摘 要：目的：优化淡豆豉中大豆异黄酮的高效液相色谱含量测定方法。方法：采用色谱柱为Agilent Hypersil C18(4.0 mm×250 mm ,5μm) ,流动相为甲醇- 0.09 %醋酸(48：52) ,流速1.0 mL•min-1,测定波长为254 nm,检测温度为25 ℃的色谱条件测定。结果：线性范围：大豆苷40.6～203μg(r=0.9998)，染料木苷11.15～55.75μg(r=0.9926)，大豆苷元12.05～60.25μg (r=0.9933)，染料木素5.5～27.5μg(r=0.9946)。测定精密度：大豆苷RSD=1.59%，染料木苷RSD=1.7%，大豆苷元RSD=0.8%，染料木素RSD=1.6%。大豆异黄酮总量24h稳定性RSD=1.49%，重复性RSD=1.06%，加样回收率：大豆苷为（99.24±3.77）%，染料木苷为（99.66±5.82）%，大豆苷元为（99.41±4.33）%，染料木素为（99.06±7.09）%。结论：本法简便、可靠、灵敏，可作为大豆异黄酮的质量控制方法。 关键词：淡豆豉片； 大豆异黄酮； HPLC 中图分类号：R284.1 文献标识码：A 文章编号：1673-7717(2012)01-0182-03 Improvement of Content Determination of Soy Isoflavon from Semen Sojae praeparatum LIU Qing1, XU Feng�hua2, LI Yong�sheng2 (1.Hebei North University,Zhangjiakuo 075000,Hebei,China; 2.Chinese PLA General Hospital，Beijing 100853,China) Abstract:Objective: To improve the HPLC method for the content determination of soy isoflavon from Semen Sojae praeparatum. Method: Isoflavone was analyzed on a Agilent Hypersil C18 column (4.0mm×250mm, 5μm). A mixture of MeOH-0.09 % HAc (48∶52) was used as the mobile phase with a flow rate of 1.0mL•min-1. The detecting wavelength was 254 nm at 25℃. Result: The quantitative linear ranges of four isoflavones were daidzin 40.6～203μg(r=0.9998), 11.15～55.75μg(r=0.9926)，daidzein 12.05～60.25μg(r=0.9933)，genistein 5.5～27.5μg(r=0.9946)，the precisions were RSD=1.59%，RSD=1.7%，RSD=0.8%，RSD=1.6%，the stability of isoflavonoids in 24h was RSD=1.49%，reproducibility RSD=1.06%．The recoveries of daidzin was （99.24±3.77）%，genistin was 99.66±5.82%，daidzein was （99.41±4.33）%，genistein was （99.06±7.09）% .Conclusion:The method is convenient,reliable and sensitive so it can be used for the quality control of soy isoflavone. Key words:Semen Sojae praeparatum; Isoflavone; HPLC 淡豆豉是由大豆的成熟种子经发酵加工而成的制品，始载于《名医别录》[1]，具有解表除烦、宣发郁热等功效[2]。其主要成分大豆异黄酮具有具有双相调节机能： 对于低雌激素水平者可起到雌激素样功能，可预防妇女更年期激素消退时产生的疾病，如骨质疏松、血脂升高等；对于高雌激素水平者可产生抗激素功能，同时还具有抗肿瘤和活化免疫调节等作用[3]。淡豆豉含有大豆中的12种异黄酮类组分,分为游离型的苷元和结合型的糖苷两类,其中含量较高的两种苷元成分为染料木素和大豆素,含量较高的两种糖苷类成分为染料木苷和大豆苷。《中华人民共和国药典》2010年版，对淡豆豉规定了形状和显微鉴别，其中有效成分大豆异黄酮的含量并没有具体测定方法。有文献[4-5]报道采用紫外分光光度法测定大豆异黄酮含量，但其只以染料木素做异黄酮总含量计算，有一定的局限性，代表性不强。牛丽颖等对淡豆豉中的大豆异黄酮上述4种主要成分进行了的含量测定[6]，但其方法采用梯度洗脱，操作繁琐，大豆异黄酮保留时间较长，需50 min左右才能完全出峰，且杂质峰较多，不利于图谱的分析。我们建立了高效液相色谱法测定大豆异黄酮的含量的方法,流动相组成简单，为甲醇-0.09 %醋酸，4种被测成分在25 min内全部出峰，大大缩短了保留时间，提高了分离效率，方法更为简便易行、准确可靠。现将本法报道如下。 1仪器与试药 Agilent 1100 LC高效液相色谱仪，紫外检测器，Agilent Chemstation System色谱工作站（美国安捷伦科技公司），CQ - 250超声波清洗器(上海船舶电子设备研究所),ACD-2002-U实验室超纯水系统(艾科浦公司),大豆苷(批号111738-200501)，染料木苷(批号111709-200501)，大豆苷元(批号1502-200101)，染料木素(批号111704-200501),以上标准品均由中国药品生物制品检定所购得，甲醇为色谱纯，其他试剂均为分析纯。 2方 法 2.1色谱条件Agilent Hypersil C18柱(4. 0mm×250mm,5μm) ,流动相为甲醇-0.09%醋酸(48∶52)，流速1.0mL•min-1,测定波长为254nm，流速1.0mL•min-1，柱温为室温,进样量为20μL,理论板数按大豆苷峰计算不低于3000。 2.2对照品溶液的制备精密称取各对照品（大豆苷，染料木苷，大豆苷元，染料木素）适量,加甲醇溶解定容至10 mL，摇匀,即得。 2.3供试品溶液的制备取供试品约0.2g,精密称定,精密加入甲醇10mL,称质量,超声处理30min,放冷,再称质量,用甲醇补足减失的质量,摇匀，滤过,取续滤液,即得。 2.4线性关系考察精密称取各对照品：大豆苷0.00812g，染料木苷0.00223g，大豆苷元0.00241g，染料木素0.00110g，加甲醇溶于10mL中定容，摇匀,即得(每1mL含大豆苷812μg，染料木苷223μg,大豆苷元241μg,染料木素110μg)。取此对照品溶液分别加甲醇稀释成以下浓度:大豆苷40.6、81.2、121.8、162.4、203μg•mL-1;染料木苷11.15、22.3、33.45、44.6、55.75μg•mL-1;大豆苷元12.05、24.1、36.15、48.2、60.25μg•mL-1；染料木素5.5、11、16.5、22μg•mL-1分别吸取20μL,注入液相色谱仪中进行测定,将样品浓度与峰面积进行线性回归处理。
2.5精密度试验精密吸取同一对照品溶液（其中浓度大豆苷121.8μg•mL-1，染料木苷33.45μg•mL-1，大豆苷元36.15μg•mL-1，染料木素16.5μg•mL-1）20μL,注入液相色谱仪中，连续进样6次，测定供试品溶液中大豆苷，染料木苷，大豆苷元，染料木素的峰面积的RSD值。 2.6稳定性试验精密吸取同一供试品溶液20μL ,分别在0、1、2、4、8、12、24h时间内注入液相色谱仪中,测定大豆苷，染料木苷，大豆苷元，染料木素峰面积,测定大豆异黄酮总量在24h内的稳定性,结果用相对平均偏差值表示。 2．7 重复性试验取同一批供试品6份,分别以上述方法处理进行测定，结果用相对平均偏差值表示。 2．8 加样回收率试验取供试品约0.2 g ,精密称定,共6份,各精密加入大豆异黄酮对照品溶液(浓度各为大豆苷120.117μg•mL-1,染料木苷29.54μg•mL-1，大豆苷元33.21μg•mL-1，染料木素18.12μg•mL-1以甲醇为溶剂) 10 mL，余下同供试品溶液制备方法制备，测定，计算回收率。 3结 果 3.1对照品HPLC图 见图1。 3.2 阴性对照液HPLC图 结果表明,阴性对照溶液色谱在大豆异黄酮色谱峰相应的位置上无色谱峰,说明在此色谱条件下，制剂中其他成分不干扰大豆异黄酮的测定。 见图2。 3.3 样品液HPLC图 见图3。 3.4 大豆异黄酮4种成分线性关系结果 结果表明各样品在上述浓度范围内内呈良好的线性关系。见表1。 3.5对照品溶液中大豆苷，染料木苷，大豆苷元，染料木素的峰面积的RSD值 大豆苷为1.59%，染料木苷为1.7%，大豆苷元为0.8%，染料木素为1.6%。结果表明精密度符合要求。 3.6稳定性试验 大豆异黄酮总量在24h 内的稳定性,用相对平均偏差值表示为RSD 1.49 %。结果表明稳定性良好。 3.7重复性试验 测得的RSD 1.06%。结果表明重复性良好。 3.8加样回收率测定结果大豆苷见表2，染料木苷见表3，大豆苷元见表4，染料木素见表5，结果表明加样回收率良好。 4 讨 论 4.1 提取工艺的选择我们比较了不同乙醇浓度的提取工艺，发现60%的乙醇提取有效成分含量最高。再有一个影响因素就是提取温度，温度低有利于有效成分不被破坏，但会延长提取时间，不利于生产效率的提高。采用60%乙醇渗漉充分提取有效成分需48h，回流只需2h，并且经验证，有效成分含量相似，因此我们采用60%乙醇回流的工艺。经HPLC验证此种工艺下各有效成分出峰良好。相比文献[7]中采用超临界流体萃取脱脂4h后，再用70% 的乙醇溶液(V/V)提取大豆异黄酮,更加简便易行,仪器要求简单，且有效成分含量相似。经HPLC验证此种工艺下各有效成分出峰良好。 4.2 波长选择取大豆异黄酮对照品混合溶液在200～400nm内进行紫外扫描结果发现，在254nm处有最大吸收峰，峰形好，且总峰面积最大，由此确定紫外检测器的检侧波长为254nm紫外分光光度法在黄酮类化合物含量测定中的应用，较文献报道的259nm[5]、260nm[8-9]及261nm[4-6]处测定的吸光度更优，且辅料对其无明显干扰。 4.3 柱温选择柱温影响大豆异黄酮有效成分的保留时间及分离度，柱温过高，分离度不好，影响色谱柱寿命;柱温过低，分析时间延长，灵敏度降低。通过试验，本方法确定柱温为室温25 ℃左右。 4．4 流动相的选择有关文献[6]采用乙腈23 %冰醋酸,流动相A为乙腈,流动相B为3%冰醋酸水溶液,为流动相进行梯度洗脱，大豆异黄酮保留时间相对较长（50min左右），且操作繁琐。本文以甲醇-0.09%醋酸水溶液为流动相,所得色谱峰峰形好, 大豆异黄酮保留时间大为缩短（小于25min），避免了梯度洗脱，操作简便，分离效果佳。 参考文献 ［1］ 李娜，黄庆柏.淡豆豉中的异黄酮成分及药理作用与临床应用[J]．中国现代中药，2008，10（7）：18-19. [2] 虞丹．植物雌激素――大豆异黄酮的药理作用研究概况[J]．海峡药学，2007，19(2)：9-12. [3] 刘葵， 张恩娟．大豆异黄酮的药理作用及临床应用研究进展[J]．中国药房，2006，17(1)：67-69. [4] 牛丽颖， 石素琴， 刘敏彦，等. 淡豆豉炮制工艺的优化研究[J]．中成药,2010,32(8)：1372-1376. [5] 崔力剑，黄芸，杜淑娟，等.紫外分光光度法测定淡豆豉中异黄酮的含量[J]．河北中医药学报，2004, 19（3）：32-33. [6] 牛丽颖,杜红娜,刘姣，等. 淡豆豉炮制前后异黄酮组分含量的比较[J]．大豆科学, 2008, 27(4)：672-678. [7] 郭文勇,刘彬果,钟蕾，等.大孔树脂吸附层析法提取淡豆豉中总异黄酮的研究[J]．第二军医大学学报,2004,25 (9)：1033-1034. [8] 毛峻琴,宓鹤鸣,娄子洋，等.HPLC 法测定淡豆豉中异黄酮的含量[J]. 第二军医大学学报，2000,21(10)：955-957. [9] 毛俊琴，黄晓谨，周月芬，等.高效液相色谱法测定淡豆豉药材中异黄酮含量[J].药物分析杂志，2004,24（6）：587-590.
摘 要：目的：优化淡豆豉中大豆异黄酮的高效液相色谱含量测定方法。方法：采用色谱柱为Agilent Hypersil C18(4.0 mm×250 mm ,5μm) ,流动相为甲醇- 0.09 %醋酸(48：52) ,流速1.0 mL•min-1,测定波长为254 nm,检测温度为25 ℃的色谱条件测定。结果：线性范围：大豆苷40.6～203μg(r=0.9998)，染料木苷11.15～55.75μg(r=0.9926)，大豆苷元12.05～60.25μg (r=0.9933)，染料木素5.5～27.5μg(r=0.9946)。测定精密度：大豆苷RSD=1.59%，染料木苷RSD=1.7%，大豆苷元RSD=0.8%，染料木素RSD=1.6%。大豆异黄酮总量24h稳定性RSD=1.49%，重复性RSD=1.06%，加样回收率：大豆苷为（99.24±3.77）%，染料木苷为（99.66±5.82）%，大豆苷元为（99.41±4.33）%，染料木素为（99.06±7.09）%。结论：本法简便、可靠、灵敏，可作为大豆异黄酮的质量控制方法。 关键词：淡豆豉片； 大豆异黄酮； HPLC 中图分类号：R284.1 文献标识码：A 文章编号：1673-7717(2012)01-0182-03 Improvement of Content Determination of Soy Isoflavon from Semen Sojae praeparatum LIU Qing1, XU Feng�hua2, LI Yong�sheng2 (1.Hebei North University,Zhangjiakuo 075000,Hebei,China; 2.Chinese PLA General Hospital，Beijing 100853,China) Abstract:Objective: To improve the HPLC method for the content determination of soy isoflavon from Semen Sojae praeparatum. Method: Isoflavone was analyzed on a Agilent Hypersil C18 column (4.0mm×250mm, 5μm). A mixture of MeOH-0.09 % HAc (48∶52) was used as the mobile phase with a flow rate of 1.0mL•min-1. The detecting wavelength was 254 nm at 25℃. Result: The quantitative linear ranges of four isoflavones were daidzin 40.6～203μg(r=0.9998), 11.15～55.75μg(r=0.9926)，daidzein 12.05～60.25μg(r=0.9933)，genistein 5.5～27.5μg(r=0.9946)，the precisions were RSD=1.59%，RSD=1.7%，RSD=0.8%，RSD=1.6%，the stability of isoflavonoids in 24h was RSD=1.49%，reproducibility RSD=1.06%．The recoveries of daidzin was （99.24±3.77）%，genistin was 99.66±5.82%，daidzein was （99.41±4.33）%，genistein was （99.06±7.09）% .Conclusion:The method is convenient,reliable and sensitive so it can be used for the quality control of soy isoflavone. Key words:Semen Sojae praeparatum; Isoflavone; HPLC 淡豆豉是由大豆的成熟种子经发酵加工而成的制品，始载于《名医别录》[1]，具有解表除烦、宣发郁热等功效[2]。其主要成分大豆异黄酮具有具有双相调节机能： 对于低雌激素水平者可起到雌激素样功能，可预防妇女更年期激素消退时产生的疾病，如骨质疏松、血脂升高等；对于高雌激素水平者可产生抗激素功能，同时还具有抗肿瘤和活化免疫调节等作用[3]。淡豆豉含有大豆中的12种异黄酮类组分,分为游离型的苷元和结合型的糖苷两类,其中含量较高的两种苷元成分为染料木素和大豆素,含量较高的两种糖苷类成分为染料木苷和大豆苷。《中华人民共和国药典》2010年版，对淡豆豉规定了形状和显微鉴别，其中有效成分大豆异黄酮的含量并没有具体测定方法。有文献[4-5]报道采用紫外分光光度法测定大豆异黄酮含量，但其只以染料木素做异黄酮总含量计算，有一定的局限性，代表性不强。牛丽颖等对淡豆豉中的大豆异黄酮上述4种主要成分进行了的含量测定[6]，但其方法采用梯度洗脱，操作繁琐，大豆异黄酮保留时间较长，需50 min左右才能完全出峰，且杂质峰较多，不利于图谱的分析。我们建立了高效液相色谱法测定大豆异黄酮的含量的方法,流动相组成简单，为甲醇-0.09 %醋酸，4种被测成分在25 min内全部出峰，大大缩短了保留时间，提高了分离效率，方法更为简便易行、准确可靠。现将本法报道如下。 1仪器与试药 Agilent 1100 LC高效液相色谱仪，紫外检测器，Agilent Chemstation System色谱工作站（美国安捷伦科技公司），CQ - 250超声波清洗器(上海船舶电子设备研究所),ACD-2002-U实验室超纯水系统(艾科浦公司),大豆苷(批号111738-200501)，染料木苷(批号111709-200501)，大豆苷元(批号1502-200101)，染料木素(批号111704-200501),以上标准品均由中国药品生物制品检定所购得，甲醇为色谱纯，其他试剂均为分析纯。 2方 法 2.1色谱条件Agilent Hypersil C18柱(4. 0mm×250mm,5μm) ,流动相为甲醇-0.09%醋酸(48∶52)，流速1.0mL•min-1,测定波长为254nm，流速1.0mL•min-1，柱温为室温,进样量为20μL,理论板数按大豆苷峰计算不低于3000。 2.2对照品溶液的制备精密称取各对照品（大豆苷，染料木苷，大豆苷元，染料木素）适量,加甲醇溶解定容至10 mL，摇匀,即得。 2.3供试品溶液的制备取供试品约0.2g,精密称定,精密加入甲醇10mL,称质量,超声处理30min,放冷,再称质量,用甲醇补足减失的质量,摇匀，滤过,取续滤液,即得。 2.4线性关系考察精密称取各对照品：大豆苷0.00812g，染料木苷0.00223g，大豆苷元0.00241g，染料木素0.00110g，加甲醇溶于10mL中定容，摇匀,即得(每1mL含大豆苷812μg，染料木苷223μg,大豆苷元241μg,染料木素110μg)。取此对照品溶液分别加甲醇稀释成以下浓度:大豆苷40.6、81.2、121.8、162.4、203μg•mL-1;染料木苷11.15、22.3、33.45、44.6、55.75μg•mL-1;大豆苷元12.05、24.1、36.15、48.2、60.25μg•mL-1；染料木素5.5、11、16.5、22μg•mL-1分别吸取20μL,注入液相色谱仪中进行测定,将样品浓度与峰面积进行线性回归处理。
2.5精密度试验精密吸取同一对照品溶液（其中浓度大豆苷121.8μg•mL-1，染料木苷33.45μg•mL-1，大豆苷元36.15μg•mL-1，染料木素16.5μg•mL-1）20μL,注入液相色谱仪中，连续进样6次，测定供试品溶液中大豆苷，染料木苷，大豆苷元，染料木素的峰面积的RSD值。 2.6稳定性试验精密吸取同一供试品溶液20μL ,分别在0、1、2、4、8、12、24h时间内注入液相色谱仪中,测定大豆苷，染料木苷，大豆苷元，染料木素峰面积,测定大豆异黄酮总量在24h内的稳定性,结果用相对平均偏差值表示。 2．7 重复性试验取同一批供试品6份,分别以上述方法处理进行测定，结果用相对平均偏差值表示。 2．8 加样回收率试验取供试品约0.2 g ,精密称定,共6份,各精密加入大豆异黄酮对照品溶液(浓度各为大豆苷120.117μg•mL-1,染料木苷29.54μg•mL-1，大豆苷元33.21μg•mL-1，染料木素18.12μg•mL-1以甲醇为溶剂) 10 mL，余下同供试品溶液制备方法制备，测定，计算回收率。 3结 果 3.1对照品HPLC图 见图1。 3.2 阴性对照液HPLC图 结果表明,阴性对照溶液色谱在大豆异黄酮色谱峰相应的位置上无色谱峰,说明在此色谱条件下，制剂中其他成分不干扰大豆异黄酮的测定。 见图2。 3.3 样品液HPLC图 见图3。 3.4 大豆异黄酮4种成分线性关系结果 结果表明各样品在上述浓度范围内内呈良好的线性关系。见表1。 3.5对照品溶液中大豆苷，染料木苷，大豆苷元，染料木素的峰面积的RSD值 大豆苷为1.59%，染料木苷为1.7%，大豆苷元为0.8%，染料木素为1.6%。结果表明精密度符合要求。 3.6稳定性试验 大豆异黄酮总量在24h 内的稳定性,用相对平均偏差值表示为RSD 1.49 %。结果表明稳定性良好。 3.7重复性试验 测得的RSD 1.06%。结果表明重复性良好。 3.8加样回收率测定结果大豆苷见表2，染料木苷见表3，大豆苷元见表4，染料木素见表5，结果表明加样回收率良好。 4 讨 论 4.1 提取工艺的选择我们比较了不同乙醇浓度的提取工艺，发现60%的乙醇提取有效成分含量最高。再有一个影响因素就是提取温度，温度低有利于有效成分不被破坏，但会延长提取时间，不利于生产效率的提高。采用60%乙醇渗漉充分提取有效成分需48h，回流只需2h，并且经验证，有效成分含量相似，因此我们采用60%乙醇回流的工艺。经HPLC验证此种工艺下各有效成分出峰良好。相比文献[7]中采用超临界流体萃取脱脂4h后，再用70% 的乙醇溶液(V/V)提取大豆异黄酮,更加简便易行,仪器要求简单，且有效成分含量相似。经HPLC验证此种工艺下各有效成分出峰良好。 4.2 波长选择取大豆异黄酮对照品混合溶液在200～400nm内进行紫外扫描结果发现，在254nm处有最大吸收峰，峰形好，且总峰面积最大，由此确定紫外检测器的检侧波长为254nm紫外分光光度法在黄酮类化合物含量测定中的应用，较文献报道的259nm[5]、260nm[8-9]及261nm[4-6]处测定的吸光度更优，且辅料对其无明显干扰。 4.3 柱温选择柱温影响大豆异黄酮有效成分的保留时间及分离度，柱温过高，分离度不好，影响色谱柱寿命;柱温过低，分析时间延长，灵敏度降低。通过试验，本方法确定柱温为室温25 ℃左右。 4．4 流动相的选择有关文献[6]采用乙腈23 %冰醋酸,流动相A为乙腈,流动相B为3%冰醋酸水溶液,为流动相进行梯度洗脱，大豆异黄酮保留时间相对较长（50min左右），且操作繁琐。本文以甲醇-0.09%醋酸水溶液为流动相,所得色谱峰峰形好, 大豆异黄酮保留时间大为缩短（小于25min），避免了梯度洗脱，操作简便，分离效果佳。 参考文献 ［1］ 李娜，黄庆柏.淡豆豉中的异黄酮成分及药理作用与临床应用[J]．中国现代中药，2008，10（7）：18-19. [2] 虞丹．植物雌激素――大豆异黄酮的药理作用研究概况[J]．海峡药学，2007，19(2)：9-12. [3] 刘葵， 张恩娟．大豆异黄酮的药理作用及临床应用研究进展[J]．中国药房，2006，17(1)：67-69. [4] 牛丽颖， 石素琴， 刘敏彦，等. 淡豆豉炮制工艺的优化研究[J]．中成药,2010,32(8)：1372-1376. [5] 崔力剑，黄芸，杜淑娟，等.紫外分光光度法测定淡豆豉中异黄酮的含量[J]．河北中医药学报，2004, 19（3）：32-33. [6] 牛丽颖,杜红娜,刘姣，等. 淡豆豉炮制前后异黄酮组分含量的比较[J]．大豆科学, 2008, 27(4)：672-678. [7] 郭文勇,刘彬果,钟蕾，等.大孔树脂吸附层析法提取淡豆豉中总异黄酮的研究[J]．第二军医大学学报,2004,25 (9)：1033-1034. [8] 毛峻琴,宓鹤鸣,娄子洋，等.HPLC 法测定淡豆豉中异黄酮的含量[J]. 第二军医大学学报，2000,21(10)：955-957. [9] 毛俊琴，黄晓谨，周月芬，等.高效液相色谱法测定淡豆豉药材中异黄酮含量[J].药物分析杂志，2004,24（6）：587-590.