医学生物化学基本实验
第一节 蛋白定量分析实验
蛋白质是一切活细胞和有机体的最重要组成成分，它是构成人体及所有动物机体组织的主要部分。蛋白质是由二十种氨基酸以肽键相互连接而成的复杂的高分子化合物。蛋白质含量可通过它们的物理化学性质，如折射率﹑比重﹑紫外吸收﹑染色等测定而得知，或用化学方法，如微量凯氏定氮﹑folin-酚试剂、双缩脲反应等方法来测定，表2-1为五种蛋白质的测定方法的比较。
表 五种蛋白质测定方法比较
方 法
凯氏定氮法
(Kjedahl法)
双缩脲法
(Biuret法)
Folin-酚试剂法
(Lowry法)
考马斯亮蓝法
(Bradford法)
紫外吸收法 灵敏度 0.2～1.0mg 1～20mg 5µg 1～5µg 原 理 将蛋白质转化为氮，用酸吸收后滴定 多肽键加碱性铜离子生成紫色络合物 磷钼酸-磷钨酸试剂被Tyr 和Phe 还原 考马斯亮蓝染料与蛋白质结合时其λmax由465nm 变为595nm 蛋白质中的酪氨酸和色氨酸残基在280nm
处的光吸收
实验一 双缩脲法测定蛋白质含量
【实验目的】
掌握双缩脲法测定蛋白质浓度的原理和标准曲线的绘制。
【实验原理】 蛋白质分子中含有许多肽键，与双缩脲结构类似，在碱性溶液中能与铜离子结合成紫色的化合物（称双缩脲反应）。在一定浓度范围，颜色的深浅与蛋白质浓度成正比，故可用比色法测定蛋白质的含量。含有两个以上肽键的物质才有此反应，故氨基酸无此反应。
【实验内容与方法】
1. 标准曲线的制作
(1) 取小试管7支，编号，按表2-2操作
表2-2 双缩脲法操作步骤 干扰物质 非蛋白氮（可用三氯乙酸沉淀蛋白质而分离） 硫酸铵；Tris 缓冲液；某些氨基酸 硫酸铵；Tris 缓冲液；甘氨酸；各种硫醇 强碱性缓冲液；TritonX-100； SDS 各种嘌呤和嘧啶；各种核苷酸 50～100µg
试剂（ml ）
标准蛋白质溶液
生理盐水
双缩脲试剂 管 号 1 2 3 4 5 6 7 0.1 0.3 0.5 0.7 0.9 — 样品0.1 0.9 0.7 0.5 0.3 0.1 1.0 0.9 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0
(2) 混匀后，于37℃水浴中保温15min ，在540nm 波长下比色，以第6管调零点，测得各管的吸光度值。以各管的吸光度值为纵坐标，蛋白质的克数为横坐标，绘成曲线。
2. 样品测定 取血清（或其它蛋白质溶液）0.1ml ，加生理盐水0.9ml ，再加二缩脲试剂4ml ，于37℃水浴中放置15min ，测其吸光度，根据吸光度值查标准曲线即得出每l00ml 血清（样品）中蛋白质的克数。
【实验准备】
1. 双缩脲试剂 称取CuSO 4·5H 20 2.5g ，加水100ml ，加热助溶，另取酒石酸钾钠10g ，碘化钾5g ，溶于500ml 水中，再加5mol/L NaOH 300ml 混合，然后将硫酸铜溶液倾入，加水至1000ml ，此液可长期保存。
2. 生理盐水，标准蛋白质溶液2mg/ml
3. 仪器及玻璃器皿 721型分光光度计，水浴箱，中试管6支，l 毫升刻度吸管3支，10毫升刻度吸管1支，坐标纸
实验二 考马斯亮兰法测定蛋白质含量
【实验目的】
1. 掌握考马斯亮兰结合法对蛋白质定量测定的方法及原理 。
2. 熟悉紫外分光光度计的使用。
【实验原理】 考马斯亮兰G-250存在着两种不同的颜色，红色和蓝色。它和蛋白质通过范德华力结合，染料与蛋白质结合后颜色由红色转变成蓝色，最大吸收峰从465nm 变成595nm ，通过测定595nm 处的光吸收的增加量可知与其结合蛋白质的量。应用考马斯亮兰法的优点是：（1）灵敏度高，据估计比Lowry 法约高4倍，其最低蛋白质检测量可达1µg 。（2）测定速度快、简便，只需一种试剂。（3）干扰物质少。
【实验内容与方法】
1. 取试管3支、编号，按表2-4操作
表2-4 考马斯亮兰法测定蛋白质
试 剂（ml ） 空白管 标准管 样品管
生理盐水 0.1
标准蛋白溶液 0.1
样 品 0.1
考马斯亮蓝试剂 5.0 5.0 5.0
2. 混匀，室温放置5min ，在波长595nm 处，以空白管调零点。测定各管的吸光度值。
3. 计算
OD 样品⨯50=样品中蛋白质的含量μg /mL OD 标准
【实验准备】
1. 考马斯亮蓝试剂 称取考马斯亮蓝G-250 100mg，加95%乙醇溶液50ml ，使之溶解，再加入85%磷酸溶液100ml ，加水至1000ml 。混匀，避光放置过夜，用二层滤纸过滤，滤液用棕色瓶保存，至少可保存两周。
2. 标准蛋白溶液50µg/ml。
3. 仪器及玻璃器皿 721分光光度计，试管l0支，刻度吸管10ml 、l5ml 、lml 、0.1ml 各1支，普通玻璃比色杯4只。
实验三 紫外分光光度法测定蛋白质含量
【实验目的】
1. 掌握紫外分光光度法测定蛋白质含量的原理。
2. 熟悉紫外分光光度计的使用。
【实验原理】 蛋白质分子中含有的酪氨酸、色氨酸等芳香族氨基酸残基的苯环含有共轭双键，使蛋白质具有吸收紫外光的性质，吸收高峰在280nm 波长处。由于各种蛋白质所含芳香族氨基酸的量相差很少，因此在此波长范围内。吸收峰的吸光度值与其浓度成正比，可作定量测定。由于各种蛋白质中芳香族氨基
酸含量的不同，因而此法适于测定与所采用的标准蛋白质的氨基酸组成相似的蛋白质，以减少误差。
一般核酸在280nm 波长处也有吸收，对蛋白质测定有干扰作用，但核酸的吸收高峰在260nm ，因此溶液中同时存在核酸时，必须同时测定A 260 和A 280，通过计算消除核酸对蛋白质的影响而算出蛋白质的含量。
【实验内容与方法】
1. 280nm 的光吸收法 因蛋白质分子中的酪氨酸、色氨酸和苯丙氨酸在280nm 处具有最大吸收，且各种蛋白质的这三种氨基酸含量差别不大，因此测定蛋白质溶液在280nm 处的吸光度值是最常用的紫外吸收法。
（1）标准蛋白质溶液 任选一种蛋白质溶液，经凯氏定氮法测定蛋白质的含量，用生理盐水稀释至浓度为1mg ／ml 。
（2）取试管6支，编号，按表2-5进行操作
表2-5 紫外吸收法标准曲线
管 号
试剂（ml ）
1 2 3 4 5 6
标准蛋白质溶液 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 0 生理盐水 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 4.0
混匀后，盛于石英杯中，用紫外分光光度计，以第6管调零点，在280nm 波长下测定各管吸光度，以各管的光密度值为纵坐标，蛋白质浓度为横坐标绘制标准曲线图。
（3）样品测定 用生理盐水将待测样品的蛋白质浓度稀释成大约1mg ／ml ，取标本1.0ml ，加生理盐水3.0ml ，混匀，按上述方法测其A 280，根据标准曲线得出蛋白质的浓度。
2. 260nm 和280nm 的吸收差法 核酸对此处光有很强的吸收，在280nm 处的光吸收比蛋白质强10倍（每克），但核酸在260nm 处的吸收更强，其吸收高峰在260nm 附近。核酸在260nm 处的消光系数是280nm 处的2倍，而蛋白质则相反，280nm 紫外吸收值大于260nm 吸收值。通常：
纯蛋白质的光吸收比值：A 280nm /A260nm ≈1.8
纯核酸的光吸收比值： A 280nm /A260nm ≈0.5
含有核酸的蛋白质溶液，可分别测定其A 280nm 和A 260nm ，由此吸收差值，用下面的公式，即可计算出蛋白质的浓度。
蛋白质浓度（mg ／ml ）=1.45A280 - 0.74A260（mg/ml）
3. 215nm 与225nm 的吸收差法 蛋白质的稀溶液由于含量低而不能使用280nm 的光吸收测定时，可用215nm 与225nm 吸收值之差，通过标准曲线法来测定蛋白质稀溶液的浓度。用已知浓度的标准蛋白质溶液，配制成20～100µg/ml的一系列蛋白质溶液，取一定量分别测定215nm 与225nm 的吸光度值，并计算出吸收差：
吸收差Δ=A215nm -A 225nm
以吸收差Δ为纵坐标，蛋白质浓度为横坐标，绘出标准曲线。再测出未知样品的吸收差，即可由标准曲线上查出未知样品的蛋白质浓度。
4. 肽键测定法 蛋白质溶液在238nm 的光吸收处的强弱，与肽键的多少成正比。用已知浓度的标准蛋白质溶液，配制成50～500µg/ml的一系列蛋白质溶液，取一定量测定238nm 的吸光度值A 238nm ，以A 238nm 为纵坐标，蛋白质含量为横坐标，绘制出标准曲线。未知样品的浓度即可由标准曲线求得。
本方法比280nm 吸收法灵敏，但多种有机物，如醇、酮、醛、有机酸、酰胺类和过氧化物等都有干扰作用，所以最好用无机盐，无机碱和水溶液进行测定。若含有有机溶剂，可将样品蒸干，或用其他方法除去干扰物质，然后用水、稀酸和稀碱溶解后再作测定。
【实验准备】 紫外分光光度计，坐标纸。
附录：常用实验技术原理——分光光度技术
分光光度技术（spectrophotography ）是利用物质特有的吸收光谱来鉴别物质或测定其含量的一项技术，该技术灵敏度强，精确度高，操作简便、快速；对于复杂的组分系统，勿需分离即可检测出其中的微量组分，因此分光光度技术已成为生物学研究领域中广泛使用的方法之一。
【基本原理】
物质对光波有选择性的吸收作用，不同物质由于其分子结构不同，对不同波长光线的吸收能力也不同，有色溶液之所以呈现出不同的颜色，是由于物质对光的选择性吸收所致，有些物质能选择性吸收特定波长的紫外光或红外光，因此，
每种物质都具有其特征性的吸收光谱。分光光度法所使用的光谱范围在200nm-10μ（1μ= 1， 000nm ）之间。其中200nm －400nm 为紫外光区，400nm －760nm 为可见光区，760nm －10，000nm 为红外光区。在一定条件下，物质对光的吸收程度与该物质浓度成正比，因此可利用各种物质不同的吸收光谱及其吸收强度，对不同物质进行定性和定量分析。
分光光度技术依据的原理是Lambert-Beer 定律，该定律阐明了溶液对单色光吸收的多少与溶液浓度和溶液厚度之间的关系。当光线通过透明介质时， 溶液吸收了一部分光能，因此当光透射出溶液之后，光强度减弱。溶液浓度越大，或溶液的厚度越大（即光在溶液中所经过的路径愈长），则对光的吸收越强，光的强度减弱也愈显著。
1. 朗伯（Lambert ）定律：当一束单色光通过一光吸收介质时，光强度随吸收光介质的厚度增加而呈指数减少，即
I =e -K 1l I o
（ I 0：入射光强度，Ｉ：透射光强度，l ：介质的厚度）
式中K 为吸光系数：表示吸光物质在单位浓度和单位厚度时的吸光度，是物质的一个特征常数，由物质的性质与光的波长决定。对于同一物质和一定波长的入射光而言是一个常数。
当溶液浓度单位为mol/L，光程厚度为lcm 时的吸光系数称为摩尔吸光系数，又称摩尔吸光度，用ε表示，其单位是(L·mol -1·cm -①，一般采用ε值最大的波长进行比色测定。
2. 比尔（Beer ）定律：当一束单色光通过一光吸收介质时，光强度随介质浓度的增加而呈指数减少。即
I =e -K 2C （C:溶液浓度） I o
两者结合在一起称为朗伯-比尔（Lambert-Beer ）定律，即吸光度与溶液浓度和液层厚度的乘积成正比。
I =e -Kcl I o
透光度T 为I/I0，通常以百分率表示。
T =I =e -Kcl I o
取对数 -lg I 称为吸光度（A ）。 I o I =-lg T =A =kcl I o -lg
采用适当的光源、棱镜和适当的光源接收器，让某一波长的光透过某一溶液，通过仪器的测定，定性鉴别物质或定量测定某一组分含量的方法即为分光光度法。通过对光波长的调整，可使溶质浓度的测定范围不仅仅局限于可见光，尚可扩大到紫外光区和红外光区。经单色器（棱镜）得到的光源虽然不是纯的单色光，但波长范围更狭窄，更符合Lambert-Beer 定律，其灵敏度大为提高。
【分光光度技术的基本应用】
（一）测定溶液中物质的含量
可见或紫外分光光度法都可用于测定溶液中物质的含量。在实际测定过程中，可采用两种方法：
（1）标准管法（标准比较法）
用已知浓度的测定物（标准溶液）与待测定溶液同样处理，测定吸光度，再根据前式计算，即A 1=K1C 1L 1 ； A 2=K2C 2L 2，式中A 1、A 2分别为已知浓度标准溶液和未知浓度待测溶液的吸光度；C 1、C 2分别为已知浓度标准溶液和未知浓度待测溶液中待测物浓度。由于盛放标准液和待测液的比色杯径长相同（L 1=L2），
A 1故上二式可写成： K 1C 2=A 2K 2C 2
因标准液和待测液中溶质为同一物质，K 值相同，即：K 1=K2 可换算成下式：C 2=A 2C 1 A 1
上式为实验操作中常用的计算式。因比色皿本身和溶剂也会产生一定的光吸收，故需设置一个空白管，即其中除了待测溶质以外，其它的成分完全相同。以空白管对准光路对仪器调零，消除非待测物的吸收，所测值即为待测物的光吸收值。
（2）标准曲线法
先配制一系列已知的不同浓度的测定物溶液（标准溶液），与待测溶液同样方法处理，分别读取各管吸光度值，以各管吸光度值为纵座标，各管溶液浓度为横座标，绘制标准曲线，在一定的浓度范围内标准曲线应该是一条经过原点的直线。然后测定待测液的吸光度，即可从标准曲线上查到其相对应的浓度。
一般认为，标准曲线范围在测定物浓度的一半到二倍之间，并使吸光度在0.05～1.0范围内为宜。所作标准曲线仅供短期使用。标准曲线制作与待测管测定应在同一台仪器上进行，以避免产生误差。
物质含量测定时所用波长通常要选择被测物质的最大吸收波长，物质含量的微小变化将引起较大的吸光度差异，使灵敏度提高；同时可以避免其它物质的干扰。
（二）利用吸收光谱鉴定化合物
使用分光光度计可以绘制吸收光谱曲线。方法是用各种不同波长的单色光分别通过某一浓度的溶液，测定此溶液对每一种单色光的吸光度，然后以波长为横座标，以吸光度为纵座标绘制吸光度─波长曲线，此曲线即吸收光谱曲线。各种物质有其特征性的吸收光谱曲线，因此用吸收光谱曲线图可以进行物质种类的鉴定。当一种未知物质的吸收光谱曲线和某一已知物质的吸收光谱曲线相同时，则很可能它们是同一物质。一定物质在不同浓度时，其吸收光谱曲线中峰值的大小不同，但形状相似，即吸收高峰和低峰的波长是一定不变的。
紫外线吸收是由不饱和的结构造成的，含有双键的化合物表现出吸收峰。紫外吸收光谱比较简单，同一种物质的紫外吸收光谱应完全一致，但具有相同吸收光谱的化合物其结构不一定相同。除了特殊情况外，单独依靠紫外吸收光谱决定一个未知物结构，必须与其它方法配合。紫外吸收光谱分析主要用于已知物质的定量分析和纯度分析。
【分光光度计结构】
能够从各种波长的混合光中将单色光分离出来并检测其强度的仪器称为分光光度计。因使用的波长范围不同分光光度计可分为紫外、可见、红外以及万用（全波段）分光光度计等。
无论哪一种分光光度计其原理和结构基本相似，一般包括以下几个部件：
1. 光源 分光光度计常用的光源有两种，即钨灯和氢灯(或氘灯) 。在可见光区，近紫外光区和近红外光区常用钨灯，用作可见光分光光度计的光源。氢灯和氘灯能发射150－400nm 的紫外线，可用作紫外光区分光光度计的光源。
2. 单色器 可把混合光分解为单一波长光的装置。多用棱镜或光栅作为其色散元件。光波通过棱镜时，不同波长的光折射率不同。波长愈短，折射率则愈大。反之，波长愈长，折射率则愈小。因而能将不同波长的光分开。
3. 吸收池（比色杯、比色池） 一般由玻璃或石英制成，用来盛放待测溶液。各比色杯壁厚度等规格应尽可能完全相等，否则将产生测定误差。玻璃比色杯适用于可见光区，在紫外区测定时要用石英比色杯。
4. 检测器系统 由光电池、光电管、光电倍增管组成。
5. 测量装置 检测器产生的光电流以某种方式转变成模拟的或数字的结果，模拟输出装置包括电流表、电压表、记录器、示波器及与计算机联用等，数字输出则通过模拟／数字转换装置如数字式电压表等。现代的仪器常附有自动记录器，可自动描出记录曲线。
【常见分光光度计】
一.722型分光光度计
(一) 仪器结构：722型光栅分光光度计由光源室、单色器、样品室、光电管暗盒、电子系统及数字显示器等部件组成。工作原理见图1-1
图1-1 722型分光光度计的结构图
（二）操作方法：
1. 接通电源开关。
2. 将灵敏度旋钮调至"1" 档（放大倍率最小）。
3. 开启电源，指示灯亮，选择开关置于 "T" ，波长调至测试用波长，预热20min 。
4. 打开样品室盖（光门自动关闭），调节"0" 旋钮，使数字显示为"0.000" ，盖上样品室盖，将比色皿架处于空白液体位置，使光电管受光，调节透光率"100%"旋钮，使数字显示为"100.00" 。
5. 预热后，按步骤4连续几次调整"0" 和"100%"即可进行测定工作。
6. 将选择开关由"T" 旋置"A" ，调节吸光度调零旋钮，使数字显示为"0.000" ，然后将被测样品移入光路，显示值即为被测样品的吸光度值。
7. 浓度C 的测量：将选择开关由"A" 旋置"C" ，将已标定浓度的样品放入光路，调节浓度旋钮，使数字显示为标定值，将被测样品移入光路，即可读出被测样品的浓度。
二. 752型紫外分光光度计
1．将灵敏度旋钮调到“1”档(放大倍数最小) 。
2．接通电源预热30min 。将选择开关置于“T”挡。
3．选择所需波长，打开样品室盖，调节0%旋钮，使数字显示为“0.000”。
4．将空白液置于光路上，盖上样品室盖，使光线通过空白溶液，调节透光率旋钮，使数字显示为100.0%(T)，如果显示不到100.0%(T)，可适当增加灵敏度的挡数。
5．然后将被测溶液置于光路中，数字显示值即为被测溶液的透光率。
6．若不需测透光率，仪器显示100.0%(T)后，将选择开关调至“A”，调节吸光度旋钮，使空白液吸光度数字显示为“000.0”。再将被测溶液置于光路后，数字显示值即为溶液的吸光度。
7．若将选择开关调至“C”挡，将已知浓度的标准溶液置于光路中，调节浓度旋钮使数字显示为标定值，再将被测溶液置于光路，则可显示出相应的浓度值。
【注意事项】
1. 比色皿的使用和清洗
（1）测定波长在360nm 以上时，可用玻璃比色皿；波长在360nm 以下时，要用石英比色皿。
（2）同组使用的比色皿必须配套。可将波长选择置实际使用的波长上，各比色皿均注入蒸馏水，将其中一只的透射比调至100%处，然后测量其他各只的透射比，凡透射比之差不大于0.5%即可配套使用。
（3）比色皿的四面仅有两面系光滑透明光学玻璃，另两面则为磨毛玻璃。比色皿光学表面不能有任何污损，否则会引起光吸收的增加。因此拿取比色皿时，只能用手指接触两侧的磨毛玻璃，避免接触光学面。
（4）盛装溶液时，液体约占全部容积的2/3，比色皿中所盛溶液不能太少，否则光路不能透过待测溶液；但也不能太多，否则溶液易洒出，从而污损或腐蚀仪器。光学面如有残液可先用滤纸轻轻吸附，然后再用镜头纸或丝绸擦拭，不能使用易磨损比色皿的普通纱布。
（5）凡含有腐蚀玻璃的物质的溶液，不得长期盛放在比色皿中。
（6）每次使用后，应立即倒空或以吸液泵吸干，然后用水冲洗比色皿3～4次。必要时可用1：1的盐酸浸泡，然后用水冲洗干净。
(7) 不能将比色皿放在火焰或电炉上进行加热或干燥箱内烘烤；
2. 波长选择
选择波长是测定的关键，可根据被测物的最大吸收峰，选择合适的波长。测定时应固定波长，防止波长改变，造成错误结果。
3. 不测量时，应使样品室盖处于开启状态，否则会使光电管疲劳，数字显示不稳定。
第二节 物质代谢实验
生物体内不断地进行各种各样的化学反应（统称物质代谢），借此与周围环境进行物质交换，一方面摄取外界物质，将它们改造成为自身的组成成分，另一方面分解体内物质，产生能量，并将分解的废物排出体外。生物体内的物质代谢过程在酶的催化及神经、体液（激素等）的协调下有序地进行。由于物质代谢过程的不断进行，生命才得以延续。
实验四 血浆脂蛋白琼脂糖凝胶电泳
【实验目的】
1. 掌握琼脂糖凝胶电泳的基本原理及操作要点。
2. 掌握血浆脂蛋白的分类及各类脂蛋白的临床意义。
【实验原理】 各种血浆脂蛋白的组成、分子大小不同，在一定条件下分子所带的电荷不同，因此，在同一电场中泳动的速度有快、慢之分，以琼脂糖凝胶为支持物，按其泳动的快慢顺序可分为α脂蛋白、前β脂蛋白、β脂蛋白和乳糜微粒四条区带（正常人血浆脂蛋白可出现三条区带，在原点处无乳糜微粒）（图2-1）。该方法可应用于高脂蛋白血症分型，为高脂蛋白血症、冠心病、高血压以及心肌梗死等疾病的临床诊断提供生化指标。
电泳方向
图2-1 血浆脂蛋白电泳示意图
【实验内容与方法】
1. 血浆预染 取血清0.2ml ，加入1%苏丹黑B 染色液0.02ml ，混匀，放入37℃水浴中染色30min ，2000rpm 离心5min ，上清液即为预染血清，分出备用。
2. 制备琼脂糖凝胶板 取清洁载玻片一块平放于桌面上，用吸管吸取已融化的1%琼脂糖凝胶约4ml ，浇注于载玻片上，静置待凝胶凝固。
3. 加样（采用插滤纸法） 将双层滤纸条（长约1.2cm ，宽约0.2cm ）垂直插入已凝固的凝胶板上，距一端约2cm ，取预染血清20µl 滴加在两层小滤纸间。
4. 电泳 将凝胶板放入电泳槽中，加样端接电源阴极。板两端以四层纱布为盐桥，轻轻盖贴在凝胶板两端，纱布另一端浸于电泳槽内巴比妥缓冲液中。接通电源，每片凝胶板电流量为7～8mA ，通电约1h ，即可见到分离的脂蛋白区带。
5. 脱盐 将电泳后的凝胶板置于5%HAC和60%乙醇中浸泡脱盐2h ，再置80℃烘箱内烘干。
6. 浓度测定 用刀片切下凝胶板上的各脂蛋白色带，另外在空白区切一块大小相似的凝胶做为空白对照，分别置于盛有3.0ml 蒸馏水的试管中。各管置沸水浴中约5min ，使凝胶融化，冷却至室温后在660nm 处比色，记录吸光度。
各区带光密度总和 T =D 1+D 2+D 3+D 4
各脂蛋白的百分数
=该脂蛋白的吸光度⨯100% T
【实验准备】
1. pH8.6巴比妥缓冲液 称取巴比妥钠12.76g ， 巴比妥1.66g ，用蒸馏水800ml 加热溶解后，再加蒸馏水至1000ml 混匀。
2. 1%琼脂糖 用pH8.6巴比妥缓冲液配制
3. 1%苏丹黑染色液 用甲醇配制。
4. 5%HAC，60%乙醇
5. 仪器 离心机，微波炉，分光光度计，恒温水浴箱，电泳仪，电泳槽，吸量管，载玻片，镊子。
【注意事项】
1. 制板时，载玻片置于水平面上，吸管口垂直于玻片中央，让琼脂糖快均匀快速流出，自然铺满整个玻片。
2. 加样时，血清不能溢于滤纸外。
3. 搭桥时，样品端纱布要小心轻放，不能碰到加样槽，以免样品被吸干或将小槽拉裂。
【思考题】
1. 简述琼脂糖凝胶电泳分离脂蛋白的原理。
2. 脂蛋白电泳操作时应注意哪些问题？
3. 为什么正常人血浆脂蛋白只出现三条区带，在原点处无乳糜微粒带？
实验五 血清脂类含量分析
一、酶法测定血清中胆固醇含量
【实验目的】
1. 了解胆固醇氧化酶法测定血清胆固醇的原理。
2. 掌握血清胆固醇测定的临床意义。
【实验原理】 血清中总胆固醇（TC ）包括胆固醇酯(CE)和游离型胆固醇(FC) ，酯型占70%，游离型占30%。胆固醇酯酶（CEH ）先将胆固醇酯水解为胆固醇和游离脂肪酸（FFA ），胆固醇在胆固醇氧化酶（COD ）的作用下氧化生成Δ4-胆甾烯酮和过氧化氢。后者经过氧化物酶（POD ）催化氢与4-氨基安替比林（4-AAP ）和酚反应，生成红色的醌亚胺，其颜色深浅与胆固醇的含量呈正比，
在500nm 波长处测定吸光度，与标准管比较可计算出血清胆固醇的含量。反应式如下：
【实验内容与方法】
1. 标本 不溶血的血清或血浆标本。血浆用肝素钠、EDTA 抗凝，不可用草酸盐、氟化物。
2. 取试管3支，编号，按下操作。
表2-19 酶法测定血清胆固醇操作步骤
加入物（ul ）
血清
胆固醇标准液
蒸馏水
酶应用液 测定管 10 － － 1000 标准管 － 10 － 1000 空白管 － － 10 1000
混匀后，37℃水浴保温15min ，在500nm 波长处比色，以空白管调零，读取各管吸光度。
【计算】
ΔA标本
CHO （mmol/L）= × 标准液浓度
ΔA标准
【标准液】 胆固醇 5.17mmol/L（200mg/dL）
【正常参考范围】 血清中胆固醇 3.10～5.70mmol/L
二、酶法测定血清中甘油三酯的含量
【实验目的】
1. 了解酶法定量测定血清甘油三酯的基本原理。
2. 掌握酶法定量测定血清甘油三酯的实验方法。
【实验原理】 血清中甘油三酯经脂肪酶水解为甘油和脂肪酸，甘油在甘油激酶（GK ）及ATP 存在下，生成3-磷酸甘油，尔后，在磷酸甘油氧化酶（GPO ）作用氧化成磷酸二羟丙酮并生成过氧化氢，过氧化氢与底物4-氨基安替比林和ESPAS 在过氧化物酶（POD ）作用下，生成红色亚醌化合物，其颜色深浅与甘油三酯含量成正比。在500nm 波长处测定吸光度，与标准管比较可计算出血清甘油三酯的含量。反应式如下：
【实验内容与方法】
1. 标本 不溶血的血清或血浆标本。血浆用肝素钠、EDTA 抗凝，不可用草酸盐、氟化物。
2. 取试管3支，编号，按下操作。
表2-20 酶法测定血清胆固醇操作步骤
加入物（ul ）
血清
甘油三酯标准液
蒸馏水
酶应用液 测定管 10 － － 1000 标准管 － 10 － 1000 空白管 － － 10 1000
混匀后，37℃水浴保温15min ，在500nm 波长处比色，以空白管调零，读取各管吸光度。
【计算】
ΔA标本
CHO （mmol/L） × 标准液浓度
ΔA标准
【标准液】 甘油三酯 2.26mmol/L（200mg/dL）
【正常参考范围】 甘油三脂的正常范围 0.56~1.71mmol/L
实验六 邻甲苯胺法测血糖含量
【实验目的】
掌握邻甲苯胺法测定血糖的原理及方法。
【实验原理】 葡萄糖在浓酸溶液中（加在含有硼酸的冰醋溶液中），水浴加热至100℃左右，脱水生成羟甲基呋喃甲醛（或称羟甲基糠醛），后者能与邻甲苯胺缩合生成蓝绿色的化合物，根据颜色深浅比色测定其含量。
【实验内容与方法】
1. 取试管3支，编号，按表2-16操作
表2-16 邻甲苯胺法测定血糖含量
试剂（ml ）
血 浆
糖标准（1mg/1ml）
蒸馏水
邻甲苯胺试剂
2. 混匀，沸水浴加热10min ，取出立即置于冷水中冷却。
3. 以空白管调零，在630nm 波长处测各管吸光度值。
4. 计算 测定管OD 1000⨯标准管浓度⨯=血糖m m o /L l 标准管OD 0. 1⨯180测定管 0.1 4.0 标准管 0.1 4.0 空白管 0.1 4.0
【实验准备】
1. 试剂
（1）邻甲苯胺试剂 取硫脲2.5ｇ，溶于750ml 冰醋酸中，加邻甲苯胺150ml ，
2.4％硼酸100ml ，加冰醋酸至1000ml 混匀。置棕色瓶中，至少可保存二个月。邻甲苯胺为略带浅黄色的油状液体，易氧化，故配制前应重蒸馏。
（2）葡萄糖标准液（0.1mg/ml）
2. 器材 恒温水浴箱，分光光度计，离心机
【思考题】
1. 简述邻甲苯胺测定血糖的原理。
2. 血糖测定的临床意义主要有哪些？
实验七 糖酵解中间产物的鉴定
【实验目的】
1. 复习糖酵解的主要中间步骤及其产物，
2. 了解一碘醋酸对3-磷酸甘油醛脱氢酶的抑制作用。
【实验原理】 将酵母液在一定的介质中（适宜的pH 值，必要的金属离子等）进行保温，在酵母液中酶体系的作用下，酵母液中原来含有的糖就进行酵解反应，当反应进行到生成二分子磷酸丙糖，进一步变化是在3-磷酸甘油醛脱氢酶催化下进行的，-SH 为3-磷酸甘油醛脱氢酶的必需基团，加入一碘醋酸可与此酶的-SH 起反应，从而使酶失去活性，酵解反应就停留在磷酸丙糖阶段。
酶-SH + ICH2COOH → 酶S-CH 2COOH +HI
然后以硫酸肼为稳定剂，保护磷酸丙糖不致自发分解，使其不能向其他方向变化，结果磷酸丙糖在反应体系中堆积，从而与2，4-二硝基苯肼反应生成相应的苯腙，后者在碱性溶液中溶解呈紫红色，可借此鉴定丙糖之生成。
在成腙反应前，溶液必须先碱化并在室温放置10min ，为了使磷酸丙糖中的磷酸基水解脱去，然后生成的颜色才比较稳定。
【实验内容与方法】
1. 酵母混悬液制备 取新鲜酵母约1g 置于烧杯中，加入5％葡萄糖溶液50ml ，用玻璃棒搅拌，使成均匀的混悬液，备用。
2. 取试管3支，编号，按表2-17操作
表2-17 糖酵解中间产物的鉴定操作
管 号
试 剂（ml ） 1 2 3 pH7.4磷酸盐缓冲液 2.0 2.0 2.0 一碘醋酸 0.5 0.5 － 硫酸肼 0.5 0.5 － 10％CCl 3COOH 1.0 － － 酵母液 4.0 4.0 4.0 蒸馏水 － 1.0 2.0
混匀，在37℃恒温水浴中保温60min
一碘醋酸 － － 0.5 硫酸肼 － － 0.5 10％CCl 3COOH － 1.0 1.0 蒸馏水 2.0 1.0 －
混匀，静置10min ，离心，3000rpm/10min，再取试管，对号按下表操作 1 2 3 上清液 0.5 0.5 0.5 1mol/L NaOH 0.5 0.5 0.5
混匀，室温放置10min
2，4-二硝基苯肼 0.5 0.5 0.5 1mol/L NaOH 3.5 3.5 3.5
记录三管所发生的情况，并加以简要的分析。
【实验准备】
1. 试剂
（1）pH7.4的0.1mol/L磷酸盐缓冲液 取0.1mol/L Na 2HPO480.8ml 与0.2mol/L NaH 2PO4 19.2ml混匀即成。
（2） 0.56mol/L硫酸肼溶液 取硫酸肼7.28g ，溶于40ml 蒸馏水中，用5mol/L NaOH 调至pH7.4，然后用水稀释至100ml 。
（3）0.002mol/L一碘醋酸溶液 称ICH2COOH 0.037g ，溶于50ml 水中，用1mol/L NaOH 调至pH7.4然后用水稀释至100ml 。
（4）2，4-二硝基苯肼溶液 取2，4-二硝基苯肼0.1g ，溶于100mlL 1mol/L HCL 中，过滤，贮于棕色瓶中。
2. 器材 恒温水浴箱，分光光度计，离心机。
【思考题】
1. 糖酵解的中间产物有哪些？
2. 此实验检查的是哪些中间产物？
医学生物化学基本实验
第一节 蛋白定量分析实验
蛋白质是一切活细胞和有机体的最重要组成成分，它是构成人体及所有动物机体组织的主要部分。蛋白质是由二十种氨基酸以肽键相互连接而成的复杂的高分子化合物。蛋白质含量可通过它们的物理化学性质，如折射率﹑比重﹑紫外吸收﹑染色等测定而得知，或用化学方法，如微量凯氏定氮﹑folin-酚试剂、双缩脲反应等方法来测定，表2-1为五种蛋白质的测定方法的比较。
表 五种蛋白质测定方法比较
方 法
凯氏定氮法
(Kjedahl法)
双缩脲法
(Biuret法)
Folin-酚试剂法
(Lowry法)
考马斯亮蓝法
(Bradford法)
紫外吸收法 灵敏度 0.2～1.0mg 1～20mg 5µg 1～5µg 原 理 将蛋白质转化为氮，用酸吸收后滴定 多肽键加碱性铜离子生成紫色络合物 磷钼酸-磷钨酸试剂被Tyr 和Phe 还原 考马斯亮蓝染料与蛋白质结合时其λmax由465nm 变为595nm 蛋白质中的酪氨酸和色氨酸残基在280nm
处的光吸收
实验一 双缩脲法测定蛋白质含量
【实验目的】
掌握双缩脲法测定蛋白质浓度的原理和标准曲线的绘制。
【实验原理】 蛋白质分子中含有许多肽键，与双缩脲结构类似，在碱性溶液中能与铜离子结合成紫色的化合物（称双缩脲反应）。在一定浓度范围，颜色的深浅与蛋白质浓度成正比，故可用比色法测定蛋白质的含量。含有两个以上肽键的物质才有此反应，故氨基酸无此反应。
【实验内容与方法】
1. 标准曲线的制作
(1) 取小试管7支，编号，按表2-2操作
表2-2 双缩脲法操作步骤 干扰物质 非蛋白氮（可用三氯乙酸沉淀蛋白质而分离） 硫酸铵；Tris 缓冲液；某些氨基酸 硫酸铵；Tris 缓冲液；甘氨酸；各种硫醇 强碱性缓冲液；TritonX-100； SDS 各种嘌呤和嘧啶；各种核苷酸 50～100µg
试剂（ml ）
标准蛋白质溶液
生理盐水
双缩脲试剂 管 号 1 2 3 4 5 6 7 0.1 0.3 0.5 0.7 0.9 — 样品0.1 0.9 0.7 0.5 0.3 0.1 1.0 0.9 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0
(2) 混匀后，于37℃水浴中保温15min ，在540nm 波长下比色，以第6管调零点，测得各管的吸光度值。以各管的吸光度值为纵坐标，蛋白质的克数为横坐标，绘成曲线。
2. 样品测定 取血清（或其它蛋白质溶液）0.1ml ，加生理盐水0.9ml ，再加二缩脲试剂4ml ，于37℃水浴中放置15min ，测其吸光度，根据吸光度值查标准曲线即得出每l00ml 血清（样品）中蛋白质的克数。
【实验准备】
1. 双缩脲试剂 称取CuSO 4·5H 20 2.5g ，加水100ml ，加热助溶，另取酒石酸钾钠10g ，碘化钾5g ，溶于500ml 水中，再加5mol/L NaOH 300ml 混合，然后将硫酸铜溶液倾入，加水至1000ml ，此液可长期保存。
2. 生理盐水，标准蛋白质溶液2mg/ml
3. 仪器及玻璃器皿 721型分光光度计，水浴箱，中试管6支，l 毫升刻度吸管3支，10毫升刻度吸管1支，坐标纸
实验二 考马斯亮兰法测定蛋白质含量
【实验目的】
1. 掌握考马斯亮兰结合法对蛋白质定量测定的方法及原理 。
2. 熟悉紫外分光光度计的使用。
【实验原理】 考马斯亮兰G-250存在着两种不同的颜色，红色和蓝色。它和蛋白质通过范德华力结合，染料与蛋白质结合后颜色由红色转变成蓝色，最大吸收峰从465nm 变成595nm ，通过测定595nm 处的光吸收的增加量可知与其结合蛋白质的量。应用考马斯亮兰法的优点是：（1）灵敏度高，据估计比Lowry 法约高4倍，其最低蛋白质检测量可达1µg 。（2）测定速度快、简便，只需一种试剂。（3）干扰物质少。
【实验内容与方法】
1. 取试管3支、编号，按表2-4操作
表2-4 考马斯亮兰法测定蛋白质
试 剂（ml ） 空白管 标准管 样品管
生理盐水 0.1
标准蛋白溶液 0.1
样 品 0.1
考马斯亮蓝试剂 5.0 5.0 5.0
2. 混匀，室温放置5min ，在波长595nm 处，以空白管调零点。测定各管的吸光度值。
3. 计算
OD 样品⨯50=样品中蛋白质的含量μg /mL OD 标准
【实验准备】
1. 考马斯亮蓝试剂 称取考马斯亮蓝G-250 100mg，加95%乙醇溶液50ml ，使之溶解，再加入85%磷酸溶液100ml ，加水至1000ml 。混匀，避光放置过夜，用二层滤纸过滤，滤液用棕色瓶保存，至少可保存两周。
2. 标准蛋白溶液50µg/ml。
3. 仪器及玻璃器皿 721分光光度计，试管l0支，刻度吸管10ml 、l5ml 、lml 、0.1ml 各1支，普通玻璃比色杯4只。
实验三 紫外分光光度法测定蛋白质含量
【实验目的】
1. 掌握紫外分光光度法测定蛋白质含量的原理。
2. 熟悉紫外分光光度计的使用。
【实验原理】 蛋白质分子中含有的酪氨酸、色氨酸等芳香族氨基酸残基的苯环含有共轭双键，使蛋白质具有吸收紫外光的性质，吸收高峰在280nm 波长处。由于各种蛋白质所含芳香族氨基酸的量相差很少，因此在此波长范围内。吸收峰的吸光度值与其浓度成正比，可作定量测定。由于各种蛋白质中芳香族氨基
酸含量的不同，因而此法适于测定与所采用的标准蛋白质的氨基酸组成相似的蛋白质，以减少误差。
一般核酸在280nm 波长处也有吸收，对蛋白质测定有干扰作用，但核酸的吸收高峰在260nm ，因此溶液中同时存在核酸时，必须同时测定A 260 和A 280，通过计算消除核酸对蛋白质的影响而算出蛋白质的含量。
【实验内容与方法】
1. 280nm 的光吸收法 因蛋白质分子中的酪氨酸、色氨酸和苯丙氨酸在280nm 处具有最大吸收，且各种蛋白质的这三种氨基酸含量差别不大，因此测定蛋白质溶液在280nm 处的吸光度值是最常用的紫外吸收法。
（1）标准蛋白质溶液 任选一种蛋白质溶液，经凯氏定氮法测定蛋白质的含量，用生理盐水稀释至浓度为1mg ／ml 。
（2）取试管6支，编号，按表2-5进行操作
表2-5 紫外吸收法标准曲线
管 号
试剂（ml ）
1 2 3 4 5 6
标准蛋白质溶液 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 0 生理盐水 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 4.0
混匀后，盛于石英杯中，用紫外分光光度计，以第6管调零点，在280nm 波长下测定各管吸光度，以各管的光密度值为纵坐标，蛋白质浓度为横坐标绘制标准曲线图。
（3）样品测定 用生理盐水将待测样品的蛋白质浓度稀释成大约1mg ／ml ，取标本1.0ml ，加生理盐水3.0ml ，混匀，按上述方法测其A 280，根据标准曲线得出蛋白质的浓度。
2. 260nm 和280nm 的吸收差法 核酸对此处光有很强的吸收，在280nm 处的光吸收比蛋白质强10倍（每克），但核酸在260nm 处的吸收更强，其吸收高峰在260nm 附近。核酸在260nm 处的消光系数是280nm 处的2倍，而蛋白质则相反，280nm 紫外吸收值大于260nm 吸收值。通常：
纯蛋白质的光吸收比值：A 280nm /A260nm ≈1.8
纯核酸的光吸收比值： A 280nm /A260nm ≈0.5
含有核酸的蛋白质溶液，可分别测定其A 280nm 和A 260nm ，由此吸收差值，用下面的公式，即可计算出蛋白质的浓度。
蛋白质浓度（mg ／ml ）=1.45A280 - 0.74A260（mg/ml）
3. 215nm 与225nm 的吸收差法 蛋白质的稀溶液由于含量低而不能使用280nm 的光吸收测定时，可用215nm 与225nm 吸收值之差，通过标准曲线法来测定蛋白质稀溶液的浓度。用已知浓度的标准蛋白质溶液，配制成20～100µg/ml的一系列蛋白质溶液，取一定量分别测定215nm 与225nm 的吸光度值，并计算出吸收差：
吸收差Δ=A215nm -A 225nm
以吸收差Δ为纵坐标，蛋白质浓度为横坐标，绘出标准曲线。再测出未知样品的吸收差，即可由标准曲线上查出未知样品的蛋白质浓度。
4. 肽键测定法 蛋白质溶液在238nm 的光吸收处的强弱，与肽键的多少成正比。用已知浓度的标准蛋白质溶液，配制成50～500µg/ml的一系列蛋白质溶液，取一定量测定238nm 的吸光度值A 238nm ，以A 238nm 为纵坐标，蛋白质含量为横坐标，绘制出标准曲线。未知样品的浓度即可由标准曲线求得。
本方法比280nm 吸收法灵敏，但多种有机物，如醇、酮、醛、有机酸、酰胺类和过氧化物等都有干扰作用，所以最好用无机盐，无机碱和水溶液进行测定。若含有有机溶剂，可将样品蒸干，或用其他方法除去干扰物质，然后用水、稀酸和稀碱溶解后再作测定。
【实验准备】 紫外分光光度计，坐标纸。
附录：常用实验技术原理——分光光度技术
分光光度技术（spectrophotography ）是利用物质特有的吸收光谱来鉴别物质或测定其含量的一项技术，该技术灵敏度强，精确度高，操作简便、快速；对于复杂的组分系统，勿需分离即可检测出其中的微量组分，因此分光光度技术已成为生物学研究领域中广泛使用的方法之一。
【基本原理】
物质对光波有选择性的吸收作用，不同物质由于其分子结构不同，对不同波长光线的吸收能力也不同，有色溶液之所以呈现出不同的颜色，是由于物质对光的选择性吸收所致，有些物质能选择性吸收特定波长的紫外光或红外光，因此，
每种物质都具有其特征性的吸收光谱。分光光度法所使用的光谱范围在200nm-10μ（1μ= 1， 000nm ）之间。其中200nm －400nm 为紫外光区，400nm －760nm 为可见光区，760nm －10，000nm 为红外光区。在一定条件下，物质对光的吸收程度与该物质浓度成正比，因此可利用各种物质不同的吸收光谱及其吸收强度，对不同物质进行定性和定量分析。
分光光度技术依据的原理是Lambert-Beer 定律，该定律阐明了溶液对单色光吸收的多少与溶液浓度和溶液厚度之间的关系。当光线通过透明介质时， 溶液吸收了一部分光能，因此当光透射出溶液之后，光强度减弱。溶液浓度越大，或溶液的厚度越大（即光在溶液中所经过的路径愈长），则对光的吸收越强，光的强度减弱也愈显著。
1. 朗伯（Lambert ）定律：当一束单色光通过一光吸收介质时，光强度随吸收光介质的厚度增加而呈指数减少，即
I =e -K 1l I o
（ I 0：入射光强度，Ｉ：透射光强度，l ：介质的厚度）
式中K 为吸光系数：表示吸光物质在单位浓度和单位厚度时的吸光度，是物质的一个特征常数，由物质的性质与光的波长决定。对于同一物质和一定波长的入射光而言是一个常数。
当溶液浓度单位为mol/L，光程厚度为lcm 时的吸光系数称为摩尔吸光系数，又称摩尔吸光度，用ε表示，其单位是(L·mol -1·cm -①，一般采用ε值最大的波长进行比色测定。
2. 比尔（Beer ）定律：当一束单色光通过一光吸收介质时，光强度随介质浓度的增加而呈指数减少。即
I =e -K 2C （C:溶液浓度） I o
两者结合在一起称为朗伯-比尔（Lambert-Beer ）定律，即吸光度与溶液浓度和液层厚度的乘积成正比。
I =e -Kcl I o
透光度T 为I/I0，通常以百分率表示。
T =I =e -Kcl I o
取对数 -lg I 称为吸光度（A ）。 I o I =-lg T =A =kcl I o -lg
采用适当的光源、棱镜和适当的光源接收器，让某一波长的光透过某一溶液，通过仪器的测定，定性鉴别物质或定量测定某一组分含量的方法即为分光光度法。通过对光波长的调整，可使溶质浓度的测定范围不仅仅局限于可见光，尚可扩大到紫外光区和红外光区。经单色器（棱镜）得到的光源虽然不是纯的单色光，但波长范围更狭窄，更符合Lambert-Beer 定律，其灵敏度大为提高。
【分光光度技术的基本应用】
（一）测定溶液中物质的含量
可见或紫外分光光度法都可用于测定溶液中物质的含量。在实际测定过程中，可采用两种方法：
（1）标准管法（标准比较法）
用已知浓度的测定物（标准溶液）与待测定溶液同样处理，测定吸光度，再根据前式计算，即A 1=K1C 1L 1 ； A 2=K2C 2L 2，式中A 1、A 2分别为已知浓度标准溶液和未知浓度待测溶液的吸光度；C 1、C 2分别为已知浓度标准溶液和未知浓度待测溶液中待测物浓度。由于盛放标准液和待测液的比色杯径长相同（L 1=L2），
A 1故上二式可写成： K 1C 2=A 2K 2C 2
因标准液和待测液中溶质为同一物质，K 值相同，即：K 1=K2 可换算成下式：C 2=A 2C 1 A 1
上式为实验操作中常用的计算式。因比色皿本身和溶剂也会产生一定的光吸收，故需设置一个空白管，即其中除了待测溶质以外，其它的成分完全相同。以空白管对准光路对仪器调零，消除非待测物的吸收，所测值即为待测物的光吸收值。
（2）标准曲线法
先配制一系列已知的不同浓度的测定物溶液（标准溶液），与待测溶液同样方法处理，分别读取各管吸光度值，以各管吸光度值为纵座标，各管溶液浓度为横座标，绘制标准曲线，在一定的浓度范围内标准曲线应该是一条经过原点的直线。然后测定待测液的吸光度，即可从标准曲线上查到其相对应的浓度。
一般认为，标准曲线范围在测定物浓度的一半到二倍之间，并使吸光度在0.05～1.0范围内为宜。所作标准曲线仅供短期使用。标准曲线制作与待测管测定应在同一台仪器上进行，以避免产生误差。
物质含量测定时所用波长通常要选择被测物质的最大吸收波长，物质含量的微小变化将引起较大的吸光度差异，使灵敏度提高；同时可以避免其它物质的干扰。
（二）利用吸收光谱鉴定化合物
使用分光光度计可以绘制吸收光谱曲线。方法是用各种不同波长的单色光分别通过某一浓度的溶液，测定此溶液对每一种单色光的吸光度，然后以波长为横座标，以吸光度为纵座标绘制吸光度─波长曲线，此曲线即吸收光谱曲线。各种物质有其特征性的吸收光谱曲线，因此用吸收光谱曲线图可以进行物质种类的鉴定。当一种未知物质的吸收光谱曲线和某一已知物质的吸收光谱曲线相同时，则很可能它们是同一物质。一定物质在不同浓度时，其吸收光谱曲线中峰值的大小不同，但形状相似，即吸收高峰和低峰的波长是一定不变的。
紫外线吸收是由不饱和的结构造成的，含有双键的化合物表现出吸收峰。紫外吸收光谱比较简单，同一种物质的紫外吸收光谱应完全一致，但具有相同吸收光谱的化合物其结构不一定相同。除了特殊情况外，单独依靠紫外吸收光谱决定一个未知物结构，必须与其它方法配合。紫外吸收光谱分析主要用于已知物质的定量分析和纯度分析。
【分光光度计结构】
能够从各种波长的混合光中将单色光分离出来并检测其强度的仪器称为分光光度计。因使用的波长范围不同分光光度计可分为紫外、可见、红外以及万用（全波段）分光光度计等。
无论哪一种分光光度计其原理和结构基本相似，一般包括以下几个部件：
1. 光源 分光光度计常用的光源有两种，即钨灯和氢灯(或氘灯) 。在可见光区，近紫外光区和近红外光区常用钨灯，用作可见光分光光度计的光源。氢灯和氘灯能发射150－400nm 的紫外线，可用作紫外光区分光光度计的光源。
2. 单色器 可把混合光分解为单一波长光的装置。多用棱镜或光栅作为其色散元件。光波通过棱镜时，不同波长的光折射率不同。波长愈短，折射率则愈大。反之，波长愈长，折射率则愈小。因而能将不同波长的光分开。
3. 吸收池（比色杯、比色池） 一般由玻璃或石英制成，用来盛放待测溶液。各比色杯壁厚度等规格应尽可能完全相等，否则将产生测定误差。玻璃比色杯适用于可见光区，在紫外区测定时要用石英比色杯。
4. 检测器系统 由光电池、光电管、光电倍增管组成。
5. 测量装置 检测器产生的光电流以某种方式转变成模拟的或数字的结果，模拟输出装置包括电流表、电压表、记录器、示波器及与计算机联用等，数字输出则通过模拟／数字转换装置如数字式电压表等。现代的仪器常附有自动记录器，可自动描出记录曲线。
【常见分光光度计】
一.722型分光光度计
(一) 仪器结构：722型光栅分光光度计由光源室、单色器、样品室、光电管暗盒、电子系统及数字显示器等部件组成。工作原理见图1-1
图1-1 722型分光光度计的结构图
（二）操作方法：
1. 接通电源开关。
2. 将灵敏度旋钮调至"1" 档（放大倍率最小）。
3. 开启电源，指示灯亮，选择开关置于 "T" ，波长调至测试用波长，预热20min 。
4. 打开样品室盖（光门自动关闭），调节"0" 旋钮，使数字显示为"0.000" ，盖上样品室盖，将比色皿架处于空白液体位置，使光电管受光，调节透光率"100%"旋钮，使数字显示为"100.00" 。
5. 预热后，按步骤4连续几次调整"0" 和"100%"即可进行测定工作。
6. 将选择开关由"T" 旋置"A" ，调节吸光度调零旋钮，使数字显示为"0.000" ，然后将被测样品移入光路，显示值即为被测样品的吸光度值。
7. 浓度C 的测量：将选择开关由"A" 旋置"C" ，将已标定浓度的样品放入光路，调节浓度旋钮，使数字显示为标定值，将被测样品移入光路，即可读出被测样品的浓度。
二. 752型紫外分光光度计
1．将灵敏度旋钮调到“1”档(放大倍数最小) 。
2．接通电源预热30min 。将选择开关置于“T”挡。
3．选择所需波长，打开样品室盖，调节0%旋钮，使数字显示为“0.000”。
4．将空白液置于光路上，盖上样品室盖，使光线通过空白溶液，调节透光率旋钮，使数字显示为100.0%(T)，如果显示不到100.0%(T)，可适当增加灵敏度的挡数。
5．然后将被测溶液置于光路中，数字显示值即为被测溶液的透光率。
6．若不需测透光率，仪器显示100.0%(T)后，将选择开关调至“A”，调节吸光度旋钮，使空白液吸光度数字显示为“000.0”。再将被测溶液置于光路后，数字显示值即为溶液的吸光度。
7．若将选择开关调至“C”挡，将已知浓度的标准溶液置于光路中，调节浓度旋钮使数字显示为标定值，再将被测溶液置于光路，则可显示出相应的浓度值。
【注意事项】
1. 比色皿的使用和清洗
（1）测定波长在360nm 以上时，可用玻璃比色皿；波长在360nm 以下时，要用石英比色皿。
（2）同组使用的比色皿必须配套。可将波长选择置实际使用的波长上，各比色皿均注入蒸馏水，将其中一只的透射比调至100%处，然后测量其他各只的透射比，凡透射比之差不大于0.5%即可配套使用。
（3）比色皿的四面仅有两面系光滑透明光学玻璃，另两面则为磨毛玻璃。比色皿光学表面不能有任何污损，否则会引起光吸收的增加。因此拿取比色皿时，只能用手指接触两侧的磨毛玻璃，避免接触光学面。
（4）盛装溶液时，液体约占全部容积的2/3，比色皿中所盛溶液不能太少，否则光路不能透过待测溶液；但也不能太多，否则溶液易洒出，从而污损或腐蚀仪器。光学面如有残液可先用滤纸轻轻吸附，然后再用镜头纸或丝绸擦拭，不能使用易磨损比色皿的普通纱布。
（5）凡含有腐蚀玻璃的物质的溶液，不得长期盛放在比色皿中。
（6）每次使用后，应立即倒空或以吸液泵吸干，然后用水冲洗比色皿3～4次。必要时可用1：1的盐酸浸泡，然后用水冲洗干净。
(7) 不能将比色皿放在火焰或电炉上进行加热或干燥箱内烘烤；
2. 波长选择
选择波长是测定的关键，可根据被测物的最大吸收峰，选择合适的波长。测定时应固定波长，防止波长改变，造成错误结果。
3. 不测量时，应使样品室盖处于开启状态，否则会使光电管疲劳，数字显示不稳定。
第二节 物质代谢实验
生物体内不断地进行各种各样的化学反应（统称物质代谢），借此与周围环境进行物质交换，一方面摄取外界物质，将它们改造成为自身的组成成分，另一方面分解体内物质，产生能量，并将分解的废物排出体外。生物体内的物质代谢过程在酶的催化及神经、体液（激素等）的协调下有序地进行。由于物质代谢过程的不断进行，生命才得以延续。
实验四 血浆脂蛋白琼脂糖凝胶电泳
【实验目的】
1. 掌握琼脂糖凝胶电泳的基本原理及操作要点。
2. 掌握血浆脂蛋白的分类及各类脂蛋白的临床意义。
【实验原理】 各种血浆脂蛋白的组成、分子大小不同，在一定条件下分子所带的电荷不同，因此，在同一电场中泳动的速度有快、慢之分，以琼脂糖凝胶为支持物，按其泳动的快慢顺序可分为α脂蛋白、前β脂蛋白、β脂蛋白和乳糜微粒四条区带（正常人血浆脂蛋白可出现三条区带，在原点处无乳糜微粒）（图2-1）。该方法可应用于高脂蛋白血症分型，为高脂蛋白血症、冠心病、高血压以及心肌梗死等疾病的临床诊断提供生化指标。
电泳方向
图2-1 血浆脂蛋白电泳示意图
【实验内容与方法】
1. 血浆预染 取血清0.2ml ，加入1%苏丹黑B 染色液0.02ml ，混匀，放入37℃水浴中染色30min ，2000rpm 离心5min ，上清液即为预染血清，分出备用。
2. 制备琼脂糖凝胶板 取清洁载玻片一块平放于桌面上，用吸管吸取已融化的1%琼脂糖凝胶约4ml ，浇注于载玻片上，静置待凝胶凝固。
3. 加样（采用插滤纸法） 将双层滤纸条（长约1.2cm ，宽约0.2cm ）垂直插入已凝固的凝胶板上，距一端约2cm ，取预染血清20µl 滴加在两层小滤纸间。
4. 电泳 将凝胶板放入电泳槽中，加样端接电源阴极。板两端以四层纱布为盐桥，轻轻盖贴在凝胶板两端，纱布另一端浸于电泳槽内巴比妥缓冲液中。接通电源，每片凝胶板电流量为7～8mA ，通电约1h ，即可见到分离的脂蛋白区带。
5. 脱盐 将电泳后的凝胶板置于5%HAC和60%乙醇中浸泡脱盐2h ，再置80℃烘箱内烘干。
6. 浓度测定 用刀片切下凝胶板上的各脂蛋白色带，另外在空白区切一块大小相似的凝胶做为空白对照，分别置于盛有3.0ml 蒸馏水的试管中。各管置沸水浴中约5min ，使凝胶融化，冷却至室温后在660nm 处比色，记录吸光度。
各区带光密度总和 T =D 1+D 2+D 3+D 4
各脂蛋白的百分数
=该脂蛋白的吸光度⨯100% T
【实验准备】
1. pH8.6巴比妥缓冲液 称取巴比妥钠12.76g ， 巴比妥1.66g ，用蒸馏水800ml 加热溶解后，再加蒸馏水至1000ml 混匀。
2. 1%琼脂糖 用pH8.6巴比妥缓冲液配制
3. 1%苏丹黑染色液 用甲醇配制。
4. 5%HAC，60%乙醇
5. 仪器 离心机，微波炉，分光光度计，恒温水浴箱，电泳仪，电泳槽，吸量管，载玻片，镊子。
【注意事项】
1. 制板时，载玻片置于水平面上，吸管口垂直于玻片中央，让琼脂糖快均匀快速流出，自然铺满整个玻片。
2. 加样时，血清不能溢于滤纸外。
3. 搭桥时，样品端纱布要小心轻放，不能碰到加样槽，以免样品被吸干或将小槽拉裂。
【思考题】
1. 简述琼脂糖凝胶电泳分离脂蛋白的原理。
2. 脂蛋白电泳操作时应注意哪些问题？
3. 为什么正常人血浆脂蛋白只出现三条区带，在原点处无乳糜微粒带？
实验五 血清脂类含量分析
一、酶法测定血清中胆固醇含量
【实验目的】
1. 了解胆固醇氧化酶法测定血清胆固醇的原理。
2. 掌握血清胆固醇测定的临床意义。
【实验原理】 血清中总胆固醇（TC ）包括胆固醇酯(CE)和游离型胆固醇(FC) ，酯型占70%，游离型占30%。胆固醇酯酶（CEH ）先将胆固醇酯水解为胆固醇和游离脂肪酸（FFA ），胆固醇在胆固醇氧化酶（COD ）的作用下氧化生成Δ4-胆甾烯酮和过氧化氢。后者经过氧化物酶（POD ）催化氢与4-氨基安替比林（4-AAP ）和酚反应，生成红色的醌亚胺，其颜色深浅与胆固醇的含量呈正比，
在500nm 波长处测定吸光度，与标准管比较可计算出血清胆固醇的含量。反应式如下：
【实验内容与方法】
1. 标本 不溶血的血清或血浆标本。血浆用肝素钠、EDTA 抗凝，不可用草酸盐、氟化物。
2. 取试管3支，编号，按下操作。
表2-19 酶法测定血清胆固醇操作步骤
加入物（ul ）
血清
胆固醇标准液
蒸馏水
酶应用液 测定管 10 － － 1000 标准管 － 10 － 1000 空白管 － － 10 1000
混匀后，37℃水浴保温15min ，在500nm 波长处比色，以空白管调零，读取各管吸光度。
【计算】
ΔA标本
CHO （mmol/L）= × 标准液浓度
ΔA标准
【标准液】 胆固醇 5.17mmol/L（200mg/dL）
【正常参考范围】 血清中胆固醇 3.10～5.70mmol/L
二、酶法测定血清中甘油三酯的含量
【实验目的】
1. 了解酶法定量测定血清甘油三酯的基本原理。
2. 掌握酶法定量测定血清甘油三酯的实验方法。
【实验原理】 血清中甘油三酯经脂肪酶水解为甘油和脂肪酸，甘油在甘油激酶（GK ）及ATP 存在下，生成3-磷酸甘油，尔后，在磷酸甘油氧化酶（GPO ）作用氧化成磷酸二羟丙酮并生成过氧化氢，过氧化氢与底物4-氨基安替比林和ESPAS 在过氧化物酶（POD ）作用下，生成红色亚醌化合物，其颜色深浅与甘油三酯含量成正比。在500nm 波长处测定吸光度，与标准管比较可计算出血清甘油三酯的含量。反应式如下：
【实验内容与方法】
1. 标本 不溶血的血清或血浆标本。血浆用肝素钠、EDTA 抗凝，不可用草酸盐、氟化物。
2. 取试管3支，编号，按下操作。
表2-20 酶法测定血清胆固醇操作步骤
加入物（ul ）
血清
甘油三酯标准液
蒸馏水
酶应用液 测定管 10 － － 1000 标准管 － 10 － 1000 空白管 － － 10 1000
混匀后，37℃水浴保温15min ，在500nm 波长处比色，以空白管调零，读取各管吸光度。
【计算】
ΔA标本
CHO （mmol/L） × 标准液浓度
ΔA标准
【标准液】 甘油三酯 2.26mmol/L（200mg/dL）
【正常参考范围】 甘油三脂的正常范围 0.56~1.71mmol/L
实验六 邻甲苯胺法测血糖含量
【实验目的】
掌握邻甲苯胺法测定血糖的原理及方法。
【实验原理】 葡萄糖在浓酸溶液中（加在含有硼酸的冰醋溶液中），水浴加热至100℃左右，脱水生成羟甲基呋喃甲醛（或称羟甲基糠醛），后者能与邻甲苯胺缩合生成蓝绿色的化合物，根据颜色深浅比色测定其含量。
【实验内容与方法】
1. 取试管3支，编号，按表2-16操作
表2-16 邻甲苯胺法测定血糖含量
试剂（ml ）
血 浆
糖标准（1mg/1ml）
蒸馏水
邻甲苯胺试剂
2. 混匀，沸水浴加热10min ，取出立即置于冷水中冷却。
3. 以空白管调零，在630nm 波长处测各管吸光度值。
4. 计算 测定管OD 1000⨯标准管浓度⨯=血糖m m o /L l 标准管OD 0. 1⨯180测定管 0.1 4.0 标准管 0.1 4.0 空白管 0.1 4.0
【实验准备】
1. 试剂
（1）邻甲苯胺试剂 取硫脲2.5ｇ，溶于750ml 冰醋酸中，加邻甲苯胺150ml ，
2.4％硼酸100ml ，加冰醋酸至1000ml 混匀。置棕色瓶中，至少可保存二个月。邻甲苯胺为略带浅黄色的油状液体，易氧化，故配制前应重蒸馏。
（2）葡萄糖标准液（0.1mg/ml）
2. 器材 恒温水浴箱，分光光度计，离心机
【思考题】
1. 简述邻甲苯胺测定血糖的原理。
2. 血糖测定的临床意义主要有哪些？
实验七 糖酵解中间产物的鉴定
【实验目的】
1. 复习糖酵解的主要中间步骤及其产物，
2. 了解一碘醋酸对3-磷酸甘油醛脱氢酶的抑制作用。
【实验原理】 将酵母液在一定的介质中（适宜的pH 值，必要的金属离子等）进行保温，在酵母液中酶体系的作用下，酵母液中原来含有的糖就进行酵解反应，当反应进行到生成二分子磷酸丙糖，进一步变化是在3-磷酸甘油醛脱氢酶催化下进行的，-SH 为3-磷酸甘油醛脱氢酶的必需基团，加入一碘醋酸可与此酶的-SH 起反应，从而使酶失去活性，酵解反应就停留在磷酸丙糖阶段。
酶-SH + ICH2COOH → 酶S-CH 2COOH +HI
然后以硫酸肼为稳定剂，保护磷酸丙糖不致自发分解，使其不能向其他方向变化，结果磷酸丙糖在反应体系中堆积，从而与2，4-二硝基苯肼反应生成相应的苯腙，后者在碱性溶液中溶解呈紫红色，可借此鉴定丙糖之生成。
在成腙反应前，溶液必须先碱化并在室温放置10min ，为了使磷酸丙糖中的磷酸基水解脱去，然后生成的颜色才比较稳定。
【实验内容与方法】
1. 酵母混悬液制备 取新鲜酵母约1g 置于烧杯中，加入5％葡萄糖溶液50ml ，用玻璃棒搅拌，使成均匀的混悬液，备用。
2. 取试管3支，编号，按表2-17操作
表2-17 糖酵解中间产物的鉴定操作
管 号
试 剂（ml ） 1 2 3 pH7.4磷酸盐缓冲液 2.0 2.0 2.0 一碘醋酸 0.5 0.5 － 硫酸肼 0.5 0.5 － 10％CCl 3COOH 1.0 － － 酵母液 4.0 4.0 4.0 蒸馏水 － 1.0 2.0
混匀，在37℃恒温水浴中保温60min
一碘醋酸 － － 0.5 硫酸肼 － － 0.5 10％CCl 3COOH － 1.0 1.0 蒸馏水 2.0 1.0 －
混匀，静置10min ，离心，3000rpm/10min，再取试管，对号按下表操作 1 2 3 上清液 0.5 0.5 0.5 1mol/L NaOH 0.5 0.5 0.5
混匀，室温放置10min
2，4-二硝基苯肼 0.5 0.5 0.5 1mol/L NaOH 3.5 3.5 3.5
记录三管所发生的情况，并加以简要的分析。
【实验准备】
1. 试剂
（1）pH7.4的0.1mol/L磷酸盐缓冲液 取0.1mol/L Na 2HPO480.8ml 与0.2mol/L NaH 2PO4 19.2ml混匀即成。
（2） 0.56mol/L硫酸肼溶液 取硫酸肼7.28g ，溶于40ml 蒸馏水中，用5mol/L NaOH 调至pH7.4，然后用水稀释至100ml 。
（3）0.002mol/L一碘醋酸溶液 称ICH2COOH 0.037g ，溶于50ml 水中，用1mol/L NaOH 调至pH7.4然后用水稀释至100ml 。
（4）2，4-二硝基苯肼溶液 取2，4-二硝基苯肼0.1g ，溶于100mlL 1mol/L HCL 中，过滤，贮于棕色瓶中。
2. 器材 恒温水浴箱，分光光度计，离心机。
【思考题】
1. 糖酵解的中间产物有哪些？
2. 此实验检查的是哪些中间产物？