白样品的离子浓度最好低于15 mM,缓冲液pH高于目的蛋
白等电点2个左右pH单位,缓慢上样,便于目的蛋白更好的和胶结合。打开蛋白检测系统,在层析图谱上观察上样情况。上样完毕后,用pH8.0的20mM Tris-Hcl冲洗柱子2-3个柱体积,在层析图谱上表现为回到基线位置。上样后的穿过液取样电泳,分析目的蛋白的挂柱情况。同时保存好穿过液,以备挂不上柱子可以再利用。
3. 洗脱。选择合适的Nacl浓度梯度来洗脱,通常用0-500 mM Nacl。如果目
的蛋白还没有洗脱干净,则选择更高浓度的Nacl。洗脱缓冲液一般用pH8.0的20mM Tris-Hcl。用收集器收集,6分钟/管(约4-5毫升/管),收集100管。同时在层析图谱上观察洗脱峰的情况。
4. 根据层析图谱上的洗脱峰,取样进行SDS-PAGE,确定目的蛋白所在的管
和纯度。选择收集目的蛋白纯度和浓度较好的管,超滤浓缩脱盐。如果纯度还是不好,则考虑其它的方法进一步纯化,比如疏水层析,分子筛等。
5. 再生。依次用0.1M Hcl、ddH2O、0.1M NaOH、ddH2O、1MNacl、ddH2O
和pH8.0的20 mMTris-Hcl洗柱,每次洗的体积至少为柱体积的3倍,ddH2O洗至少5倍。
6. 贮存。一般放在4℃。长时间贮存,建议将胶用20%的乙醇贮存于4℃。
分子筛纯化蛋白策略
1. 平衡。在纯化之前,确保离子交换胶床已被平衡。通常用pH8.0的
20mM Tris-Hcl冲洗柱子3-5个柱体积,保持流速1滴/10秒,直至达到平衡。
2. 上样。上样前一般要先离心4℃,12000rpm×15分钟,去除杂质成分,防止
杂质成分进入柱子而造成堵塞。上样量不能大于10%柱床体积,最好小于5%柱床体积,一般上样量为1-2毫升。上样时由玻棒引流沿管壁加入到凝胶床面上,注意不要将床面凝胶冲起。控制流速1滴/20秒。控制凝胶床界面不能脱水,并控制样品区带尽量狭窄。等到上样刚刚完时再洗脱,一定注意不要让柱子脱水干燥。否则,柱子干了就只有重装。
3. 洗脱。用pH8.0的20 mMTris-Hcl缓冲液洗脱,用部分收集器收集,4分钟/
管(约2-3毫升/管),收集约1-30管。同时在层析图谱上观察洗脱峰情况。
4. 根据层析图谱上的洗脱峰,取样进行SDS-PAGE,确定目的蛋白所在的管
和纯度。选择收集目的蛋白纯度和浓度较好的管,超滤浓缩脱盐。如果纯度还是不好,则考虑其它的方法进一步纯化,比如疏水层析,DEAE等。
5. 柱子处理。用pH8.0的20 mMTris-Hcl缓冲液冲洗柱子3-5个柱体积,去除
杂质。
6. 贮存。长时间贮存,建议将胶用20%的乙醇贮存于4℃。
蛋白表达及纯化策略
一.目录:
含组氨酸标签的蛋白诱导表达及纯化
GST-融合蛋白的纯白化策略
DEAE纯化蛋白策略
分子筛纯化蛋白策略
二.试剂:
所用试剂均购自上海生工
三.资料来源:
汪德强老师
四.撰写:
罗淼 牛司强
含组氨酸标签的蛋白的诱导表达及纯化
一. 用IPTG诱导启动子在大肠杆菌中表达克隆化基因 所需特殊试剂:1M IPTG
1. 将目的基因与IPTG诱导表达载体连接,构成重组质粒并转化相应的
表达用的大肠杆菌。将转化体铺于含相应抗生素的LB平板,37℃培养过夜。通过酶切序列分析等筛选带有插入片段的转化体。
2. 分别挑取对照菌和重组菌1个菌落,接种于1ml含有相应抗生素的LB
培养液中,37℃通气培养过夜。
3. 取100微升过夜培养物接种于5ml含有相应抗生素的LB培养液中(各
10份),适当的温度(20-37℃)震荡培养4小时,至对数中期(A550
=0.1-1.0)。
4. 对照菌和重组菌各取1ml未经诱导的培养物于离心管中,剩余培养物
中加入IPTG至终浓度分别为0.5,1.0,1.5,2.5,3.0,3.5,4.0,4.5,5.0mM相同的温度继续通气培养。
5. 在诱导的1,2,3,4,5个小时取1ml样品于Ep管中。
细菌的生长速率严重影响外源蛋白的表达,因此必须对接种菌量,诱导前细菌生长时间和诱导后细菌密度进行控制。生长过度或过速会加重细菌合成系统的负担,导致包涵体的形成。生长温度可能是影响大肠杆菌高度表达目的蛋白的最重要因素。低温培养能在一定程度上抑制包涵体的形成。IPTG的浓度对表达水平的影响也非常大。所以通过试验确定最佳的培养条件是很必要的。
6. 将所有样本室温最高速度离心1分钟,弃上清,沉淀重悬于100微升
1×SDS蛋白上样缓冲液中,100℃加热5分钟,室温最高速度离心1分钟,取15微升样品上样于SDS聚丙烯酰胺凝胶,用SDS-PAGE观察表达产物条带,从而确定优化的培养条件。
二. 大量表达靶蛋白
1. 取保存的重组大肠杆菌菌液150微升接种于30毫升含相应抗生素的
LB培养液中,在100毫升锥形瓶中,300rpm,37℃通气过夜培养。
2. 取16毫升过夜培养物接种于800ml含相应抗生素的LB培养液,在2L
的锥形瓶中用预实验所确定的最佳诱导温度,300rpm,通气培养4小时,至对数生长中期。
3. 以预实验确定的最佳IPTG浓度,最佳时间和最佳温度诱导表达靶蛋
白。
4. 收集菌液,4℃,5000g(5500rpm)离心15分钟收集沉淀,-70℃保
存。
三. 细菌破碎和蛋白质溶解
所需特殊试剂:
非变性裂解液:50mM NaH2PO4 ,300 mM Nacl ,10 mM咪唑,pH8.0 超声破碎液:50mM NaH2PO4 ,300 mM Nacl , pH8.0
1. 每200ml菌液离心所得沉淀以10ml非变性裂解液充分重悬,同时加
入蛋白酶抑制剂PMSF至终浓度1mM。
2. 超声破碎细菌,功率选择在稍低于溶液产生泡沫的水平。工作时间5
秒,间隙时间5秒,总时间20分钟(破碎时间一般不宜超过10分钟,菌量不超过1g)。整个超声过程中探头离烧杯底部1厘米为佳,烧杯置于冰浴中。
3. 超声破碎后,取1滴菌液于载玻片上,烤干后用结晶紫染色观察超声
破碎是否完全,大肠杆菌是否被破碎成球状或球杆状。破碎不完全可适当延长超声破碎时间。
4. 将细菌破碎液以10000rpm,30分钟,4℃离心,收集上清。用等同于
上清体积的超声破碎液重悬沉淀。
5. 分别取10微升上清和沉淀重悬液用于SDS-PAGE检测,以确定是包
涵体表达还是上清表达。其余置于-70℃保存。
四. Ni-NTA亲和纯化带组氨酸标签蛋白的纯化策略
(一)若为上清表达
所需特殊试剂:
非变性裂解液: 50mM NaH2PO4 ,300 mM Nacl ,10 mM咪唑,pH8.0 Wash buffer: 50mM NaH2PO4 , 300 mM Nacl ,20 mM咪唑,pH8.0 Elution buffer: 50mM NaH2PO4 ,300 mM Nacl ,250mM咪唑,pH8.0
1. 离心后上清蛋白与Ni-NTA混匀,冰水浴中于脱色摆床上轻摇1小时,
使之充分混匀结合。为了完全去除杂质,离心两次或离心后用0.4微米微孔滤膜过滤。
2. 将混合物转移至层析柱中,让液体自然流出,速度可稍慢(5-6秒/滴),
收集流出液体。可以取样进行SDS-PAGE,看蛋白挂柱情况。
3. 用Wash buffer 洗涤层析柱,洗涤量约为胶体积的50-100倍,以便充
分洗去杂蛋白。为了洗的更彻底,可以把胶混悬后再让液体流出,中间
可以重复数次。因为胶板结之后,洗涤效果可能会差些。
4. 用 Elution buffer 洗柱,用1.5mLEP管收集洗脱液,直至A280
5. 测定收集的洗涤液和洗脱液的A280,选择A280变化明显的管取样进行
SDS-PAGE,分析组氨酸标签蛋白的分布。根据A280和电泳图选择合并A280相近的管,弃掉没有目的蛋白的管。目的蛋白的脱盐处理可以用透析,也可以超滤,还可以过分子筛。如果需要更大的蛋白浓度,可以使用超滤的办法 。收集的蛋白-20℃保存。
说明:只经过Ni-NTA纯化,所得蛋白一般不纯,往往混有杂蛋白。这时可
以考虑进一步的纯化措施,比如DEAE,分子筛,疏水层析等。
(二)若为包涵体表达
所需特殊试剂:
细胞裂解液:50mM Tris-Hcl ,100 mM Nacl ,0.5%Triton X-100, pH 8.0 变性裂解液:10mM NaH2PO4 ,10mM Tris-Hcl,8M尿素,pH8.0 复性液: 100mM NaH2PO4,10mM Tris-Hcl,2 mM还原型谷光甘肽,
0.2 mM氧化型谷光甘肽
Wash buffer: 100mM NaH2PO4,10mM Tris-Hcl,pH6.3
Elution buffer: 100mM NaH2PO4,10mM Tris-Hcl,pH4.5
1. 将沉淀重悬液缓慢冻融离心,去上清,沉淀重悬于9倍体积的4℃细胞裂
解液,每克菌体加入4mg脱氧胆酸,悬液室温放置5分钟,4℃,12000rpm×15分钟。洗涤5次。
2. 每克沉淀重悬于9ml含0.1 mM PMSF,10 mM 2-巯基乙醇,2 mM还原
型谷光甘肽和0.2 mM氧化型谷光甘肽的变性裂解液中,调节pH在10.7,室温放置60分钟。
3. 再用盐酸调pH至8.0,室温放置30分钟。
4. 4℃,12000rpm×15分钟离心,留上清待用。沉淀重悬于100微升1×SDS
蛋白上样缓冲液中。取10微升上清加10微升2×SDS上样缓冲液,上清和沉淀分别进行SDS-PAGE,分析溶解程度。
5. 稀释透析复性:每毫升上清缓慢加入9毫升6M尿素的复性液中。装入
经10 mM NaOH和1.0 mM EDTA煮沸30分钟,蒸馏水洗涤干净的透析袋中。在4℃ 10倍以上体积含有2M尿素的复性液中透析5个小时。
6. 取出透析袋,再放入4℃ 10倍以上体积的复性液中透析过夜。
7. 取出透析袋中的蛋白,测定其A280,加入相应体积的Ni-NTA树脂混匀,
按与上清纯化相同的方法上柱纯化,但是Wash buffer和 Elution buffer用包涵体纯化的pH递减的缓冲液。
五.Ni-NTA 树脂的再生(Qiagen公司)
当Ni-NTA琼脂糖的颜色由浅蓝色变成灰褐色,此时Ni-NTA树脂需要再生后才能使用。
所需试剂:
再生缓冲液:6M盐酸胍+0.2M乙酸
2%SDS(m/V)
25%,30%,50%,75%的乙醇(V/V)
100mM EDTA,pH8.0
100mM NiSO4
裂解缓冲液A:
10mM NaH2PO4 +10mM Tris-Hcl +6M盐酸胍, pH8.0
裂解缓冲液B:
10mM NaH2PO4 +10mM Tris-Hcl +8M尿素,pH8.0
步骤如下:
1. 用下列试剂依次彻底冲洗层析柱:
2倍柱体积的再生缓冲液
5倍柱体积的双蒸水
3倍柱体积的2%SDS
1倍柱体积的25%的乙醇
1倍柱体积的50%的乙醇
1倍柱体积的75%的乙醇
5倍柱体积的100%的乙醇
经10 mM NaOH和1.0 mM EDTA煮沸30分钟,蒸馏水洗涤干净的透析袋中。在4℃ 10倍以上体积含有2M尿素的复性液中透析5个小时。
6. 取出透析袋,再放入4℃ 10倍以上体积的复性液中透析过夜。
7. 取出透析袋中的蛋白,测定其A280,加入相应体积的Ni-NTA树脂混匀,
按与上清纯化相同的方法上柱纯化,但是Wash buffer和 Elution buffer用包涵体纯化的pH递减的缓冲液。
五.Ni-NTA 树脂的再生(Qiagen公司)
当Ni-NTA琼脂糖的颜色由浅蓝色变成灰褐色,此时Ni-NTA树脂需要再生后才能使用。
所需试剂:
再生缓冲液:6M盐酸胍+0.2M乙酸
2%SDS(m/V)
25%,30%,50%,75%的乙醇(V/V)
100mM EDTA,pH8.0
100mM NiSO4
裂解缓冲液A:
10mM NaH2PO4 +10mM Tris-Hcl +6M盐酸胍, pH8.0
裂解缓冲液B:
10mM NaH2PO4 +10mM Tris-Hcl +8M尿素,pH8.0
步骤如下:
1. 用下列试剂依次彻底冲洗层析柱:
2倍柱体积的再生缓冲液
5倍柱体积的双蒸水
3倍柱体积的2%SDS
1倍柱体积的25%的乙醇
1倍柱体积的50%的乙醇
1倍柱体积的75%的乙醇
5倍柱体积的100%的乙醇
1倍柱体积的75%的乙醇
1倍柱体积的50%的乙醇
1倍柱体积的25%的乙醇
1倍柱体积的双蒸水
5倍柱体积的100mM EDTA
1倍柱体积的双蒸水
2倍柱体积的100mM NiSO4
2倍柱体积的双蒸水
2倍柱体积的再生缓冲液
2. 2倍柱体积的适当的裂解缓冲液(A或B)平衡Ni-NTA树脂
3. 将再生后的Ni-NTA树脂按1:1的比例保存在30%的乙醇中
GST-融合蛋白的纯化策略
所需特殊试剂:
PBS :140mM Nacl ,2.7mM Kcl ,10mM Na2HPO4,1.8mM KH2PO4
Elution buffer : 10 mM Glutathione ,50mM Tris-Hcl,pH8.0
1. 离心后上清加入预先用PBS平衡的400微升Glutathione-Sepharose-4B,
冰水浴中于脱色摆床上轻摇1小时,使之充分混匀结合。
2. 将混合物转移至层析柱中,让液体自然流出,速度可稍慢(5-6秒/滴),
收集流出液体。可以取样进行SDS-PAGE,看蛋白挂柱情况。
3. 用PBS洗涤层析柱,洗涤量约为胶体积的50-100倍,以便充分洗去杂
蛋白。为了洗的更彻底,可以把胶混悬后再让液体流出,中间可以重复数次。因为胶板结之后,洗涤效果可能会差些。
4. 用Elution buffer 洗柱,用1.5mLEP管收集洗脱液,直至A280
5. 测定收集的洗涤液和洗脱液的A280,选择A280变化明显的管取样进行
SDS-PAGE,分析目的蛋白的分布。根据A280和电泳图选择合并A280相近的管,弃掉没有目的蛋白的管。目的蛋白的脱盐处理可以用透析,也可以超滤,还可以过分子筛。如果需要更大的蛋白浓度,可以使用超滤
的办法。收集的蛋白-20℃保存。
说明:只经过GST纯化,所得蛋白一般不纯,往往混有杂蛋白。这时可以
考虑进一步的纯化措施,比如DEAE,分子筛,疏水层析等。
DEAE纯化蛋白策略
1. 平衡。在纯化之前,确保离子交换胶床已被平衡。通常用pH8.0的
20mM Tris-Hcl冲洗柱子3-5个柱体积,冲洗速度可以适当快些,比如30-50毫升/小时,直至达到平衡。缓冲液pH要求高于目的蛋白等电点2个左右pH单位。如果某一目的蛋白的等电点为6.5,这时选择pH8.5的
20mM Tris-Hcl缓冲液更为合适。
2. 上样。要求蛋白样品的离子浓度最好低于15 mM,缓冲液pH高于目的蛋
白等电点2个左右pH单位,缓慢上样,便于目的蛋白更好的和胶结合。打开蛋白检测系统,在层析图谱上观察上样情况。上样完毕后,用pH8.0的20mM Tris-Hcl冲洗柱子2-3个柱体积,在层析图谱上表现为回到基线位置。上样后的穿过液取样电泳,分析目的蛋白的挂柱情况。同时保存好穿过液,以备挂不上柱子可以再利用。
3. 洗脱。选择合适的Nacl浓度梯度来洗脱,通常用0-500 mM Nacl。如果目
的蛋白还没有洗脱干净,则选择更高浓度的Nacl。洗脱缓冲液一般用pH8.0的20mM Tris-Hcl。用收集器收集,6分钟/管(约4-5毫升/管),收集100管。同时在层析图谱上观察洗脱峰的情况。
4. 根据层析图谱上的洗脱峰,取样进行SDS-PAGE,确定目的蛋白所在的管
和纯度。选择收集目的蛋白纯度和浓度较好的管,超滤浓缩脱盐。如果纯度还是不好,则考虑其它的方法进一步纯化,比如疏水层析,分子筛等。
5. 再生。依次用0.1M Hcl、ddH2O、0.1M NaOH、ddH2O、1MNacl、ddH2O
和pH8.0的20 mMTris-Hcl洗柱,每次洗的体积至少为柱体积的3倍,ddH2O洗至少5倍。
6. 贮存。一般放在4℃。长时间贮存,建议将胶用20%的乙醇贮存于4℃。
分子筛纯化蛋白策略
1. 平衡。在纯化之前,确保离子交换胶床已被平衡。通常用pH8.0的
20mM Tris-Hcl冲洗柱子3-5个柱体积,保持流速1滴/10秒,直至达到平衡。
2. 上样。上样前一般要先离心4℃,12000rpm×15分钟,去除杂质成分,防止
杂质成分进入柱子而造成堵塞。上样量不能大于10%柱床体积,最好小于5%柱床体积,一般上样量为1-2毫升。上样时由玻棒引流沿管壁加入到凝胶床面上,注意不要将床面凝胶冲起。控制流速1滴/20秒。控制凝胶床界面不能脱水,并控制样品区带尽量狭窄。等到上样刚刚完时再洗脱,一定注意不要让柱子脱水干燥。否则,柱子干了就只有重装。
3. 洗脱。用pH8.0的20 mMTris-Hcl缓冲液洗脱,用部分收集器收集,4分钟/
管(约2-3毫升/管),收集约1-30管。同时在层析图谱上观察洗脱峰情况。
4. 根据层析图谱上的洗脱峰,取样进行SDS-PAGE,确定目的蛋白所在的管
和纯度。选择收集目的蛋白纯度和浓度较好的管,超滤浓缩脱盐。如果纯度还是不好,则考虑其它的方法进一步纯化,比如疏水层析,DEAE等。
5. 柱子处理。用pH8.0的20 mMTris-Hcl缓冲液冲洗柱子3-5个柱体积,去除
杂质。
6. 贮存。长时间贮存,建议将胶用20%的乙醇贮存于4℃。