2013年食源性致病菌检测技术培训班-致泻大肠埃希氏菌

致泻大肠埃希氏菌

实验室检验

曾莹春

2013年7月

主要内容

�概述

相关概念

病原学特性

�实验室检验

第一部分 概述

1、相关概念

�大肠菌群

�粪大肠菌群（耐热大肠菌群 ）

�大肠埃希氏菌

�致泻大肠埃希氏菌

大肠菌群

�GB 4789.3：一群能发酵乳糖、产酸产气、需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽孢杆菌。该菌主要来源于人畜粪便，故以此作为粪便污染指标来评价食品的卫生质量，推断食品中有否污染肠道致病菌的可能。

一般认为该菌群细菌包括 ：肠杆菌科的大肠埃希氏菌属、肠杆菌属、枸椽酸菌属、克雷伯菌属 �

粪大肠菌群

�GB/T4789.39-2008 一群在44.5°C培养24-48h能发酵乳糖、产酸产气、需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽孢杆菌。该菌群来自人和温血动物的粪便，作为粪便污染指标评价食品的卫生状况，推断食品中肠道致病菌污染的可能性。

粪大肠菌群与耐热大肠菌群的关系？

AOAC、FDA一般使用“粪大肠菌群”概念，GB4789的“粪大肠菌群”概念�为等同采用AOAC方法，故而使用粪大肠菌群概念；而欧洲使用“耐热大肠菌群”概念，较少使用“粪大肠菌群”。一般欧洲学者认为，“粪大肠菌群”的提法不太科学，耐热大肠菌群的范围比粪大肠菌群范围大。

大肠埃希氏菌

�GB4789.38-2012 广泛存在于人和温血动物的肠道中，能够在44.5 °C发酵乳糖、产酸产气，IMViC(靛基质、甲基红、VP试验、柠檬酸盐）生化试验为++--或-+--的革兰氏阴性杆菌。以此作为粪便污染指标来评价食品的卫生状况，推断食品中肠道致病菌污染的可能性。

大肠埃希氏菌俗称为大肠杆菌 分类于肠杆菌科 ，归属于埃希氏菌属。大肠埃希氏菌的不同菌株间DNA相关性为80% ，而与同科的志贺氏菌属 除鲍氏志贺氏菌外的DNA相关性可达 80-87%。

大肠埃希氏菌为人和动物肠道中的常居菌， 一般多不致病，在一定条件下可引起肠道外感染 。���

致泻大肠埃希氏菌

�大肠埃希氏菌为人和动物肠道中的常居菌， 一 般多不致病， 在一定条 件下可引起肠道外感染。

某些血清型的大肠埃希氏菌菌株致病性强，能引起腹泻，与人类疾病有关的大肠杆菌统称为 致泻大肠埃希氏菌。 致泻大肠埃希氏菌一般包括五种（肠产毒性大肠埃希氏菌 ETEC 、 致病性大肠埃希氏菌 EPEC 、出血性大肠埃希氏菌 EHEC 、侵袭性大肠埃希氏菌 EIEC 和粘附性大肠埃希氏菌EAggEC 。一般只有前4群菌株通过食品和水污染引起疾病暴发。�

相互关系

大肠菌群（总大肠菌群） > 粪大肠菌群（耐热大肠菌群） > 大肠埃希氏菌>致泻大肠埃希氏菌

2、大肠埃希氏菌病原学特性形态与结构

革兰阴性，短杆状，不规则排列�大 小0.4-0.7× 1-3um,

无芽胞,大多数菌株有动力。

有些菌株有多糖类包膜。

�培养特性

营养要求不高，在普通培养基上生长良好。

最适生长温度为37℃ ，生长温度范 围为15-46℃。 需氧及兼性厌氧，在有氧条件下生长良好，最适生长 pH为6.8-8.0。

部分菌落可出现β溶血。在伊红美兰琼脂上形成具有或无金属光泽的紫黑色菌落。在麦康凯琼脂上培养24小时后菌落呈红色。

大肠埃希氏菌

在伊红美蓝平

板上的形态

大肠埃希氏菌

在麦康凯平板

上的形态

生化反应

可发酵葡萄糖、乳糖 、麦芽 糖、甘露醇产酸产 气，�有些不典型的菌株不发酵或迟缓发酵乳糖。

不产生H2S，不分解尿素，不能在氰化钾培养基上生长这三 项生化特性是典型的大肠埃希氏菌。

IMViC试验 （I 吲哚形成试验，M甲基红试验，Vi V-P试验，C枸橼酸盐利用试验）结 果为“+、+、-、-”即为典型大肠埃希氏菌。结 果为“- 、+、-、-”即为非典型大肠埃希氏菌。

�抗原构造

大肠埃希氏菌抗原较复杂，由菌体O抗原、鞭毛H抗原、夹膜K抗原组成。

1）O抗原 成分为细胞壁上的糖、类脂和蛋白质复合物，也是细菌的内毒素，热稳定性较强， 高压蒸汽处理 2小 时不 被破坏。本菌已发现有 167种 O抗原。

2）H抗 原 成分为蛋白质， 无鞭毛则无 H抗原 ，H抗原能在80度被破坏，H抗原共有64种。

3）K抗原 是细胞外部的荚膜或表面物质，又称包膜抗原。 新分离的大肠埃希氏菌大多具有K抗原。根 据K抗原耐热的敏感性，可把K抗原分为A、 B、L三 类 共 有 103种， 致病性大肠埃希氏菌的抗原主要为B抗原，少 数为L抗原 ，B抗原与 L抗原均可在煮沸后被破坏， A抗原耐热性强，可耐受煮 沸1小时而不被破坏 。

O抗原可将大肠埃希氏菌分成若干血清群，再根据K 抗原和H抗原进一步分为 若干个血清型或亚型，根据大肠埃希氏菌抗原的鉴定结果写出其抗 原式如O111：K58(B)：H12 ，一般认为H抗原与致病性无 关 ，因此一般不需要进行H抗原的鉴定 。

�抵抗力

该菌对热的抵抗力较其他肠道杆菌强 55℃经 60分钟或 60℃ 加 热 15分 钟 仍 有 部 分 细 菌 存活 。

在自然界的水中可存活数周至数月，在温度较低的粪便中存活更久 。 对 磺胺类 、 链霉素、 氯霉素等敏感，但易耐药，是由带有R因子的质粒转移而获得的。

致泻大肠埃希氏菌病原学特性

�

�

�致泻大肠埃希氏菌的形态特点、培养特性和生化特性均与非致病的大肠埃希氏菌非常相似 ，以至难以区分，只能通过毒力实验的方法进行区别。 在致泻大肠埃希氏菌中，有些血清型能够引起人 的食物中毒，有些血清型能够引起人的肠道内外感染。 还有一些血清型的菌株能够使畜禽发病。致泻大肠埃希氏菌可从饮用水、未消毒牛乳、病畜脏器、禽类及被人畜粪便污染的各种食品中分离出来。

肠致病性大肠埃希氏菌（EPEC)

是发展中国家婴幼儿腹泻的主要病原菌，有高度传染性，严重者可致死。EPEC暴发主要是食用了被EPEC污染了的饮用水和肉类食品。成年人感染剂量为106。致病因子包括BFP菌毛、eae基因和SLTs基因，可通过PCR进行检测。

肠产毒性大肠埃希氏菌（ETEC) 引起婴幼儿和旅游者腹泻，出现轻度水泻，也可呈严重的霍乱样症状，低热或不发热。腹泻常为自限性，一 般 2-3天即自愈。致 病因素是LT或（和）ST毒力因子。成年人感染剂量为108，可用DNA探针和PCR进行检测。

肠出血性大肠埃希氏菌（EHEC） 引起散发性或暴发性出血性结肠炎，可 产生志贺样毒素（STX）。可导致HUS，EHCO的主要菌型是O157：H7 、O104等 。O157：H7感染剂量为10-100。可用DNA探针和PCR检测STX1和STX2。

肠侵袭性大肠埃希氏菌（EIEC） EIEC能引起痢疾样腹泻，不像典型的大肠埃希氏菌，EIEC菌株无动力、不发酵乳糖，生化反应和抗原结构均近似痢疾杆菌 ，成年人感染剂量至少为106，致病因子为具有侵袭性的毒力因子，可用PCR和DNA探针进行检测。

肠集聚性粘附大肠埃希氏菌（EAggEC） 对其发病机理尚不解，但能引起兔肠道液体蓄积。EAggEC不侵入肠上皮细胞 ，不产生LT或ST 也无VT毒素。唯一特征是能对Hep-2细胞形成集聚性粘附，也称Hep-2细胞粘附性大肠埃希氏菌。

引起急性腹泻的致泻大肠埃希氏菌

第二部分 致泻大肠埃希氏菌检验

检验程序

操作步骤

增菌

样品采集后应尽快检验。除了易腐食品在检验�之前预冷藏外,一般不冷藏。以无菌操作取检样25g(mL), 加入装有灭菌225mLEC增菌液的均质杯中，用均质器均质；液体样本震荡均匀即可。于44.5℃±0.2℃培养18h～24h。

分离

取增菌后的EC增菌液分别划线接种麦康凯或伊红美蓝�琼脂平板;污染严重的检样, 可将检样匀液直接划线接种平板, 于36℃±1℃培养18 h～24h, 观察菌落形态。注意乳糖不发酵和迟缓发酵的菌落。致泻大肠埃希氏菌在不同选择性琼脂

平板上的菌落形态特征见下表。

�初步生化试验

自选择性琼脂平板上直接挑取5～10个菌落分别接种TSI、pH7.2尿素琼脂和营养琼脂小斜面各一管，置36℃±1℃培养18h～24h，分别观察结果。

凡是TSI斜面产酸或不产酸, 底层产酸, H2S阴性和尿素阴性的的菌株，挑取用5.3.1中已培养的营养琼脂斜面上生长的菌苔，进行生化试验、血清学分型；或者采用PCR检测特异毒力基因方法鉴别5种致泻大肠埃希氏菌，然后再进行血清学分型实验。

�生化试验

用初步生化试验中已培养的营养琼脂斜面上生长的菌苔，进行生化试验，即靛基质、甲基红和VP实验，大肠埃希氏菌的培养物VP实验为阴性结果，靛基质实验和甲基红实验应为阳性结果；EIEC还需加做赖氨酸脱羧酶试验和动力试验，赖氨酸脱羧酶试验应为阴性，动力试验应为阴性（O124动力阳性或阴性）。必要时做氧化酶和革兰氏染色检查，应为氧化酶阴性的G-杆菌。

如选择生化鉴定试剂盒或全自动微生物生化鉴定系统，可根据初步生化鉴定结果，用营养琼脂斜面上生长的菌苔，使用生化鉴定试剂盒或全自动微生物生化鉴定系统进行鉴定。

�血清学试验

假定试验

挑取经生化试验证实为大肠埃希氏菌琼脂培养物, 用致病性大肠埃希氏菌、侵袭性大肠埃希氏菌和产肠毒素大肠埃希氏菌多价O血清和出血性大肠埃希氏菌O157、O104血清做玻片凝集试验。 当与某一种多价O血清凝集时, 再与该多价血清所包含的单价O血清做试验。如与某一个单价O血清呈现强凝集反应, 即为假定试验阳性。

�血清学试验

证实试验

制备O抗原悬液, 稀释至与Mac Farland 3号比浊管相当的浓度。原效价为1：160～1：320的O血清, 用0.5%盐水稀释至1：40。稀释血清与抗原悬液在10mm×75mm试管内等量混合, 做单管凝集试验。混匀后放于50℃水浴锅内, 经16h后观察结果。如出现凝集, 可证实为该O抗原。稀释血清

加热

PCR方法

引物合成

�模板提取

�PCR反应体系配制

�PCR反应条件

�PCR反应结果判定 �

PCR

检测结果判定

结果报告

综合生化鉴定、血清学分型或综合PCR、血清学分型进行报告。

谢 谢

致泻大肠埃希氏菌

实验室检验

曾莹春

2013年7月

主要内容

�概述

相关概念

病原学特性

�实验室检验

第一部分 概述

1、相关概念

�大肠菌群

�粪大肠菌群（耐热大肠菌群 ）

�大肠埃希氏菌

�致泻大肠埃希氏菌

大肠菌群

�GB 4789.3：一群能发酵乳糖、产酸产气、需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽孢杆菌。该菌主要来源于人畜粪便，故以此作为粪便污染指标来评价食品的卫生质量，推断食品中有否污染肠道致病菌的可能。

一般认为该菌群细菌包括 ：肠杆菌科的大肠埃希氏菌属、肠杆菌属、枸椽酸菌属、克雷伯菌属 �

粪大肠菌群

�GB/T4789.39-2008 一群在44.5°C培养24-48h能发酵乳糖、产酸产气、需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽孢杆菌。该菌群来自人和温血动物的粪便，作为粪便污染指标评价食品的卫生状况，推断食品中肠道致病菌污染的可能性。

粪大肠菌群与耐热大肠菌群的关系？

AOAC、FDA一般使用“粪大肠菌群”概念，GB4789的“粪大肠菌群”概念�为等同采用AOAC方法，故而使用粪大肠菌群概念；而欧洲使用“耐热大肠菌群”概念，较少使用“粪大肠菌群”。一般欧洲学者认为，“粪大肠菌群”的提法不太科学，耐热大肠菌群的范围比粪大肠菌群范围大。

大肠埃希氏菌

�GB4789.38-2012 广泛存在于人和温血动物的肠道中，能够在44.5 °C发酵乳糖、产酸产气，IMViC(靛基质、甲基红、VP试验、柠檬酸盐）生化试验为++--或-+--的革兰氏阴性杆菌。以此作为粪便污染指标来评价食品的卫生状况，推断食品中肠道致病菌污染的可能性。

大肠埃希氏菌俗称为大肠杆菌 分类于肠杆菌科 ，归属于埃希氏菌属。大肠埃希氏菌的不同菌株间DNA相关性为80% ，而与同科的志贺氏菌属 除鲍氏志贺氏菌外的DNA相关性可达 80-87%。

大肠埃希氏菌为人和动物肠道中的常居菌， 一般多不致病，在一定条件下可引起肠道外感染 。���

致泻大肠埃希氏菌

�大肠埃希氏菌为人和动物肠道中的常居菌， 一 般多不致病， 在一定条 件下可引起肠道外感染。

某些血清型的大肠埃希氏菌菌株致病性强，能引起腹泻，与人类疾病有关的大肠杆菌统称为 致泻大肠埃希氏菌。 致泻大肠埃希氏菌一般包括五种（肠产毒性大肠埃希氏菌 ETEC 、 致病性大肠埃希氏菌 EPEC 、出血性大肠埃希氏菌 EHEC 、侵袭性大肠埃希氏菌 EIEC 和粘附性大肠埃希氏菌EAggEC 。一般只有前4群菌株通过食品和水污染引起疾病暴发。�

相互关系

大肠菌群（总大肠菌群） > 粪大肠菌群（耐热大肠菌群） > 大肠埃希氏菌>致泻大肠埃希氏菌

2、大肠埃希氏菌病原学特性形态与结构

革兰阴性，短杆状，不规则排列�大 小0.4-0.7× 1-3um,

无芽胞,大多数菌株有动力。

有些菌株有多糖类包膜。

�培养特性

营养要求不高，在普通培养基上生长良好。

最适生长温度为37℃ ，生长温度范 围为15-46℃。 需氧及兼性厌氧，在有氧条件下生长良好，最适生长 pH为6.8-8.0。

部分菌落可出现β溶血。在伊红美兰琼脂上形成具有或无金属光泽的紫黑色菌落。在麦康凯琼脂上培养24小时后菌落呈红色。

大肠埃希氏菌

在伊红美蓝平

板上的形态

大肠埃希氏菌

在麦康凯平板

上的形态

生化反应

可发酵葡萄糖、乳糖 、麦芽 糖、甘露醇产酸产 气，�有些不典型的菌株不发酵或迟缓发酵乳糖。

不产生H2S，不分解尿素，不能在氰化钾培养基上生长这三 项生化特性是典型的大肠埃希氏菌。

IMViC试验 （I 吲哚形成试验，M甲基红试验，Vi V-P试验，C枸橼酸盐利用试验）结 果为“+、+、-、-”即为典型大肠埃希氏菌。结 果为“- 、+、-、-”即为非典型大肠埃希氏菌。

�抗原构造

大肠埃希氏菌抗原较复杂，由菌体O抗原、鞭毛H抗原、夹膜K抗原组成。

1）O抗原 成分为细胞壁上的糖、类脂和蛋白质复合物，也是细菌的内毒素，热稳定性较强， 高压蒸汽处理 2小 时不 被破坏。本菌已发现有 167种 O抗原。

2）H抗 原 成分为蛋白质， 无鞭毛则无 H抗原 ，H抗原能在80度被破坏，H抗原共有64种。

3）K抗原 是细胞外部的荚膜或表面物质，又称包膜抗原。 新分离的大肠埃希氏菌大多具有K抗原。根 据K抗原耐热的敏感性，可把K抗原分为A、 B、L三 类 共 有 103种， 致病性大肠埃希氏菌的抗原主要为B抗原，少 数为L抗原 ，B抗原与 L抗原均可在煮沸后被破坏， A抗原耐热性强，可耐受煮 沸1小时而不被破坏 。

O抗原可将大肠埃希氏菌分成若干血清群，再根据K 抗原和H抗原进一步分为 若干个血清型或亚型，根据大肠埃希氏菌抗原的鉴定结果写出其抗 原式如O111：K58(B)：H12 ，一般认为H抗原与致病性无 关 ，因此一般不需要进行H抗原的鉴定 。

�抵抗力

该菌对热的抵抗力较其他肠道杆菌强 55℃经 60分钟或 60℃ 加 热 15分 钟 仍 有 部 分 细 菌 存活 。

在自然界的水中可存活数周至数月，在温度较低的粪便中存活更久 。 对 磺胺类 、 链霉素、 氯霉素等敏感，但易耐药，是由带有R因子的质粒转移而获得的。

致泻大肠埃希氏菌病原学特性

�

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�致泻大肠埃希氏菌的形态特点、培养特性和生化特性均与非致病的大肠埃希氏菌非常相似 ，以至难以区分，只能通过毒力实验的方法进行区别。 在致泻大肠埃希氏菌中，有些血清型能够引起人 的食物中毒，有些血清型能够引起人的肠道内外感染。 还有一些血清型的菌株能够使畜禽发病。致泻大肠埃希氏菌可从饮用水、未消毒牛乳、病畜脏器、禽类及被人畜粪便污染的各种食品中分离出来。

肠致病性大肠埃希氏菌（EPEC)

是发展中国家婴幼儿腹泻的主要病原菌，有高度传染性，严重者可致死。EPEC暴发主要是食用了被EPEC污染了的饮用水和肉类食品。成年人感染剂量为106。致病因子包括BFP菌毛、eae基因和SLTs基因，可通过PCR进行检测。

肠产毒性大肠埃希氏菌（ETEC) 引起婴幼儿和旅游者腹泻，出现轻度水泻，也可呈严重的霍乱样症状，低热或不发热。腹泻常为自限性，一 般 2-3天即自愈。致 病因素是LT或（和）ST毒力因子。成年人感染剂量为108，可用DNA探针和PCR进行检测。

肠出血性大肠埃希氏菌（EHEC） 引起散发性或暴发性出血性结肠炎，可 产生志贺样毒素（STX）。可导致HUS，EHCO的主要菌型是O157：H7 、O104等 。O157：H7感染剂量为10-100。可用DNA探针和PCR检测STX1和STX2。

肠侵袭性大肠埃希氏菌（EIEC） EIEC能引起痢疾样腹泻，不像典型的大肠埃希氏菌，EIEC菌株无动力、不发酵乳糖，生化反应和抗原结构均近似痢疾杆菌 ，成年人感染剂量至少为106，致病因子为具有侵袭性的毒力因子，可用PCR和DNA探针进行检测。

肠集聚性粘附大肠埃希氏菌（EAggEC） 对其发病机理尚不解，但能引起兔肠道液体蓄积。EAggEC不侵入肠上皮细胞 ，不产生LT或ST 也无VT毒素。唯一特征是能对Hep-2细胞形成集聚性粘附，也称Hep-2细胞粘附性大肠埃希氏菌。

引起急性腹泻的致泻大肠埃希氏菌

第二部分 致泻大肠埃希氏菌检验

检验程序

操作步骤

增菌

样品采集后应尽快检验。除了易腐食品在检验�之前预冷藏外,一般不冷藏。以无菌操作取检样25g(mL), 加入装有灭菌225mLEC增菌液的均质杯中，用均质器均质；液体样本震荡均匀即可。于44.5℃±0.2℃培养18h～24h。

分离

取增菌后的EC增菌液分别划线接种麦康凯或伊红美蓝�琼脂平板;污染严重的检样, 可将检样匀液直接划线接种平板, 于36℃±1℃培养18 h～24h, 观察菌落形态。注意乳糖不发酵和迟缓发酵的菌落。致泻大肠埃希氏菌在不同选择性琼脂

平板上的菌落形态特征见下表。

�初步生化试验

自选择性琼脂平板上直接挑取5～10个菌落分别接种TSI、pH7.2尿素琼脂和营养琼脂小斜面各一管，置36℃±1℃培养18h～24h，分别观察结果。

凡是TSI斜面产酸或不产酸, 底层产酸, H2S阴性和尿素阴性的的菌株，挑取用5.3.1中已培养的营养琼脂斜面上生长的菌苔，进行生化试验、血清学分型；或者采用PCR检测特异毒力基因方法鉴别5种致泻大肠埃希氏菌，然后再进行血清学分型实验。

�生化试验

用初步生化试验中已培养的营养琼脂斜面上生长的菌苔，进行生化试验，即靛基质、甲基红和VP实验，大肠埃希氏菌的培养物VP实验为阴性结果，靛基质实验和甲基红实验应为阳性结果；EIEC还需加做赖氨酸脱羧酶试验和动力试验，赖氨酸脱羧酶试验应为阴性，动力试验应为阴性（O124动力阳性或阴性）。必要时做氧化酶和革兰氏染色检查，应为氧化酶阴性的G-杆菌。

如选择生化鉴定试剂盒或全自动微生物生化鉴定系统，可根据初步生化鉴定结果，用营养琼脂斜面上生长的菌苔，使用生化鉴定试剂盒或全自动微生物生化鉴定系统进行鉴定。

�血清学试验

假定试验

挑取经生化试验证实为大肠埃希氏菌琼脂培养物, 用致病性大肠埃希氏菌、侵袭性大肠埃希氏菌和产肠毒素大肠埃希氏菌多价O血清和出血性大肠埃希氏菌O157、O104血清做玻片凝集试验。 当与某一种多价O血清凝集时, 再与该多价血清所包含的单价O血清做试验。如与某一个单价O血清呈现强凝集反应, 即为假定试验阳性。

�血清学试验

证实试验

制备O抗原悬液, 稀释至与Mac Farland 3号比浊管相当的浓度。原效价为1：160～1：320的O血清, 用0.5%盐水稀释至1：40。稀释血清与抗原悬液在10mm×75mm试管内等量混合, 做单管凝集试验。混匀后放于50℃水浴锅内, 经16h后观察结果。如出现凝集, 可证实为该O抗原。稀释血清

加热

PCR方法

引物合成

�模板提取

�PCR反应体系配制

�PCR反应条件

�PCR反应结果判定 �

PCR

检测结果判定

结果报告

综合生化鉴定、血清学分型或综合PCR、血清学分型进行报告。

谢 谢