DOI:10.13218/j.cnki.csdc.2012.03.017
第42卷第3期2012年6月
ChinaSurfactantDetergent＆Cosmetics
日用化学工业
Vol．42No．3June2012
碱性蛋白酶活力分析方法研究
张
剑，赵雷敏，康林霞
太原030006）
（山西大学化学化工学院，山西
摘要：通过福林法对液体碱性蛋白酶的活力进行了测定。研究比较了不同温度及pH下的酶促反应对酶活力测定方法40～50℃时相对较稳定；pH降低对碱性蛋白酶活力结果显示：酶活力随反应温度的升高表现为先上升后下降，的影响，
有着负面影响。在确定出较优的适合碱性蛋白酶的活力测定方法后，进一步测试了该方法在液体洗涤剂酶活力测定中发现在洗涤剂中简单地加入酶制剂后，测定酶活力时会出现较大偏差，酶活力值不稳定。因此，在配制加酶液体的应用，
pH以及洗涤剂中各种成分与酶的相互影响等进行综合考虑。洗涤剂时，应该对各种因素，例如温度、关键词：蛋白酶；活力分析；福林法；液体洗涤剂
+
中图分类号：TQ925.2
文献标识码：A文章编号：1001－1803（2012）03－0192－04
Studyonalkalineproteaseactivityassay
ZHANGJian，ZHAOLei－min，KANGLin－xia
（CollegeofChemistryandChemicalEngineering，ShanxiUniversity，Taiyuan，Shanxi030006，China）
Abstract：ActivityofliquidalkalineproteasewasmeasuredbyusingFolinmethod．EffectsofenzymaticreactionunderdifferenttemperatureanddifferentpHontheenzymeactivityassaywereinvestigatedandcompared．Resultsshowedthatasthereactiontemperatureraises，theenzymeactivityincreasesfirstlyandthendeclines；whileloweringofthepHofthereactionshowsnegativeimpactofthealkalineproteaseactivity．Aftertheoptimumconditionsforalkalineproteaseactivityassaywereidentified，theapplicationoftheassaymethodinthedeterminationofenzymeactivityofenzymedliquiddetergentwasfurthertested．Itwasdiscoveredthatiftheenzymewassimplyaddedandmixedwiththeliquiddetergent，themeasuredenzymeactivityofthedetergentwillappearbigdeviationandanunstablevalue．Thisphenomenonindicatedthatduringtheformulationofenzymedliquiddetergent，manyfactorssuchasthetemperature，pH，andthemutualinfluenceofcomponentsinthedetergentshouldbecomprehensivelyconsidered．Keywords：protease；proteaseactivityassay；Folinmethod；liquiddetergent酶由生物体中的活细胞经过各种生理活动产生，
是一种具有催化作用的物质。蛋白酶类制剂是最早也是得到最广泛使用的洗涤剂酶品种
［1］
值是研究酶的特性及其应用的先决条件。早期文献
中，酶的活性以任意各种形式来表示，如吸光度的变化、还原基团的增加，以mg或μg表示的被转化底物
30min）的质量。这些参数和各种时间单位（如1min，相关联。1961年世界生物化学协会酶学委员会用国
际单位U来定义酶的活性，定义为在一定的标准条件1U即每分钟催化1mol底物的酶量［4］。有关酶基下，
本的国际单位（SI），世界临床化学家协会数量和单位
katal，委员会定义了一个基本单位，定义为在测定体系每秒钟催化1mol底物的催化转化反应速率所需中，
要的酶的数量，但这个单位并不常用。由于许多实际的原因，对于许多酶反应的监控并不能够完全通过消
，主要应用于衣
物洗涤剂和洗碗机专用洗涤剂中。蛋白酶能够促进去
除衣领和袜子附着的皮肤角质层污渍、血渍、人体分泌物和含蛋白质的食物渍，而且衣物上蛋白质黏附的其他污垢，在蛋白污垢被分解的同时也随之脱落
［2］
。现
在洗涤剂中使用的蛋白酶，主要为碱性蛋白酶。碱性蛋白酶是指在pH为碱性的条件下水解蛋白质肽键的其最适pH一般在9～11这一区间，属内肽酶中酶类，
［3］
的丝氨酸蛋白水解酶类。
蛋白酶制剂作为一种生物催化剂，测定其酶活力
收稿日期：2012－03－09；修回日期：2012－05－19
E－mail：zhangjian0923@vip．sina．com。作者简介：张剑（1967－），女，教授，博士，电话：[1**********]，
·192·
第3期张剑，等：碱性蛋白酶活力分析方法研究
开发与应用
耗的底物或生成的产物的化学计量来实现。因此，迄
今为止国际上碱性蛋白酶活力的测定，尚无一个统一的评价方法和单位，这也间接地影响到了碱性蛋白酶在工业界的进一步推广和使用。
作者通过福林法测定酶活力，具体步骤是在测定酶活力之前，先用福林酚试剂与已知的不同浓度的酪氨酸反应，以吸光度为横坐标，以酪氨酸浓度为纵坐标，得到标准曲线，然后将酶和底物反应的产物与福林测其吸光度，再在标准曲线上推算出相当酚试剂作用，
于多大浓度的酪氨酸，计算出酶活力单位。在测定酶活力实验完成后，探究反应条件对酶活力的影响：将酶促反应的温度分别设置到等间距温度，采用相同方法测定酶活力的相对大小，从而测出蛋白酶最适反应温
亦度；接着将酶促反应的pH分别设置在等间隔数值，采用相同方法测定不同pH下酶活力的大小，即可求
［5］
得蛋白酶最适pH。并进一步探索了该方法在液体洗涤剂酶活力测试中的具体应用。以期今后在对碱性蛋白酶进行活力测定时能快速择出最佳测试手段，从而可提升以后测定过程的准确性并为碱性蛋白酶在工业中的使用提供有效依据。
pH=10.5的缓冲溶液：c液为称取硼酸钠（硼砂）1.908g，加水溶解并定容至100mL；d液为称取氢氧化钠0.4g，加水溶解并定容至100mL。使用液：取c
d液40mL，液50mL，混匀，用水稀释至100mL。酶溶液：取1.0mL液体蛋白酶加入100mL容量
瓶中，用pH=10.5的缓冲液稀释至刻度，摇匀，再从中取1.0mL溶液加入100mL容量瓶中，用同此pH的缓冲液稀释至刻度，摇匀，在室温下放置1h，即为稀释100×100倍的酶液。在做pH影响的试验中，酶液应该选用所需的pH缓冲液稀释。
蛋白溶液：称取0.5g酪蛋白，在研钵中碾碎，磁定容至100mL。储存于力加热搅拌直到完全溶解，4℃冰箱内（有效期通常为3d，最好是现配现用）。碳酸钠溶液：称取无水碳酸钠4.24g，用水溶解并
－1
定容至100mL，即为0.4mol·L的碳酸钠溶液。
1.3分析测定
经查阅文献，得知酶促反应结束后溶液最大吸收波长为680nm。1.3.1
吸光常数测定
称取1g酪氨酸（预先在105℃烘箱内烘至恒
－1
以1mol·L的盐酸溶解后定容到100mL，再用量），
－1
水稀释100倍，即得到100mg·L的酪氨酸溶液。按照表2所示配制出质量浓度（ρ）梯度系列标准液。
表2
Tab.2
编号
123456
gradient
V（酪氨酸）/mL
0.51.01.52.02.5
V（水）/mL
5
4.54.03.53.02.5
－1
ρ/（mg·L）
1
1.1
实验部分
仪器与试剂
UV－2602型紫外可见分光光度计，尤尼柯（上海）仪器有限公司；Z－561型电热恒温水浴锅，上海胜启仪器仪表有限公司；AL204分析天平，梅特勒－托利多仪器（上海）有限公司。碱性蛋白酶，市售；福林酚试剂，上海荔达生物科技有限公司；洗衣液1和洗衣液2，均为市售；无水碳酸钠（AR）、三氯乙酸（AR）、四硼酸钠（AR）、氢氧化钠（AR）、磷酸二氢钠（AR）、磷酸氢L－酪氨酸二钠（AR）、盐酸（AR）、干酪素（BR）、（BR），均为市售。
酪氨酸质量浓度梯度系列标准液
Seriesofstandardsolutionoftyrosinemassconcentration
1020304050
1.2溶液的配制
Na2HPO4－NaH2PO4缓冲溶液：按表1所示配方
1.3.2
蛋白酶活力测定
福林法：取4支试管，每管中加入酶液1mL，第1
－1
配制，a为0.2mol·L的Na2HPO4溶液，b为
管作为对照（在同样条件下，将酶以外的种种因素所引起的变化，如底物、试剂等本身所产生的颜色称为空，白，在此时用管调节分光光度计的吸光度为“0”使其他3管在分光光度计上读得的吸光度值直接代表酶的
0.2mol·L－1的NaH2PO4溶液。
表1Tab.1pH6.06.57.07.58.0
缓冲溶液配方Va/mL12.331.561.084.05.3
Vb/mL87.768.539.016.094.7
Buffersolutionformulation
－1
活力）。在第1支试管中加入0.4mol·L的三氯乙酸溶液2mL，使酶在没有遇到底物时已失去活性。在
4支试管内各加入1mL酪蛋白溶液（pH=7），将4支试管同时放入40℃水浴准确保温10min。
－1
向另外3支试管内分别加入0.4mol·L的三氯乙酸溶液2mL，充分摇匀，使反应停止，过滤，除去沉
·193·
开发与应用
淀的酶蛋白和酪蛋白。
日用化学工业
第42卷
从每一支反应完毕的试管中取滤液1mL分别注
－1
入4支新试管中，各管加入0.4mol·L的碳酸钠溶液5mL，混匀后室温放置10min；然后在各试管中加入福林酚试剂1mL，每滴加一滴试剂必须立即混匀，在40℃水浴保温20min显色，用分光光度计在之前所查阅最大吸收波长处读取吸光度。1.3.3
酶活力计算
蛋白酶活力计算公式如下：
酶活力单位=A·K·4/10·N
表3。从表3中可以看出，酶活力随反应温度的升高
40℃时达到最大，表现为先增大后下降，随后开始下降；40～50℃呈现基本稳定状态，之后较大幅度下降。
表3
Tab.3
t/℃[1**********]0
试管1
0.3210.3460.5130.4980.3650.216
温度对酶活力的影响A
试管20.3160.3570.4940.4870.3730.199
试管30.3280.3640.5040.5010.3730.205
平均值0.3220.3560.5030.4950.3700.207
Effectoftemperatureonenzymeactivity
酶活力/U146345.47161814.11228844.88225356.85168486.8594025.07
式中A为吸光度读数，计算时可用平均值；K表示A=1时酪氨酸微克数，即在酪氨酸标准曲线上取100μg时的A值，用100除以A值，即得K值；4/10表
1mL酪蛋示因酶活力测定总量为4mL（1mL酶液、
2mL三氯乙酸），白、而显色测得时为1mL溶液，所以
10是由于酶反应时间为10min，应乘以4，而计算酶活力单位是以每分钟计算的，故应除以10；N为酶的稀
释倍数，此次试验为10000。
以酶促反应温度为横坐标，将吸光度代表酶活力
绘制酶活力趋势曲线，如图2所示
。值为纵坐标，
2
2.1
结果与讨论
L－酪氨酸标准曲线的绘制
分别测定酪氨酸质量浓度梯度标准溶液的吸光
度，以A为横坐标，ρ为纵坐标，绘制标准曲线，结果如图1所示
。
Fig.2
图2反应温度对酶活力的影响
Influenceofreactiontemperatureonenzymeactivity
由图2可知，在40～50℃内，蛋白酶活力呈现较
与表3中数据吻合。证明此种液体碱性蛋白酶大值，
的最佳作用温度在40～50℃内。
2.3反应pH对蛋白酶活力的影响
pH分别设置在将酶促反应的温度固定为40℃，6.0，6.5，7.0，7.5及8.0，测定酶活力的相对大小，对比观察pH对蛋白酶活力的影响。表4所列实验数据表明，酶活力随pH的增加而增大。
表4
Tab.4pH6.06.57.07.58.010.5
试管1
0.2070.3230.4420.4440.4570.513
pH变化对酶活力的影响A
试管20.2250.3260.4270.4490.4460.494
试管30.2130.3130.4410.4380.4470.502
平均值0.2150.3210.4360.4410.4500.503
EffectofvariationofpHonenzymeactivity
酶活力/U97816.4146042.2198362.6200637.4204732.0228844.9
图1
Fig.1
酪氨酸质量浓度－吸光度标准曲线
Standardplotoftyrosinemassconcentrationvs．absorbance
由图1可知，此线通过零点，酪氨酸质量浓度ρ与吸光度A间的函数关系为：ρ=113.71A（113.71为吸R2=0.9935。光常数），
2.2反应温度对蛋白酶活力的影响
将酶促反应的pH固定为10.5，温度分别设置在
20，30，40，50，60和70℃，测定酶活力的相对大小，对比观察反应温度对蛋白酶活力的影响，实验数据列于·194·
第3期张剑，等：碱性蛋白酶活力分析方法研究
开发与应用
表5
洗衣液对酶活力的影响
洗衣液2A0.0310.1350.046
酶活力/U
14103.7661419.6020928.16
Impactofliquidlaundrydetergentonenzymeactivity
洗衣液1A0.0630.0950.011
酶活力/U28662.4843221.205004.56
以体系pH为横坐标，将吸光度代表酶活力值为纵坐标，绘制酶活力趋势曲线，结果如图3所示
。
Tab.5次序123
从实验中可以得出影响酶活力测定结果的因素很
多，包括酶的均匀性、酶的溶解性、酶液的放置时间、反应时间和取量操作误差等。
3
图3
Fig.3
结论
pH对酶活力的影响
1）建立了福林法测定酶活力的方法，此法反应时间较短（10min）。
2）温度以及pH对酶促反应的进行均有较大的影
温度降低会使反应进响。温度过高会使蛋白酶失活，
行缓慢，任一种蛋白酶类物质都有适应温度范围；碱性
pH降低会影蛋白酶在偏碱性条件下活力到达最大值，
响蛋白酶的活力甚至导致酶失活。
3）洗涤剂对蛋白酶活力的影响为：当在洗涤剂中简单地加入酶制剂后，酶活力值极其不稳定。
参考文献：
［1］MICHAELRSTONER，DOUGLASADALE，PETERJGUALFETTI，
etal．Proteaseautolysisinheavy－dutyliquiddetergentformulations：effectsofthermodynamicstabilizersandproteaseinhibitors［J］．2004，34（2）：114－125．EnzymeandMicrobialTechnology，
［2］岳霄．洗涤剂酶的研究及展望［J］．中国洗涤用品工业，2004（3）：
75－77．
［3］胡学智，2008，王俊．蛋白酶生产和应用的进展［J］．工业微生物，
38（4）：49－61．
［4］华章熙，徐清．洗涤剂酶应用手册［M］．北京：中国轻工业出版社，
1999：7．
［5］LOWRYOH，ROSEBROUGHNJ，FARRAL，etal．Proteinmeasure-mentwiththefolinphenolreagent［J］．JBiolChem，1951，193（1）：265－275．
InfluenceofpHonenzymeactivity
经实验测定，在缓冲液对实验最小影响的前提下
（均为Na2HPO4－NaH2PO4缓冲溶液，且总摩尔浓度
－1
5种pH环境下的酶促反应实验均为0.2mol·L），
所测出的酶活力值均远小于pH=10.5时的结果，从
而证明pH降低对碱性蛋白酶活力有着负面影响。
2.4洗涤剂对蛋白酶活力的影响
分别将市售洗衣液1与市售洗衣液2与该液体碱性蛋白酶以质量比为99∶1进行混合，进行酶活力测试，比较与纯酶试剂活力值的差异。实验发现酶制剂经人工加入2种洗衣液后，进行平行实验时发现酶活力数据不一，均存在较大幅度偏差，实验数据如表5所示。从实验结果可推断当在洗涤剂中简单地加入酶制剂后，测定酶活力时会出现巨大偏差，酶活力值极不稳定。由此需考虑加酶液体洗涤剂并不是将酶制剂简单pH、加入洗涤剂中，要综合考虑温度、洗涤剂成分和酶
性质的相互影响，还需加入某种特定的稳定剂，使酶的活力得以长久地保持。
檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨
表面活性剂和洗涤剂行业生产力促进中心简介
68号文批准，表面活性剂和洗涤剂行业生产力促进中心系根据国家科技部［国科高函2004］依托中国日用化学工业研究院在北京成立的面向全行业的服务性机构。中心于2005年经国家事业单位登记管理局注册成立，2010年国家科技部以［263号文件具有独立事业法人资格。2008年通过ISO9001质量体系认证，国科高发2010］
认定为国家级示范生产力促进中心。
表面活性剂和洗涤剂行业生产力促进中心以提高行业技术创新能力为宗旨，充分利用包括依托单位在内的各种行业资源，通过引入新的运行机制，为企业尤其是中小企业提供各项优质服务，并实现自身发展壮大。作为中国日用化学工业研究院联系政府、服务企业的重要通道和桥梁，中心将在项目申报、技术咨询与推广、项目合作与培训、检测与标准、会议组织与交流等方面开展各项工作，组建面向全行业的产学研联盟，加快成果的推广与转化，实现行业的可持续发展。
·195·
DOI:10.13218/j.cnki.csdc.2012.03.017
第42卷第3期2012年6月
ChinaSurfactantDetergent＆Cosmetics
日用化学工业
Vol．42No．3June2012
碱性蛋白酶活力分析方法研究
张
剑，赵雷敏，康林霞
太原030006）
（山西大学化学化工学院，山西
摘要：通过福林法对液体碱性蛋白酶的活力进行了测定。研究比较了不同温度及pH下的酶促反应对酶活力测定方法40～50℃时相对较稳定；pH降低对碱性蛋白酶活力结果显示：酶活力随反应温度的升高表现为先上升后下降，的影响，
有着负面影响。在确定出较优的适合碱性蛋白酶的活力测定方法后，进一步测试了该方法在液体洗涤剂酶活力测定中发现在洗涤剂中简单地加入酶制剂后，测定酶活力时会出现较大偏差，酶活力值不稳定。因此，在配制加酶液体的应用，
pH以及洗涤剂中各种成分与酶的相互影响等进行综合考虑。洗涤剂时，应该对各种因素，例如温度、关键词：蛋白酶；活力分析；福林法；液体洗涤剂
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中图分类号：TQ925.2
文献标识码：A文章编号：1001－1803（2012）03－0192－04
Studyonalkalineproteaseactivityassay
ZHANGJian，ZHAOLei－min，KANGLin－xia
（CollegeofChemistryandChemicalEngineering，ShanxiUniversity，Taiyuan，Shanxi030006，China）
Abstract：ActivityofliquidalkalineproteasewasmeasuredbyusingFolinmethod．EffectsofenzymaticreactionunderdifferenttemperatureanddifferentpHontheenzymeactivityassaywereinvestigatedandcompared．Resultsshowedthatasthereactiontemperatureraises，theenzymeactivityincreasesfirstlyandthendeclines；whileloweringofthepHofthereactionshowsnegativeimpactofthealkalineproteaseactivity．Aftertheoptimumconditionsforalkalineproteaseactivityassaywereidentified，theapplicationoftheassaymethodinthedeterminationofenzymeactivityofenzymedliquiddetergentwasfurthertested．Itwasdiscoveredthatiftheenzymewassimplyaddedandmixedwiththeliquiddetergent，themeasuredenzymeactivityofthedetergentwillappearbigdeviationandanunstablevalue．Thisphenomenonindicatedthatduringtheformulationofenzymedliquiddetergent，manyfactorssuchasthetemperature，pH，andthemutualinfluenceofcomponentsinthedetergentshouldbecomprehensivelyconsidered．Keywords：protease；proteaseactivityassay；Folinmethod；liquiddetergent酶由生物体中的活细胞经过各种生理活动产生，
是一种具有催化作用的物质。蛋白酶类制剂是最早也是得到最广泛使用的洗涤剂酶品种
［1］
值是研究酶的特性及其应用的先决条件。早期文献
中，酶的活性以任意各种形式来表示，如吸光度的变化、还原基团的增加，以mg或μg表示的被转化底物
30min）的质量。这些参数和各种时间单位（如1min，相关联。1961年世界生物化学协会酶学委员会用国
际单位U来定义酶的活性，定义为在一定的标准条件1U即每分钟催化1mol底物的酶量［4］。有关酶基下，
本的国际单位（SI），世界临床化学家协会数量和单位
katal，委员会定义了一个基本单位，定义为在测定体系每秒钟催化1mol底物的催化转化反应速率所需中，
要的酶的数量，但这个单位并不常用。由于许多实际的原因，对于许多酶反应的监控并不能够完全通过消
，主要应用于衣
物洗涤剂和洗碗机专用洗涤剂中。蛋白酶能够促进去
除衣领和袜子附着的皮肤角质层污渍、血渍、人体分泌物和含蛋白质的食物渍，而且衣物上蛋白质黏附的其他污垢，在蛋白污垢被分解的同时也随之脱落
［2］
。现
在洗涤剂中使用的蛋白酶，主要为碱性蛋白酶。碱性蛋白酶是指在pH为碱性的条件下水解蛋白质肽键的其最适pH一般在9～11这一区间，属内肽酶中酶类，
［3］
的丝氨酸蛋白水解酶类。
蛋白酶制剂作为一种生物催化剂，测定其酶活力
收稿日期：2012－03－09；修回日期：2012－05－19
E－mail：zhangjian0923@vip．sina．com。作者简介：张剑（1967－），女，教授，博士，电话：[1**********]，
·192·
第3期张剑，等：碱性蛋白酶活力分析方法研究
开发与应用
耗的底物或生成的产物的化学计量来实现。因此，迄
今为止国际上碱性蛋白酶活力的测定，尚无一个统一的评价方法和单位，这也间接地影响到了碱性蛋白酶在工业界的进一步推广和使用。
作者通过福林法测定酶活力，具体步骤是在测定酶活力之前，先用福林酚试剂与已知的不同浓度的酪氨酸反应，以吸光度为横坐标，以酪氨酸浓度为纵坐标，得到标准曲线，然后将酶和底物反应的产物与福林测其吸光度，再在标准曲线上推算出相当酚试剂作用，
于多大浓度的酪氨酸，计算出酶活力单位。在测定酶活力实验完成后，探究反应条件对酶活力的影响：将酶促反应的温度分别设置到等间距温度，采用相同方法测定酶活力的相对大小，从而测出蛋白酶最适反应温
亦度；接着将酶促反应的pH分别设置在等间隔数值，采用相同方法测定不同pH下酶活力的大小，即可求
［5］
得蛋白酶最适pH。并进一步探索了该方法在液体洗涤剂酶活力测试中的具体应用。以期今后在对碱性蛋白酶进行活力测定时能快速择出最佳测试手段，从而可提升以后测定过程的准确性并为碱性蛋白酶在工业中的使用提供有效依据。
pH=10.5的缓冲溶液：c液为称取硼酸钠（硼砂）1.908g，加水溶解并定容至100mL；d液为称取氢氧化钠0.4g，加水溶解并定容至100mL。使用液：取c
d液40mL，液50mL，混匀，用水稀释至100mL。酶溶液：取1.0mL液体蛋白酶加入100mL容量
瓶中，用pH=10.5的缓冲液稀释至刻度，摇匀，再从中取1.0mL溶液加入100mL容量瓶中，用同此pH的缓冲液稀释至刻度，摇匀，在室温下放置1h，即为稀释100×100倍的酶液。在做pH影响的试验中，酶液应该选用所需的pH缓冲液稀释。
蛋白溶液：称取0.5g酪蛋白，在研钵中碾碎，磁定容至100mL。储存于力加热搅拌直到完全溶解，4℃冰箱内（有效期通常为3d，最好是现配现用）。碳酸钠溶液：称取无水碳酸钠4.24g，用水溶解并
－1
定容至100mL，即为0.4mol·L的碳酸钠溶液。
1.3分析测定
经查阅文献，得知酶促反应结束后溶液最大吸收波长为680nm。1.3.1
吸光常数测定
称取1g酪氨酸（预先在105℃烘箱内烘至恒
－1
以1mol·L的盐酸溶解后定容到100mL，再用量），
－1
水稀释100倍，即得到100mg·L的酪氨酸溶液。按照表2所示配制出质量浓度（ρ）梯度系列标准液。
表2
Tab.2
编号
123456
gradient
V（酪氨酸）/mL
0.51.01.52.02.5
V（水）/mL
5
4.54.03.53.02.5
－1
ρ/（mg·L）
1
1.1
实验部分
仪器与试剂
UV－2602型紫外可见分光光度计，尤尼柯（上海）仪器有限公司；Z－561型电热恒温水浴锅，上海胜启仪器仪表有限公司；AL204分析天平，梅特勒－托利多仪器（上海）有限公司。碱性蛋白酶，市售；福林酚试剂，上海荔达生物科技有限公司；洗衣液1和洗衣液2，均为市售；无水碳酸钠（AR）、三氯乙酸（AR）、四硼酸钠（AR）、氢氧化钠（AR）、磷酸二氢钠（AR）、磷酸氢L－酪氨酸二钠（AR）、盐酸（AR）、干酪素（BR）、（BR），均为市售。
酪氨酸质量浓度梯度系列标准液
Seriesofstandardsolutionoftyrosinemassconcentration
1020304050
1.2溶液的配制
Na2HPO4－NaH2PO4缓冲溶液：按表1所示配方
1.3.2
蛋白酶活力测定
福林法：取4支试管，每管中加入酶液1mL，第1
－1
配制，a为0.2mol·L的Na2HPO4溶液，b为
管作为对照（在同样条件下，将酶以外的种种因素所引起的变化，如底物、试剂等本身所产生的颜色称为空，白，在此时用管调节分光光度计的吸光度为“0”使其他3管在分光光度计上读得的吸光度值直接代表酶的
0.2mol·L－1的NaH2PO4溶液。
表1Tab.1pH6.06.57.07.58.0
缓冲溶液配方Va/mL12.331.561.084.05.3
Vb/mL87.768.539.016.094.7
Buffersolutionformulation
－1
活力）。在第1支试管中加入0.4mol·L的三氯乙酸溶液2mL，使酶在没有遇到底物时已失去活性。在
4支试管内各加入1mL酪蛋白溶液（pH=7），将4支试管同时放入40℃水浴准确保温10min。
－1
向另外3支试管内分别加入0.4mol·L的三氯乙酸溶液2mL，充分摇匀，使反应停止，过滤，除去沉
·193·
开发与应用
淀的酶蛋白和酪蛋白。
日用化学工业
第42卷
从每一支反应完毕的试管中取滤液1mL分别注
－1
入4支新试管中，各管加入0.4mol·L的碳酸钠溶液5mL，混匀后室温放置10min；然后在各试管中加入福林酚试剂1mL，每滴加一滴试剂必须立即混匀，在40℃水浴保温20min显色，用分光光度计在之前所查阅最大吸收波长处读取吸光度。1.3.3
酶活力计算
蛋白酶活力计算公式如下：
酶活力单位=A·K·4/10·N
表3。从表3中可以看出，酶活力随反应温度的升高
40℃时达到最大，表现为先增大后下降，随后开始下降；40～50℃呈现基本稳定状态，之后较大幅度下降。
表3
Tab.3
t/℃[1**********]0
试管1
0.3210.3460.5130.4980.3650.216
温度对酶活力的影响A
试管20.3160.3570.4940.4870.3730.199
试管30.3280.3640.5040.5010.3730.205
平均值0.3220.3560.5030.4950.3700.207
Effectoftemperatureonenzymeactivity
酶活力/U146345.47161814.11228844.88225356.85168486.8594025.07
式中A为吸光度读数，计算时可用平均值；K表示A=1时酪氨酸微克数，即在酪氨酸标准曲线上取100μg时的A值，用100除以A值，即得K值；4/10表
1mL酪蛋示因酶活力测定总量为4mL（1mL酶液、
2mL三氯乙酸），白、而显色测得时为1mL溶液，所以
10是由于酶反应时间为10min，应乘以4，而计算酶活力单位是以每分钟计算的，故应除以10；N为酶的稀
释倍数，此次试验为10000。
以酶促反应温度为横坐标，将吸光度代表酶活力
绘制酶活力趋势曲线，如图2所示
。值为纵坐标，
2
2.1
结果与讨论
L－酪氨酸标准曲线的绘制
分别测定酪氨酸质量浓度梯度标准溶液的吸光
度，以A为横坐标，ρ为纵坐标，绘制标准曲线，结果如图1所示
。
Fig.2
图2反应温度对酶活力的影响
Influenceofreactiontemperatureonenzymeactivity
由图2可知，在40～50℃内，蛋白酶活力呈现较
与表3中数据吻合。证明此种液体碱性蛋白酶大值，
的最佳作用温度在40～50℃内。
2.3反应pH对蛋白酶活力的影响
pH分别设置在将酶促反应的温度固定为40℃，6.0，6.5，7.0，7.5及8.0，测定酶活力的相对大小，对比观察pH对蛋白酶活力的影响。表4所列实验数据表明，酶活力随pH的增加而增大。
表4
Tab.4pH6.06.57.07.58.010.5
试管1
0.2070.3230.4420.4440.4570.513
pH变化对酶活力的影响A
试管20.2250.3260.4270.4490.4460.494
试管30.2130.3130.4410.4380.4470.502
平均值0.2150.3210.4360.4410.4500.503
EffectofvariationofpHonenzymeactivity
酶活力/U97816.4146042.2198362.6200637.4204732.0228844.9
图1
Fig.1
酪氨酸质量浓度－吸光度标准曲线
Standardplotoftyrosinemassconcentrationvs．absorbance
由图1可知，此线通过零点，酪氨酸质量浓度ρ与吸光度A间的函数关系为：ρ=113.71A（113.71为吸R2=0.9935。光常数），
2.2反应温度对蛋白酶活力的影响
将酶促反应的pH固定为10.5，温度分别设置在
20，30，40，50，60和70℃，测定酶活力的相对大小，对比观察反应温度对蛋白酶活力的影响，实验数据列于·194·
第3期张剑，等：碱性蛋白酶活力分析方法研究
开发与应用
表5
洗衣液对酶活力的影响
洗衣液2A0.0310.1350.046
酶活力/U
14103.7661419.6020928.16
Impactofliquidlaundrydetergentonenzymeactivity
洗衣液1A0.0630.0950.011
酶活力/U28662.4843221.205004.56
以体系pH为横坐标，将吸光度代表酶活力值为纵坐标，绘制酶活力趋势曲线，结果如图3所示
。
Tab.5次序123
从实验中可以得出影响酶活力测定结果的因素很
多，包括酶的均匀性、酶的溶解性、酶液的放置时间、反应时间和取量操作误差等。
3
图3
Fig.3
结论
pH对酶活力的影响
1）建立了福林法测定酶活力的方法，此法反应时间较短（10min）。
2）温度以及pH对酶促反应的进行均有较大的影
温度降低会使反应进响。温度过高会使蛋白酶失活，
行缓慢，任一种蛋白酶类物质都有适应温度范围；碱性
pH降低会影蛋白酶在偏碱性条件下活力到达最大值，
响蛋白酶的活力甚至导致酶失活。
3）洗涤剂对蛋白酶活力的影响为：当在洗涤剂中简单地加入酶制剂后，酶活力值极其不稳定。
参考文献：
［1］MICHAELRSTONER，DOUGLASADALE，PETERJGUALFETTI，
etal．Proteaseautolysisinheavy－dutyliquiddetergentformulations：effectsofthermodynamicstabilizersandproteaseinhibitors［J］．2004，34（2）：114－125．EnzymeandMicrobialTechnology，
［2］岳霄．洗涤剂酶的研究及展望［J］．中国洗涤用品工业，2004（3）：
75－77．
［3］胡学智，2008，王俊．蛋白酶生产和应用的进展［J］．工业微生物，
38（4）：49－61．
［4］华章熙，徐清．洗涤剂酶应用手册［M］．北京：中国轻工业出版社，
1999：7．
［5］LOWRYOH，ROSEBROUGHNJ，FARRAL，etal．Proteinmeasure-mentwiththefolinphenolreagent［J］．JBiolChem，1951，193（1）：265－275．
InfluenceofpHonenzymeactivity
经实验测定，在缓冲液对实验最小影响的前提下
（均为Na2HPO4－NaH2PO4缓冲溶液，且总摩尔浓度
－1
5种pH环境下的酶促反应实验均为0.2mol·L），
所测出的酶活力值均远小于pH=10.5时的结果，从
而证明pH降低对碱性蛋白酶活力有着负面影响。
2.4洗涤剂对蛋白酶活力的影响
分别将市售洗衣液1与市售洗衣液2与该液体碱性蛋白酶以质量比为99∶1进行混合，进行酶活力测试，比较与纯酶试剂活力值的差异。实验发现酶制剂经人工加入2种洗衣液后，进行平行实验时发现酶活力数据不一，均存在较大幅度偏差，实验数据如表5所示。从实验结果可推断当在洗涤剂中简单地加入酶制剂后，测定酶活力时会出现巨大偏差，酶活力值极不稳定。由此需考虑加酶液体洗涤剂并不是将酶制剂简单pH、加入洗涤剂中，要综合考虑温度、洗涤剂成分和酶
性质的相互影响，还需加入某种特定的稳定剂，使酶的活力得以长久地保持。
檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨
表面活性剂和洗涤剂行业生产力促进中心简介
68号文批准，表面活性剂和洗涤剂行业生产力促进中心系根据国家科技部［国科高函2004］依托中国日用化学工业研究院在北京成立的面向全行业的服务性机构。中心于2005年经国家事业单位登记管理局注册成立，2010年国家科技部以［263号文件具有独立事业法人资格。2008年通过ISO9001质量体系认证，国科高发2010］
认定为国家级示范生产力促进中心。
表面活性剂和洗涤剂行业生产力促进中心以提高行业技术创新能力为宗旨，充分利用包括依托单位在内的各种行业资源，通过引入新的运行机制，为企业尤其是中小企业提供各项优质服务，并实现自身发展壮大。作为中国日用化学工业研究院联系政府、服务企业的重要通道和桥梁，中心将在项目申报、技术咨询与推广、项目合作与培训、检测与标准、会议组织与交流等方面开展各项工作，组建面向全行业的产学研联盟，加快成果的推广与转化，实现行业的可持续发展。
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