除草剂抗性基因

生物技术进展

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除草剂抗性基因的研究进展

王国增，李轶女，张志芳，沈桂芳

中国农业科学院生物技术研究所，北京100081摘

要：概述了除草剂抗性基因的种类，主要来源以及抗除草剂基因的应用。并对新的抗除草剂基因的发掘、既有的抗

除草剂抗性机理研究以及新的抗除草剂作物的培育等方面的进一步研究进行了探讨。除草剂基因的改良、

关键词：农作物；除草剂抗性；基因工程；转基因DOI ：10．3969/j．issn．2095-2341．2011．06．03

Advances of Herbicide Resistance Genes

WANG Guo-zeng ，LI Yi-nv ，ZHANG Zhi-fang ，SHEN Gui-fang *

Biotechnology Research Institute ，Chinese Academy of Agricultural Sciences ，Beijing 100081，China

Abstract ：This review overviewed mainly about the kinds of herbicide resistance genes ，their main resource and the application of herbicide resistance genes．Moreover ，we also discussed the discovery of the novel herbicide resistance genes ，the modification of herbicide resistance gene using genetic and protein engineering ，the mechanisms of herbicide resistance and new herbicide resistance transgenic crops breeding．

Key words ：plant crops ；herbicide-resistance ；genetic engineering ；transgene

杂草是农作物生长过程中不需要的植物，它们与农作物在水分、营养、阳光和空间上形成竞争而导致农作物的减产并降低作物的品质

［1］

用以及农业操作具有重要的意义

育种的方法选育抗性作物品种具有很大的局限性。随着生物技术的发展，利用基因工程的方法将除草剂抗性基因转入农作物从而培育抗除草剂转基因作物新品种已成为主要的方法

［4］

。为

了减少农作物因杂草的危害而带来的经济损失，减少除草的劳动量，人们逐步在作物栽培过程中开发并使用除草剂。除草剂是一类通过干扰植物的一个或多个重要的代谢过程如光合作用、氨基酸或蛋白质的合成、脂肪的合成、色素的合成、呼细胞分化等来损害或杀死植物吸过程、

［2］

对不同类型除草剂作用机制的深入了解、新除草剂抗性基因的发现及通过蛋白质工程的改良和转化技术的发展，抗除草剂作物的开发已经成为作物基因工程研究最活跃的领域之一。

。20世

4-4-D ）的研制成纪40年代2，二氯苯氧乙酸（2，功开创了化学除草剂研发和应用的新纪元。然而，除草剂在杀死杂草的同时也会对作物产生不同程度的损害作用。自1970年发现欧洲千里光（Senecio vulgaris ）对均－三氮苯除草剂的抗性后，在很多杂草及微生物中都发现了除草剂的抗性。培育抗除草剂的作物新品种对于扩大除草剂的应

除草剂的种类丰富多样，按照不同的分类方法有不同的类型。根据对杂草和作物的选择性的不同可分为选择性除草剂（selective herbicide ）和selective 非选择性除草剂或灭生性除草剂（non-

1抗除草剂基因的种类

08-07；接受日期：2011-09-25收稿日期：2011-基金项目：国家自然科学基金项目（31070139）资助。

mail ：wgz1017@163．com 。*通讯作者：沈桂芳，作者简介：王国增，博士，主要从事分子微生物学方面的研究。E-研究员，主要从事叶

mail ：zhangzf@mail．caas．net．cn 绿体基因工程研究。E-

櫅櫅櫅櫅櫅殯

［3］

2011年第1卷第6期398 402

Current Biotechnology ISSN 2095-2341

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櫅櫅殯

进展评述

Reviews

。通过常规

。随着

王国增，等：除草剂抗性基因的研究进展

399

herbicide ）。选择性除草剂在一定剂量范围内，能杀死杂草，而对作物无毒害，或毒害很低。灭生性如草甘膦、百除草剂对作物和杂草都有毒害作用，

草枯等。除草剂主要是通过抑制或干扰植物关键

［2］

除草剂按照作的代谢过程而损害或杀死植物，

用方式的不同，可以分为：①光合作用抑制剂，如光合电子传递抑制剂的三氮苯，分流光合电子传递链的电子的联吡啶，抑制光合磷酸化的二苯醚，抑制色素生物合成的吡氟酰草胺等。②氨基酸合成抑制剂，如抑制芳香氨基酸合成的草甘膦，抑制支链氨基酸合成的磺酰脲、咪唑啉酮和磺酰胺，抑制谷氨酰胺合成的草丁膦等。③脂肪酸合成抑制如芳氧苯氧丙酸、环已烯酮，硫代胺基甲酸酯、剂，

哒嗪酮等。④微管形成抑制剂，如二硝基苯胺。4-D 、2甲4氯等具有植物⑤生长素干扰剂，如2，激素作用的物质。除草剂进入植物体后，经过运输达到作用部位与靶蛋白结合并发生效应。这些靶蛋白大部分是植物生理代谢过程中所必须

［5］

的酶。

截至2010年7月，在国内登记的除草剂的品其中登记品种数量最多的为苄嘧磺种有106种，

隆、草甘膦和百草枯。但是随着除草剂高频率的植物对除草剂产生了抗性。此外，土壤重复使用，

中有些微生物也能够分解除草剂，使其失去活性。

［6］

与除草剂抗性相关的基因主要有两类：①除草剂靶蛋白突变基因。除草剂靶蛋白发生突变而导致其对除草剂不敏感，作物吸收除草剂后仍能进行正常的代谢。这类除草剂抗性基因较多，包括各种除草剂的靶蛋白的突变基因。例如，除草剂草甘膦影响莽草酸途径，其作用靶标酶是5-3-烯醇式丙酮酸莽草酸-磷酸合成酶（EPSPS ），后者是莽草酸途径的一个非常重要的酶，它的作3-用是缩合莽草酸-磷酸和磷酸烯醇式丙酮酸产3-生5-烯醇式丙酮酸莽草酸-磷酸和无机磷酸，是三种芳香氨基酸和很多次生芳香物合成的必经途径。从具有草甘膦抗性的牛筋草中分离的EPSPS 突变基因，就是在EPSPS 的非常保守的区段的第106位的脯氨酸突变为丝氨酸［7］。②修饰除草剂的酶或酶系统编码基因。很多微生物产生能修饰除草剂的酶或酶系统，在除草剂发生作用前将其降解或解毒。例如，自土壤细菌Klebsilla 中克隆得到的bxn 基因的编码产物为睛水解酶

（nitrilase ），是能够水解oxynil 类除草剂为无植物毒性的化合物

［8］

。

2抗除草剂基因的来源

从总体上来说，抗除草剂基因主要分为植物

来源和微生物来源两大类。

植物来源的抗除草剂基因主要是一些除草剂作用靶蛋白的突变体编码基因。截至2009年7月，已发现的抗不同种类除草剂杂草的数量分别是：抗三氮苯类除草剂的杂草总数为90种；抗乙酰羟酸合酶抑制剂类除草剂的杂草有101种；抗乙酰辅酶A 羧化酶抑制剂类除草剂的杂草有364-种；抗草甘膦的杂草有16种；抗2，二硝基苯胺的杂草有10种；抗合成激素的杂草有26种。在

［5］

这些抗除草剂杂草中发现了靶蛋白的突变体，如三氮苯除草剂主要是通过竞争性与光合系统复合体Ⅱ（PS Ⅱ）D1蛋白上的质体醌（PQ ）结合位点，从而阻止了电子链的传递以及NADPH 和ATP 的形成和碳的还原，最终导致细胞死亡。抗三氮苯类除草剂的杂草就是因为编码D1蛋白的基因psbA 上的PQ 结合位点上发生了点突变（Ser-264-Gly ），该位点的突变阻止了三氮苯类除从而草剂与D1蛋白的结合但不影响PQ 的结合，

［5，9］

。此外psbA 基因上其他位点的突变形成抗性

也会导致抗性形成

［10，11］

。

微生物来源的抗除草剂基因既包括除草剂作也包含除草剂的修用靶蛋白的突变体编码基因，

饰酶编码基因。常见的微生物来源的除草剂作用

［12］

靶蛋白的突变体编码基因为草甘膦抗性基因，已在Salmonella typhimurium 、Agrobacterium sp．

CP4、Achromobacter sp．LBAA 、Pseudomonas sp．PG2982、S．pneumoniae 和Staphylococcus aureus 等

［13，14］

。微生物中发现了具有抗性的EPSPS 基因Park 等［15］还对来源于Streptococcus pneumoniae 的

EPSPS 进行了结晶并对结合位点进行了分析，通过底物结合和非底物结合蛋白质构象的比较，揭示了该酶的配体结合及结构域的变化特征，为进一步的定点突变研究奠定了基础。微生物来源的如在Streptomyces hygro-除草剂修饰酶编码基因，

scopicus 中发现的抗双丙氨磷的bar 基因［16］，此外，从微生物中还找到了草甘膦氧化还原酶和乙

400

生物技术进展Current Biotechnology

酰转移酶，这两种酶的作用能将草甘膦代谢或修饰从而起到解毒作用

［14，17，18］

。

农杆菌介导转化的植物来说非常有效。此外，未

成熟胚的电穿孔法、原生质体PEG 介导法和花粉管导入法也被用于抗除草剂基因的转化。

抗除草剂转基因作物的培育和推广，提高了农田除草效率，产生了巨大的经济效益。2010年全球转基因作物的种植面积更是达到1．48亿hm 2，种植国家达29个。其中，抗除草剂性状在转基因作物的所有性状中一直占主导地位。自1983年第一例抗除草剂转基因烟草问世以来，通过转基因技术已培育将近300种抗除草剂植物品种。主要有抗草甘膦、草铵膦、莠去津、溴苯腈、2，4-D 、咪唑啉酮和磺酰脲类等除草剂的转基因作物。其中抗草甘膦转基因大豆在转基因作物中位居首位，其次是抗草甘膦和草胺膦的玉米。随着除草剂抗性基因的不断发现以及遗传化技术的不

4-D 断成熟，获得了越来越多的抗除草剂作物。2，是一种高效的、低成本的广谱除草剂，它也能够控

［21］

制产生草甘膦抗性的杂草。Wright 等发现细菌来源的芳氧基链烷酸酯双加氧酶（AAD ）能够

4-D 及其类似物。将该酶基因转到有效地降解2，

拟南芥和大豆中，发现它们都对芳氧苯氧基玉米、

丙酸酯类除草剂具有很强的抗性。抗芳氧苯氧基丙酸酯类除草剂的转基因作物的出现，能够使杂草治理的方法趋于多样性，从而防止由单一的除草剂的使用造成的杂草种群变化等环境问题。

3．1

抗除草剂基因的应用及现状

作为遗传转化的筛选标记基因

抗除草剂基因可作为遗传转化的筛选标记基

因。其原理是将抗除草剂基因与目的基因串连构

建到同一载体上进行转化，在培养基中加入一定量的除草剂进行筛选，阳性转化体具有抗除草剂的特性而可以生长，非转化体因无抗性就会被杀死。抗除草剂基因作为筛选标记基因具有产生的假转化体少和并能给作物带来有用的农业性状的

［4］

已越来越多地应用于植物遗传转化。其优点，

中bar 基因是应用最广的抗除草剂选择标记基

［19］

因。Nakamura 等利用bar 基因作为筛选标记构建了用于植物遗传转化的高通量载体。此外抗草甘膦的aroA 基因、抗溴本腈的bxn 基因和抗绿磺隆的csrl 基因等也已成功地应用于不同作物的

［20］

遗传转化。张兰英等利用除草剂抗性基因黄连对羟基苯基丙酮酸双加氧酶基因构建了植物表

并导入根癌农杆菌中，可以用于水稻等单达载体，

子叶植物的遗传转化。3．2

培育抗除草剂转基因作物

抗除草剂基因的另一个重要用途就是将分离

的抗某一种或几种除草剂的基因，通过不同的遗传转化方法将其导入目的作物中，使转基因作物

从而拓宽一些重要的常表现出抗除草剂的特性，

规除草剂的使用范围。转基因作物对除草剂的抗

性的主要途径有两个：一是将对除草剂不敏感的使作物吸收除草剂后仍能进行正靶标基因转入，

常的代谢作用；二是将降解除草剂的酶和酶系统转入作物，在除草剂发挥作用前将其降解。

目前，将抗除草剂基因导入作物细胞的方法最常用的方法是农杆菌介导转化法和基因很多，［3］

枪法。农杆菌介导的遗传转化方法是抗除草剂作物基因工程中应用最为广泛的外源基因导入法，具有转基因拷贝数低、基因重排少、转化频率较高等特点。因为根癌农杆菌一般只感染双子叶植物，该方法也具有一定的局限性。基因枪介导法是一种将外源DNA 直接导入受体基因组的技术，由于其无宿主限制，操作简单，对一些不适宜

4展望

由于除草剂抗性基因具有广泛的应用而备受

关注，主要集中在新的抗除草剂基因的发掘、既有的抗除草剂基因的改良、除草剂抗性机理研究以及新的抗除草剂作物的培育等方面。

①新的抗除草剂基因的发掘。包括植物来源和微生物来源的新除草剂抗性基因的获取。随着除草剂的广泛使用，抗除草剂的杂草种类越变越

为新的抗性基因的获取提供了很好的资源，同多，

［5］时也为新的优质种质资源的开发奠定了基础。例如，谷子是对除草剂敏感的自花授粉植物，以其

近缘野生种狗尾草中筛选出的抗除草剂基因，可通过远缘杂交转移到谷子中，创制出不同遗传类型的抗性种质

［22，23］

。发掘新的微生物来源的抗

除草剂基因也具有重要的应用价值。对已知可培养的微生物的筛选是获得微生物来源的抗除草剂

王国增，等：除草剂抗性基因的研究进展

401

基因的一种有效的方法

［14］

。微生物因其生物多

样性和极端性也备受关注。此外，利用宏基因组

的方法，可以获得未培养微生物的抗除草剂新基因

［24］

出很多抗除草剂的转基因作物，但是主要集中在

几种除草剂中。由于除草剂的多样性以及新的抗越来越多的抗除草剂转基因作物性基因的发现，

需要通过转基因技术或非转基因方法进行培育。为延迟杂草抗药性、防治杂草群落变化和扩大杀草谱，多抗性抗除草剂作物的培育也成为新的研究热点

［33］

。

②既有的抗除草剂基因的改良。利用基因工程和蛋白质工程的方法对既有的抗除草剂基因进

行改造，获得性质更加优良的抗性基因。通常有两种方法

［14］

。此外，抗除草剂的生物安全性也受到

：一是基于酶的三级结构进行合理的

定向突变的方法；二是通过对已知酶进行随机突变和DNA 改组并进行突变体的筛选的方法。两种策略都是对既有的除草剂抗性基因进行改造

［25］

后，获得耐受性更高的突变体。Liang 等采用易错PCR 方法来源于对Pseudomonas stutzeri A1501的EPSPS 合酶基因进行随机突变，获得的突变型EPSPS 基因比野生型基因的草甘膦抗性能力大大提高，可耐受200mmol /L草甘膦。此外，利用DNA 改组技术也获得了比野生型耐受性

［26 29］

。高很多的突变体

③除草剂抗性机理研究。目前由靶标位点的

氨基酸突变产生的杂草抗性方面的报道较多，而且抗性能稳定遗传。通常是靶标位点的氨基酸突

［5］

变导致除草剂与靶标位点的亲和能力下降。Funke 等［30］研究大肠杆菌来源的EPSPS 基因发

Thr97→Ile 和Pro101→Ser 的双突变才会引起现，

构象的变化并产生有抗性的Ⅰ型EPSPS 。此外，最近的研究也发现一些新的除草剂的抗性机理。Gaines 等［31］对草甘膦具有抗性的马齿苋（Ama-ranthus palmeri ）和其他常见的对草甘膦敏感的杂草种群进行了比较研究，发现抗性杂草体内的EPSPS 基因拷贝数为敏感型杂草体内5 160倍，

PCR 和免疫印迹分析也表明EPSPS 的定量RT-表达量与基因组中EPSPS 的拷贝数成正相关，从而推测基因复增是马齿苋获得草甘膦抗性的分子

机制。此外，非靶标位点除草剂抗性的研究也渐研究较多的是细胞色素P450单加氧酶和渐兴起，

［5］

谷胱苷肽硫转移酶途径的除草剂抗性研究。Yuan 等［32］用功能基因组学的方法对小蓬草（Conyza canadensis ）的草甘膦非靶标抗性的机制进行了研究，并发现了潜在的非靶标草甘膦抗性为后续的功能研究提供了基础。抗除草剂基因，

机理的研究可以为定向进化以及人工设计新的抗除草剂基因提供基础。

④新的抗除草剂作物的培育。尽管已经培育

［34，35］

。随着研究的深入和科技的了广泛的关注

发展，抗除草剂作物必将在农业生产中发挥更大

的作用。

参

考

文

献

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