大豆糖蛋白的分离纯化及结构分析
詹 玲,潘思轶*
(华中农业大学食品科技学院,湖北 武汉 430070)
摘 要:通过DEAE-Cellulose 52离子交换层析和Sephadex G-200凝胶层析从大豆中提取纯化一种糖蛋白,并对其结构进行了初步分析。用SDS-PAGE检测纯度,并测定其分子质量的大小,测定结果为61000,蛋白质含量为30.55%;β-消除反应说明其为O-连接型糖蛋白,红外光谱法推断其含有α型糖苷键。关键词:大豆糖蛋白;分离纯化;结构分析
Isolation, Purification and Analysis of Glycoprotein from Soybean
ZHAN Ling,PAN Si-yi*
(College of Food Science and Technology, Huazhong Agricultural University, Wuhan 430070, China)
Abstract :A soybean glycoprotein was isolated and purificated from soybean by using DEAE-Cellulose 52 IEC(Ion-exchangeChromatography) and Sephadex G-200 SEC(Size-exchange Chromatography). The soybean glycoprotein was analysed bySDS-PAGE for its purity and molecular mass.The content of the soybean glycoprotein is 30.55% and the molecular mass is61000.β-elimination reaction indicated the linkage type of the soybean glycoprotein is O-glycosidic linkage and IR Spectra is α-glycosidelinkage.
Key words:soybean glycoprotein;isolation;purification;structure analysis
中图分类号:Q513.2 文献标识码:A 文章编号: 1002-6630(2006)12-0594-03
糖蛋白是指糖和蛋白质之间,以蛋白质为主,其一定部位以共价键与若干糖分子链相连而构成的分子[1]。根据糖基异头碳原子上的羟基与肽链氨基酸残基上的酰胺基或羟基脱水所形成的糖苷键的不同,可分为N-糖苷键和O-糖苷键两大类[2]。糖蛋白在自然界广泛存在于动物、植物和某些微生物中,在生物体内它们以各种形式存在[3]。近年来随着对糖蛋白研究的深入,发现糖蛋白在生物体内起着重要的作用,而这些作用与糖链的结构密切相关。本文研究了大豆糖蛋白的提取、纯化方法,对糖蛋白的结构进行了初步分析,为后续的研究打下基础。11.11.1.11.1.2
材料与方法材料和试剂
材料
大豆粉:干大豆粉碎过200目筛。
主要试剂
DEAE-Cellulose 52(Pharmacia),Sephadex G-200
(Pharmacia),标准分子质量蛋白质(Amersham)。1.2
仪器与设备
电泳仪 北京六一;紫外可见分光光度计 日本;红外光谱仪 美国;冷冻干燥机 瑞典;HD-93-1
方法
大豆糖蛋白的分离提取
核酸蛋白检测仪。1.31.3.1
将干燥脱脂后的大豆粉按一定的料液比加入到0.05mol/L pH6.8 PBS(磷酸缓冲液)中,4℃下浸提过夜,离心后取上清液,在冰浴条件下用(NH4)2SO4沉淀,静置后离心。沉淀物为糖蛋白粗品,粗品用0.05mol/L pH7.2PBS透析,备用。1.3.2
大豆糖蛋白粗品纯化
取大豆糖蛋白粗品若干,用0.05mol/L pH7.2 PBS
溶解。将活化后的DEAE-Cellulose 52填料装柱(1.6×60cm),用0.05mol/L pH7.2 PBS平衡,上样后分别用0.05mol/L pH7.2 PBS,0.05mol/L pH7.2 PBS-0.1mol/L NaCl洗脱和0.05mol/L pH7.2 PBS-0.2mol/L NaCl洗脱,洗脱液
收稿日期:2006-07-15 *通讯作者
基金项目:湖北省新世纪高层次人才工程入选人员科研择优资助项目(鄂人[2003]31号)1981
用核酸蛋白质检测仪检测蛋白含量以及用苯酚-硫酸反应检测糖含量,收集重合峰,将收集液透析浓缩后上Sephadex G-200(1.6×50cm)凝胶层析柱,用0.05mol/LpH7.2 PBS-0.05mol/L NaCl洗脱,用同样的检测方法检测蛋白质和糖含量,收集对称重合峰,收集液用蒸馏水透析后,冷冻干燥,得到一种纯化的大豆糖蛋白。1.3.3
大豆糖蛋白的蛋白质和糖含量的测定
蛋白质含量的测定用考马斯亮蓝法,以牛血清白蛋白(BSA)为标准蛋白[5]。糖含量测定采用苯酚-硫酸法,以葡萄糖为标准糖[10]。
大豆糖蛋白的纯度和分子量测定
采用SDS-PAGE凝胶电泳法来鉴定提取的大豆糖蛋白的纯度。同时用SDS-PAGE凝胶电泳法测定大豆糖蛋白的分子量,以胰蛋白酶抑制剂、牛碳酸酐酶、兔肌动蛋白、牛血清白蛋白和兔磷酸化酶B作相对分子质量标准,用各个蛋白的相对迁移率对分子质量的对数作图,得到其相对分子质量[4,5]。1.3.5
大豆糖蛋白的糖肽键特征分析
糖蛋白或糖肽的β-消除反应,能够把与肽链上丝1.3.4
凝胶层析柱进一步分离纯化,洗脱曲线如下,收集糖和蛋白质含量重合的组分,透析后冷冻干燥,即为大豆糖蛋白纯品。
3025吸光值
201510500
10
20管数
图2 Sephadex G-200 SEC 凝胶层析洗脱曲线图Fig.2 Elution curves of the soybean glycoprotein on
Sephadex G-200 SEC
30
40
糖含量蛋白质含量
2.2
大豆糖蛋白纯度和分子量的测定
大豆糖蛋白纯品的SDS-PAGE电泳图谱如下,分别
经过蛋白质染色[8]和糖染色[9],在相同位置出现一条染色带,表明这种蛋白质是纯化的糖蛋白。通过大豆糖蛋白的相对迁移率可知其分子量为
61000。
氨酸或苏氨酸的羟基相连的单糖或糖链水解下来,而与天冬氨酰相连的N-型糖链则不能被稀碱水解。因此通过测定碱处理前后紫外吸收光谱的变化,可确定糖肽键的类型[6]。1.3.6
大豆糖蛋白的红外光谱分析
用KBr压片,机型为Nicoler-SX-170型红外光谱仪。22.12.1.1
结果与分析大豆糖蛋白的纯化
DEAE-Cellulose 52离子交换层析[7]
PBS缓冲液提取的大豆糖蛋白粗品经过DEAE-Cellu-lose 52离子交换柱分离,洗脱结果如下,收集第三组峰进行后续的样品纯化。
16141210864200
10
20管数
图1 DEAE-Cellulose 52 IEC 离子交换层析洗脱曲线图Fig.1 Elution curves of the soybean glycoprotein on
DEAE-Cellulose 52 IEC
图3 SDS-PAGE电泳图谱
Fig.3 The SDS-PAGE photography of the soybean glycoprotein
相对迁移率
0.0.0.0.4.2
4.4
4.6
4.8
5
5.5
吸光值
糖含量蛋白质含量
3040
标准蛋白质分子质量的对数图4 质量标准曲线图Fig.4 Calibration curve
2.3大豆糖蛋白糖肽键特征分析
2.1.2
Sephadex G-200凝胶层析
将上述第三组峰级分透析浓缩后经Sephadex G-200取纯品大豆糖蛋白10mg溶于5ml 0.1mol/L NaOH溶液中,30℃反应20h,测定碱处理前后240nm处氨基酸
含量的变化。由图可看出大豆糖蛋白纯品经β-消除反应后,在240nm处有明显的吸收峰,因此可说明其为O-糖蛋白。2.4
大豆糖蛋白红外光谱分析
在3500~3200cm-1之间的宽峰是O-H和N-H的伸缩振动,说明存在分子间和分子内的氢键。3000~2800cm-1的峰是糖类C-H伸缩振动,1400~1200cm-1的一组峰是C-H的变角振动。根据这两组峰可判断该物质是糖类化合物。1650cm-1的峰是乙酰氨基中的C=O伸缩振动。1250~950cm-1之间的一组强峰是吡喃糖环的醚键和羟基的吸收峰。840cm-1的吸收峰为吡喃糖α型的C-H平伏键[10,11],表明大豆糖蛋白中含有α型糖苷键。3
图5 大豆糖蛋白的考马斯亮蓝染色和糖染色
Fig.5 Coomassie Brilliant Blue G-250 Staining and Shiff
Staining of the soybean
glycoprotein
结 论
研究表明通过对脱脂大豆粉的浸提,硫酸铵沉淀以及离子交换层析和凝胶过滤层析,得到一种纯化的大豆糖蛋白。其蛋白质含量为30.55%,分子质量约为61000,β-消除反应证明它是O-糖蛋白,红外光谱分析其含有α型糖苷键。
参考文献:
[1][2]
王凤翼, 钱方, 等. 大豆蛋白质生产与应用[M]. 中国轻工业出版社,
2004. 86-122.韩益飞, 徐世清. 糖蛋白的结构与功能[J]. 生物学杂志, 2001, 18(2):1-3.
孙册, 莫汉庆. 糖蛋白与蛋白聚糖结构、功能和代谢[M]. 科学出版社, 1988. 22-29.
汪家政, 范明. 蛋白质技术手册[M]. 科学出版社, 2001. 86-101.余冰宾. 生物化学实验指导[M]. 北京: 清华大学出版社, 2004. 54-67.曾麒燕, 周德义, 吴耀生, 等. 红桂木凝集素糖蛋白的特征及其糖肽键性质的析[J]. 广西医科大学学报, 1999, 16(3): 293-295.赵永芳. 生物化学技术原理及其应用[M]. 武汉大学出版社, 1994. 78-146.Neuhoff V, Arold N, Taube D, et al. Improved staining of proteins inpolyacrylamidegels including isoelectric focusing gels with clear back-ground at nanogram sensitivity using Coomassie Brilliant Blue G-250and R-250[J]. Electrophoresis, 1988, 9(6): 255-62.
方福德, 杨焕明. 分子生物学前沿技术——现代生物医学丛书[M].北京: 北京医科大学协和医科大学联合出版社, 1998. 255.张惟杰. 糖复合物生物化学研究[M]. 浙江大学出版社, 2003. 193-201.张叔良, 易大年, 吴天明, 等. 红外光谱分析及新技术[M]. 中国医药
科技出版社, 1993.
图6 β-消除反应前后的紫外扫描图
Fig.6 UV-spectra of the soybean glycoprotein before and after
alkali
treatment
[3][4][5][6][7][8]
45
4035302520151054000
透光率(%)
300020001000
[9][10][11]
波数(cm-1)
图7 大豆糖蛋白红外光谱图
Fig.7 Infrared absorption spectra of the soybean
glycoprotein
大豆糖蛋白的分离纯化及结构分析
詹 玲,潘思轶*
(华中农业大学食品科技学院,湖北 武汉 430070)
摘 要:通过DEAE-Cellulose 52离子交换层析和Sephadex G-200凝胶层析从大豆中提取纯化一种糖蛋白,并对其结构进行了初步分析。用SDS-PAGE检测纯度,并测定其分子质量的大小,测定结果为61000,蛋白质含量为30.55%;β-消除反应说明其为O-连接型糖蛋白,红外光谱法推断其含有α型糖苷键。关键词:大豆糖蛋白;分离纯化;结构分析
Isolation, Purification and Analysis of Glycoprotein from Soybean
ZHAN Ling,PAN Si-yi*
(College of Food Science and Technology, Huazhong Agricultural University, Wuhan 430070, China)
Abstract :A soybean glycoprotein was isolated and purificated from soybean by using DEAE-Cellulose 52 IEC(Ion-exchangeChromatography) and Sephadex G-200 SEC(Size-exchange Chromatography). The soybean glycoprotein was analysed bySDS-PAGE for its purity and molecular mass.The content of the soybean glycoprotein is 30.55% and the molecular mass is61000.β-elimination reaction indicated the linkage type of the soybean glycoprotein is O-glycosidic linkage and IR Spectra is α-glycosidelinkage.
Key words:soybean glycoprotein;isolation;purification;structure analysis
中图分类号:Q513.2 文献标识码:A 文章编号: 1002-6630(2006)12-0594-03
糖蛋白是指糖和蛋白质之间,以蛋白质为主,其一定部位以共价键与若干糖分子链相连而构成的分子[1]。根据糖基异头碳原子上的羟基与肽链氨基酸残基上的酰胺基或羟基脱水所形成的糖苷键的不同,可分为N-糖苷键和O-糖苷键两大类[2]。糖蛋白在自然界广泛存在于动物、植物和某些微生物中,在生物体内它们以各种形式存在[3]。近年来随着对糖蛋白研究的深入,发现糖蛋白在生物体内起着重要的作用,而这些作用与糖链的结构密切相关。本文研究了大豆糖蛋白的提取、纯化方法,对糖蛋白的结构进行了初步分析,为后续的研究打下基础。11.11.1.11.1.2
材料与方法材料和试剂
材料
大豆粉:干大豆粉碎过200目筛。
主要试剂
DEAE-Cellulose 52(Pharmacia),Sephadex G-200
(Pharmacia),标准分子质量蛋白质(Amersham)。1.2
仪器与设备
电泳仪 北京六一;紫外可见分光光度计 日本;红外光谱仪 美国;冷冻干燥机 瑞典;HD-93-1
方法
大豆糖蛋白的分离提取
核酸蛋白检测仪。1.31.3.1
将干燥脱脂后的大豆粉按一定的料液比加入到0.05mol/L pH6.8 PBS(磷酸缓冲液)中,4℃下浸提过夜,离心后取上清液,在冰浴条件下用(NH4)2SO4沉淀,静置后离心。沉淀物为糖蛋白粗品,粗品用0.05mol/L pH7.2PBS透析,备用。1.3.2
大豆糖蛋白粗品纯化
取大豆糖蛋白粗品若干,用0.05mol/L pH7.2 PBS
溶解。将活化后的DEAE-Cellulose 52填料装柱(1.6×60cm),用0.05mol/L pH7.2 PBS平衡,上样后分别用0.05mol/L pH7.2 PBS,0.05mol/L pH7.2 PBS-0.1mol/L NaCl洗脱和0.05mol/L pH7.2 PBS-0.2mol/L NaCl洗脱,洗脱液
收稿日期:2006-07-15 *通讯作者
基金项目:湖北省新世纪高层次人才工程入选人员科研择优资助项目(鄂人[2003]31号)1981
用核酸蛋白质检测仪检测蛋白含量以及用苯酚-硫酸反应检测糖含量,收集重合峰,将收集液透析浓缩后上Sephadex G-200(1.6×50cm)凝胶层析柱,用0.05mol/LpH7.2 PBS-0.05mol/L NaCl洗脱,用同样的检测方法检测蛋白质和糖含量,收集对称重合峰,收集液用蒸馏水透析后,冷冻干燥,得到一种纯化的大豆糖蛋白。1.3.3
大豆糖蛋白的蛋白质和糖含量的测定
蛋白质含量的测定用考马斯亮蓝法,以牛血清白蛋白(BSA)为标准蛋白[5]。糖含量测定采用苯酚-硫酸法,以葡萄糖为标准糖[10]。
大豆糖蛋白的纯度和分子量测定
采用SDS-PAGE凝胶电泳法来鉴定提取的大豆糖蛋白的纯度。同时用SDS-PAGE凝胶电泳法测定大豆糖蛋白的分子量,以胰蛋白酶抑制剂、牛碳酸酐酶、兔肌动蛋白、牛血清白蛋白和兔磷酸化酶B作相对分子质量标准,用各个蛋白的相对迁移率对分子质量的对数作图,得到其相对分子质量[4,5]。1.3.5
大豆糖蛋白的糖肽键特征分析
糖蛋白或糖肽的β-消除反应,能够把与肽链上丝1.3.4
凝胶层析柱进一步分离纯化,洗脱曲线如下,收集糖和蛋白质含量重合的组分,透析后冷冻干燥,即为大豆糖蛋白纯品。
3025吸光值
201510500
10
20管数
图2 Sephadex G-200 SEC 凝胶层析洗脱曲线图Fig.2 Elution curves of the soybean glycoprotein on
Sephadex G-200 SEC
30
40
糖含量蛋白质含量
2.2
大豆糖蛋白纯度和分子量的测定
大豆糖蛋白纯品的SDS-PAGE电泳图谱如下,分别
经过蛋白质染色[8]和糖染色[9],在相同位置出现一条染色带,表明这种蛋白质是纯化的糖蛋白。通过大豆糖蛋白的相对迁移率可知其分子量为
61000。
氨酸或苏氨酸的羟基相连的单糖或糖链水解下来,而与天冬氨酰相连的N-型糖链则不能被稀碱水解。因此通过测定碱处理前后紫外吸收光谱的变化,可确定糖肽键的类型[6]。1.3.6
大豆糖蛋白的红外光谱分析
用KBr压片,机型为Nicoler-SX-170型红外光谱仪。22.12.1.1
结果与分析大豆糖蛋白的纯化
DEAE-Cellulose 52离子交换层析[7]
PBS缓冲液提取的大豆糖蛋白粗品经过DEAE-Cellu-lose 52离子交换柱分离,洗脱结果如下,收集第三组峰进行后续的样品纯化。
16141210864200
10
20管数
图1 DEAE-Cellulose 52 IEC 离子交换层析洗脱曲线图Fig.1 Elution curves of the soybean glycoprotein on
DEAE-Cellulose 52 IEC
图3 SDS-PAGE电泳图谱
Fig.3 The SDS-PAGE photography of the soybean glycoprotein
相对迁移率
0.0.0.0.4.2
4.4
4.6
4.8
5
5.5
吸光值
糖含量蛋白质含量
3040
标准蛋白质分子质量的对数图4 质量标准曲线图Fig.4 Calibration curve
2.3大豆糖蛋白糖肽键特征分析
2.1.2
Sephadex G-200凝胶层析
将上述第三组峰级分透析浓缩后经Sephadex G-200取纯品大豆糖蛋白10mg溶于5ml 0.1mol/L NaOH溶液中,30℃反应20h,测定碱处理前后240nm处氨基酸
含量的变化。由图可看出大豆糖蛋白纯品经β-消除反应后,在240nm处有明显的吸收峰,因此可说明其为O-糖蛋白。2.4
大豆糖蛋白红外光谱分析
在3500~3200cm-1之间的宽峰是O-H和N-H的伸缩振动,说明存在分子间和分子内的氢键。3000~2800cm-1的峰是糖类C-H伸缩振动,1400~1200cm-1的一组峰是C-H的变角振动。根据这两组峰可判断该物质是糖类化合物。1650cm-1的峰是乙酰氨基中的C=O伸缩振动。1250~950cm-1之间的一组强峰是吡喃糖环的醚键和羟基的吸收峰。840cm-1的吸收峰为吡喃糖α型的C-H平伏键[10,11],表明大豆糖蛋白中含有α型糖苷键。3
图5 大豆糖蛋白的考马斯亮蓝染色和糖染色
Fig.5 Coomassie Brilliant Blue G-250 Staining and Shiff
Staining of the soybean
glycoprotein
结 论
研究表明通过对脱脂大豆粉的浸提,硫酸铵沉淀以及离子交换层析和凝胶过滤层析,得到一种纯化的大豆糖蛋白。其蛋白质含量为30.55%,分子质量约为61000,β-消除反应证明它是O-糖蛋白,红外光谱分析其含有α型糖苷键。
参考文献:
[1][2]
王凤翼, 钱方, 等. 大豆蛋白质生产与应用[M]. 中国轻工业出版社,
2004. 86-122.韩益飞, 徐世清. 糖蛋白的结构与功能[J]. 生物学杂志, 2001, 18(2):1-3.
孙册, 莫汉庆. 糖蛋白与蛋白聚糖结构、功能和代谢[M]. 科学出版社, 1988. 22-29.
汪家政, 范明. 蛋白质技术手册[M]. 科学出版社, 2001. 86-101.余冰宾. 生物化学实验指导[M]. 北京: 清华大学出版社, 2004. 54-67.曾麒燕, 周德义, 吴耀生, 等. 红桂木凝集素糖蛋白的特征及其糖肽键性质的析[J]. 广西医科大学学报, 1999, 16(3): 293-295.赵永芳. 生物化学技术原理及其应用[M]. 武汉大学出版社, 1994. 78-146.Neuhoff V, Arold N, Taube D, et al. Improved staining of proteins inpolyacrylamidegels including isoelectric focusing gels with clear back-ground at nanogram sensitivity using Coomassie Brilliant Blue G-250and R-250[J]. Electrophoresis, 1988, 9(6): 255-62.
方福德, 杨焕明. 分子生物学前沿技术——现代生物医学丛书[M].北京: 北京医科大学协和医科大学联合出版社, 1998. 255.张惟杰. 糖复合物生物化学研究[M]. 浙江大学出版社, 2003. 193-201.张叔良, 易大年, 吴天明, 等. 红外光谱分析及新技术[M]. 中国医药
科技出版社, 1993.
图6 β-消除反应前后的紫外扫描图
Fig.6 UV-spectra of the soybean glycoprotein before and after
alkali
treatment
[3][4][5][6][7][8]
45
4035302520151054000
透光率(%)
300020001000
[9][10][11]
波数(cm-1)
图7 大豆糖蛋白红外光谱图
Fig.7 Infrared absorption spectra of the soybean
glycoprotein