高效液相色谱在天然产物分离纯化中的应用
学生：李婷婷 专业：分析化学 学号：20150256
【摘要】天然产物中的成分复杂，有的达到几十种甚至上百种，因此对其化学成分的分离纯化一直以来就是一项很艰巨的工作。可是由于传统的方法不仅步骤繁琐，有机溶剂也消耗过大，而且最终的产率及纯度都很低，所以需要采用一种新型的分离与纯化方法，HPLC 正可以解决这一问题并且据统计,80%的天然药物宜采用高效液相色谱分析。目前, 高效液相色谱己经在中药鉴定、中药制剂的质控方面起到了重要的作用, 并广泛的应用于糖类、萜类、黄
[1-2][3-5]酮、生物碱、苷类、有机酸等。
【关键词】高效液相色谱 天然产物 分离纯化
1、 HPLC分离纯化糖类及其衍生物
糖类是植物光合作用的初生产物，是一类最丰富的天然产物，糖类在植物中的分布十分广泛，常占有植物干重的80-90%。糖类根据碳链的长短可分为单糖、低聚糖和多糖[6]。在糖类的提取方面，P.Abreu 等[7]用制备色谱纯化了来自植物Sarcocephalus latifolius中的糖类物质。他们首先将提出的糖类混合物甲酰化合，用正相的PHPLC 以己烷-乙酸乙酯为流动相进行梯度（90:10到10:90）洗脱，进样量为250mg 将其分离为11个组分，每个组分再用PHPLC 或制备薄层色谱等进一步纯化和，发现上一步得到的组分有的是纯品有的为混合物，经过两次纯化后得到3个纯品。将这些纯品用配有示差法折光检测器的HPLC 定量，用核磁确定化合物的结构。
2 、HPLC 分离纯化萜类化合物
萜类化合物是广泛存在于植物和动物体内的有机化合物，随着人类对萜类化合物的深入研究和不断的开发利用，其分析方法也得到了快速的发展，高效液相色谱也广泛的应用于萜类化合物的研究中[8]。张建州等[9]用HPLC 法测定樟脑丸中奈的含量，并与GC 法进行比较。结果表明，HPLC 法所消耗的样品量少仅为GC 法的1/100-1/10，HPLC 的检出下线为8.541x10-2ug 。
3、HPLC 分离纯化黄酮类化合物
黄酮类化合物是天然产物中非常重要的一类化合物，现代证明黄酮类化合物是一种很强的抗氧化剂, 可有效清除体内的氧自由基, 可以降低胆固醇, 改善血液循环, 预防心脑血管疾病, 可以治疗糖尿病, 具有抗肿瘤、抗炎等作用[10-14]。曲丽萍等[15]从淡豆鼓中提取黄酮类物质，先采用索氏提取法除去脂溶性成分，再经过1300型大孔树脂初步分离纯化，再用不同浓度的乙醇梯度洗脱，其中对40%乙醇
洗脱流分采用反相高效液相色谱法制备。结果所得到的黄酮苷单体，大豆苷，黄豆苷和燃料木苷化合物的纯度高达99%以上。邹燿洪等[16]以反相高效液相色谱法，用RH-C18柱为固定相，甲醇-水-甲酸为流动相，辅助以二极管振列紫外检测技术，从杨梅叶中分离和制备了四种黄酮醇苷和一种黄酮醇经过波谱分析确定了化学结构，并以蒽为内标测定了杨梅叶中五种黄酮类化合物的含量。张强等[17]，以乙腈/0.1%乙甲酸水溶液为流动相进行了线性梯度洗脱，红车轴中的异黄酮类化合物得到了理想的分离效果。田娜等[18]，用60%的乙醇回流提取荷叶，粗提取浓缩后经D-101柱及聚酰胺柱色谱分离，再用Symmetry prepTM C18柱分离，以水-
乙腈为流动相进行梯度洗脱（流速为5.0ml/min)得到了三种黄酮类化合物。Wang [19]等以95%的甲醇溶液对虎杖中白藜声醇进行超声提取, 以乙酸-乙腈溶液为流动相, 采用梯度洗脱的HPLC 法分离检测了白藜戸醇的含量。结果表明, 该方法简单快速, 不需要大孔的树脂填充柱, 有机溶剂用量少, 最后得到的产物量增加了 4倍, 高达74%。
4、HPLC 分离纯化生物碱类化合物
生物碱是天然的含氮化合物，大多具有较强的抗肿瘤活性[20]。Mueller 等[21]采用多种型号的制备色谱柱，以甲醇-水为流动相进行梯度洗脱，从上长在澳大利亚的植物Mitrephora divers folia 中分离得到抗疟药芴酮生物碱。张敬彩[22]用甲醇/水/甲酸（10/90/0.2,v/v/v)给千层塔提取物分离并定容后，过膜直接分析。色谱分离选用XCharge C18色谱柱，以水和乙腈（含0.09%三氟乙酸）为流动相进行梯度洗脱，流速为2ml/min可以很快速的完成石杉碱甲的快速分离分析。何志红等[23]，用C18色谱柱，以乙腈：0.05ml/l磷酸二氢钾40:60（内含0.015mol/l十二烷基磺酸钠）使巴丁饤、小劈碱、黄连碱、表小劈碱和药根碱得到了很好的分离。罗猛等[24]采用高效液相色谱法同时分离测定4种长春花吲哚类生物碱。以水：二乙胺=986:14用磷酸调节PH=7.2（溶液A) ，甲醇：乙腈=4:1（溶液B) ，380mlA 和620mlB 混合作为流动相，流速为2ml/min进样量为10ul ，220nm 下检测，以恒流洗脱方式在25min 内分离长春碱等4种成分。
5、HPLC 分离苷类化合物
Peng Y等[25]，大花红景天中提取红景花苷以Phencm enex ODS为色谱柱，用甲醇-水（11:89）为流动相进行洗脱，流速为4.7min/min,得到的红景天苷的纯度
为98%。王华等[26]在葡萄果皮中提取二甲花翠素苷，以PREP-ODS(H)kit为色谱柱，乙腈-水-甲醇为流动相梯度洗脱，流速为11ml/min,得到的二甲花翠素苷纯度高达98.1%。Abde 等[27]用Senshu Pak pegasilODS色谱柱, 乙腈：水（70:30）为流动相，流速为4mL/min，从Caralluma tuberculata 中提取孕甾烷苷类化合物。 Yang[28]等，用WatersPrep C18色谱柱以乙腈-水(10：90）为流动相，从龙胆泻肝汤中提取环烯醚萜苷类。 Choudhary等[29]，用YMC ODS-H80,ODS-L80色谱柱，以乙醇-水（50:50）为流动相从Spiraea canescens 中分离得到山奈黄素苷。
6、HPLC 分离有机酸化合物
有机酸是分子结构中含有羧酸的一类有机化合物，在中草药中叶、根特别是果实中广泛存在。Lu 等[30]从石榴壳中分离得到没食子酸，采用色谱柱Symmetry prep TM C18柱，流动相为甲醇-0.2%的三氟乙酸，结果从500g 的粗提取物中得到
15mg 的没食子酸单体，纯度可达96%。邹登峰等[31]采用柱色谱对杜仲和车前子进行处理，再用制备型液相色谱分离得到景尼品甘酸，所用的色谱柱为Pure 2871 C18柱，流动相为甲醇-水-乙酸（40:60:0.5），产品纯度为98.69%。张媛等[32]从多枝怪柳中分离制备得到12个化合物，其中包括异阿魏酸等有机酸类活性化合物成分，其中异阿魏酸制备色谱柱为Prep Nova-PakR HP C18柱，其中流动相为甲醇-水(40:60)。吕寒等[33]用高效液相色谱从枇杷中分离提取得到山楂酸，科罗索酸等化合物，色谱柱为YMC ODS-A流动相为甲醇-水（85:15）。
展望：采用HPLC 不仅能从天然产物中分离得到高纯度的化合物单体，而且产率高，速度快，操作简便，便于收集[34]。但是由于天然产物种类丰富，用HPLC 进行提取分离在条件或工艺上还有很多需要摸索和改进。而随着中药提取分离技术的普及应用，将高效液相色谱与其他技术联用，将会实现各种技术的优劣互补。但是有一点毋庸置疑，作为一种高效的分离纯化技术，HPLC 在中药现代化中具有很广阔的发展与应用前景[35]。
参考文献
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高效液相色谱在天然产物分离纯化中的应用
学生：李婷婷 专业：分析化学 学号：20150256
【摘要】天然产物中的成分复杂，有的达到几十种甚至上百种，因此对其化学成分的分离纯化一直以来就是一项很艰巨的工作。可是由于传统的方法不仅步骤繁琐，有机溶剂也消耗过大，而且最终的产率及纯度都很低，所以需要采用一种新型的分离与纯化方法，HPLC 正可以解决这一问题并且据统计,80%的天然药物宜采用高效液相色谱分析。目前, 高效液相色谱己经在中药鉴定、中药制剂的质控方面起到了重要的作用, 并广泛的应用于糖类、萜类、黄
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【关键词】高效液相色谱 天然产物 分离纯化
1、 HPLC分离纯化糖类及其衍生物
糖类是植物光合作用的初生产物，是一类最丰富的天然产物，糖类在植物中的分布十分广泛，常占有植物干重的80-90%。糖类根据碳链的长短可分为单糖、低聚糖和多糖[6]。在糖类的提取方面，P.Abreu 等[7]用制备色谱纯化了来自植物Sarcocephalus latifolius中的糖类物质。他们首先将提出的糖类混合物甲酰化合，用正相的PHPLC 以己烷-乙酸乙酯为流动相进行梯度（90:10到10:90）洗脱，进样量为250mg 将其分离为11个组分，每个组分再用PHPLC 或制备薄层色谱等进一步纯化和，发现上一步得到的组分有的是纯品有的为混合物，经过两次纯化后得到3个纯品。将这些纯品用配有示差法折光检测器的HPLC 定量，用核磁确定化合物的结构。
2 、HPLC 分离纯化萜类化合物
萜类化合物是广泛存在于植物和动物体内的有机化合物，随着人类对萜类化合物的深入研究和不断的开发利用，其分析方法也得到了快速的发展，高效液相色谱也广泛的应用于萜类化合物的研究中[8]。张建州等[9]用HPLC 法测定樟脑丸中奈的含量，并与GC 法进行比较。结果表明，HPLC 法所消耗的样品量少仅为GC 法的1/100-1/10，HPLC 的检出下线为8.541x10-2ug 。
3、HPLC 分离纯化黄酮类化合物
黄酮类化合物是天然产物中非常重要的一类化合物，现代证明黄酮类化合物是一种很强的抗氧化剂, 可有效清除体内的氧自由基, 可以降低胆固醇, 改善血液循环, 预防心脑血管疾病, 可以治疗糖尿病, 具有抗肿瘤、抗炎等作用[10-14]。曲丽萍等[15]从淡豆鼓中提取黄酮类物质，先采用索氏提取法除去脂溶性成分，再经过1300型大孔树脂初步分离纯化，再用不同浓度的乙醇梯度洗脱，其中对40%乙醇
洗脱流分采用反相高效液相色谱法制备。结果所得到的黄酮苷单体，大豆苷，黄豆苷和燃料木苷化合物的纯度高达99%以上。邹燿洪等[16]以反相高效液相色谱法，用RH-C18柱为固定相，甲醇-水-甲酸为流动相，辅助以二极管振列紫外检测技术，从杨梅叶中分离和制备了四种黄酮醇苷和一种黄酮醇经过波谱分析确定了化学结构，并以蒽为内标测定了杨梅叶中五种黄酮类化合物的含量。张强等[17]，以乙腈/0.1%乙甲酸水溶液为流动相进行了线性梯度洗脱，红车轴中的异黄酮类化合物得到了理想的分离效果。田娜等[18]，用60%的乙醇回流提取荷叶，粗提取浓缩后经D-101柱及聚酰胺柱色谱分离，再用Symmetry prepTM C18柱分离，以水-
乙腈为流动相进行梯度洗脱（流速为5.0ml/min)得到了三种黄酮类化合物。Wang [19]等以95%的甲醇溶液对虎杖中白藜声醇进行超声提取, 以乙酸-乙腈溶液为流动相, 采用梯度洗脱的HPLC 法分离检测了白藜戸醇的含量。结果表明, 该方法简单快速, 不需要大孔的树脂填充柱, 有机溶剂用量少, 最后得到的产物量增加了 4倍, 高达74%。
4、HPLC 分离纯化生物碱类化合物
生物碱是天然的含氮化合物，大多具有较强的抗肿瘤活性[20]。Mueller 等[21]采用多种型号的制备色谱柱，以甲醇-水为流动相进行梯度洗脱，从上长在澳大利亚的植物Mitrephora divers folia 中分离得到抗疟药芴酮生物碱。张敬彩[22]用甲醇/水/甲酸（10/90/0.2,v/v/v)给千层塔提取物分离并定容后，过膜直接分析。色谱分离选用XCharge C18色谱柱，以水和乙腈（含0.09%三氟乙酸）为流动相进行梯度洗脱，流速为2ml/min可以很快速的完成石杉碱甲的快速分离分析。何志红等[23]，用C18色谱柱，以乙腈：0.05ml/l磷酸二氢钾40:60（内含0.015mol/l十二烷基磺酸钠）使巴丁饤、小劈碱、黄连碱、表小劈碱和药根碱得到了很好的分离。罗猛等[24]采用高效液相色谱法同时分离测定4种长春花吲哚类生物碱。以水：二乙胺=986:14用磷酸调节PH=7.2（溶液A) ，甲醇：乙腈=4:1（溶液B) ，380mlA 和620mlB 混合作为流动相，流速为2ml/min进样量为10ul ，220nm 下检测，以恒流洗脱方式在25min 内分离长春碱等4种成分。
5、HPLC 分离苷类化合物
Peng Y等[25]，大花红景天中提取红景花苷以Phencm enex ODS为色谱柱，用甲醇-水（11:89）为流动相进行洗脱，流速为4.7min/min,得到的红景天苷的纯度
为98%。王华等[26]在葡萄果皮中提取二甲花翠素苷，以PREP-ODS(H)kit为色谱柱，乙腈-水-甲醇为流动相梯度洗脱，流速为11ml/min,得到的二甲花翠素苷纯度高达98.1%。Abde 等[27]用Senshu Pak pegasilODS色谱柱, 乙腈：水（70:30）为流动相，流速为4mL/min，从Caralluma tuberculata 中提取孕甾烷苷类化合物。 Yang[28]等，用WatersPrep C18色谱柱以乙腈-水(10：90）为流动相，从龙胆泻肝汤中提取环烯醚萜苷类。 Choudhary等[29]，用YMC ODS-H80,ODS-L80色谱柱，以乙醇-水（50:50）为流动相从Spiraea canescens 中分离得到山奈黄素苷。
6、HPLC 分离有机酸化合物
有机酸是分子结构中含有羧酸的一类有机化合物，在中草药中叶、根特别是果实中广泛存在。Lu 等[30]从石榴壳中分离得到没食子酸，采用色谱柱Symmetry prep TM C18柱，流动相为甲醇-0.2%的三氟乙酸，结果从500g 的粗提取物中得到
15mg 的没食子酸单体，纯度可达96%。邹登峰等[31]采用柱色谱对杜仲和车前子进行处理，再用制备型液相色谱分离得到景尼品甘酸，所用的色谱柱为Pure 2871 C18柱，流动相为甲醇-水-乙酸（40:60:0.5），产品纯度为98.69%。张媛等[32]从多枝怪柳中分离制备得到12个化合物，其中包括异阿魏酸等有机酸类活性化合物成分，其中异阿魏酸制备色谱柱为Prep Nova-PakR HP C18柱，其中流动相为甲醇-水(40:60)。吕寒等[33]用高效液相色谱从枇杷中分离提取得到山楂酸，科罗索酸等化合物，色谱柱为YMC ODS-A流动相为甲醇-水（85:15）。
展望：采用HPLC 不仅能从天然产物中分离得到高纯度的化合物单体，而且产率高，速度快，操作简便，便于收集[34]。但是由于天然产物种类丰富，用HPLC 进行提取分离在条件或工艺上还有很多需要摸索和改进。而随着中药提取分离技术的普及应用，将高效液相色谱与其他技术联用，将会实现各种技术的优劣互补。但是有一点毋庸置疑，作为一种高效的分离纯化技术，HPLC 在中药现代化中具有很广阔的发展与应用前景[35]。
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