一种高纯度多巴胺神经元原代培养方法的建立

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４０３

文章编号：１００７—８７３８（２００８）０４—０４０３—０３

一种高纯度多巴胺神经元原代培养方法的建立

白龙梅１，李学忠１一，张志琳１，刘春风１’２・

（苏州大学：１附属第二医院神经内科，２衰老与神经疾病实验室，江苏苏州２１５００４）

［摘要］目的：通过胚胎中脑祖细胞（ＭＰＣ）体外培养获得高纯度的多巴胺神经元培养体系。方法：取自Ｅ１２鼠胚中脑

腹侧的ＭＰＣ悬液在添加ｂＦＧＦ的ＤＭＥｗＦｌ２／Ｎ２／Ｉ广抗坏血酸一２一磷酸酯倍半镁盐（从－２Ｐ）培养液中扩增培养，５ｄ后停用ｂＦＧＦ，促进细胞分化，４ｄ后通过Ｎｅｕｒｏｂ鹊彬阿糖胞苷

（Ａｍ－ｃ）抑制胶质细胞生长，获得纯神经元，使用７ｍ鉴定细

胞，计数细胞比例和纯度，Ｂ－ｔｕｂｕｌｉｎⅡＩ鉴定成熟神经元，并计数细胞比例和纯度。结果：在添加了ｂＦＧＦ

２０彬Ｌ的

ＤＭＥⅣＦ１２／Ｎ２／ＡＡ－２Ｐ培养液中ＭＰＣ增殖良好，体外培养

７

ｄ后细胞数量扩增到培养前的（１６．５４±１．２５）倍；使用Ｎｅｕ－

ｍｂ船ａＬ／阿糖胞苷后胶质细胞受抑制，神经元占９４％以上，其中多巴胺（ＤＡ）能神经元的比例约（３５．５６士４．１３）％。结论：Ｅ１２鼠胚ＭＰＣ原代培养合并使用阿糖胞苷是获取高纯度ＤＡ能神经元培养体系的可靠途径。

［关键词］中脑前体细胞；多巴胺能神经元；细胞培养［中图分类号】Ｒ３９２．１

【文献标识码】Ａ

为探讨帕金森病的发病机制及治疗方法，常需在单细胞水平了解黑质多巴胺能神经元的生理生化

特性及其对各种毒物、药物的反应。因此，高纯度、

高质量、稳定地进行原代黑质多巴胺能神经元培养，是进行这一领域研究的关键技术。我们应用大鼠胚胎中脑祖细胞（ｍｅｓｅｎｃｅｐｈａｌｉｃ

ｐｍｇｅｎｉｔｏｒ

ｃｅⅡｓ，ＭＰＣ）

体外培养技术，旨在能够获得较高纯度及较高质量的原代黑质多巴胺能神经元培养体系。１材料和方法

１．１材料Ｅ１２Ｓｐ礓ｇＬｌｅ—Ｄａｗｌｅｙ孕鼠由苏州大学动物中心提

供；ＤＭＥｗＦｌ２培养液、无血清培养添加剂Ｎ２、胎牛血清

（ＦＢＳ）、２５ｇ／Ｌ胰酶消化液均购自Ｇｉｂｃｏ公司；碱性成纤维生

长因子（ｂ鹊ｉｃ硒ｍｂｌ鹊ｔ鲫他ｆａｃｔｏｒ，ｂＦＧＦ）、Ｌ－抗坏血酸一２－

磷酸酯倍半镁盐（Ｌ—ａ８ｃｒ｝ｏｉｄａｃｉｄ一２一ｐｈｏｓｐｈａｔｅ

ｓｅｓｑｕｉｍａ印ｅ８ｉ啪

ｓａｌｔ，从一２Ｐ）、阿糖胞苷（眦ｂｉｎｏｓｙｌｃｙｔ０８ｉｎ，Ａ姐一ｃ）均购自

ｓｉ蛐公司；兔抗酪氨酸羟化酶（ＴＨ）单克隆抗体（ｍＡｂ）购自

Ｎｏｖｌｌｓ公司（编号３００—１０９）；小鼠抗Ｂ．ＴｕｂＩｄｉｎⅢｍＡｂ购自

收稿日期：２００７—０４一１９；接受日期：２００７一０９—１２基金项目：江苏省“六大人才高峰”资助课题（卫生０２—２）作者简介：白龙梅（１９８０一），女，内蒙古鄂尔多斯人，硕士

Ｔｂｌ：０５１２—６７７８３３０ｒ７；Ｅ－ｍａｉｌ：Ｈｕｃ亿Ｏ＠ｈｏ劬ａｉｌ．ｃ咖木Ｃｏｍ８ｐｏｎｄｉｌｌｇ¨ｔｈｏｒ

万　

方数据ｃｈｅＩＩｌｉｃｏｎ公司；免疫组化试剂盒购自Ｂｏｓｔｅｒ公司；抗小鼠ｃｙ２免疫荧光染色试剂盒、抗兔ｃｙ３免疫荧光染色试剂盒和

Ｈ０ｅｃｌｌｓｔ

３３２５８免疫荧光染色试剂盒均购自碧云天生物技术研

究所。１．２方法

１．２．１

细胞培养及绘制生长曲线ＭＰＣ的培养参照Ｙｕ

等Ｈ’纠方法并适当修改，简述如下，Ｅ１２孕鼠以乙醚麻醉后腹部消毒，剖腹取出子宫置于ｌＯｃｍ的消毒玻璃培养皿中；剪开子宫取出胚囊，用镊子撕破羊膜囊取出长约６～８ｍｍ（顶臀径）的胚胎，置入另一盛有Ｄ—ＨａＩｌｌ【ｓ液的玻璃皿中；在解剖显微镜下切取中脑曲。切开中脑导水管腹侧，切取中央约

ｍｍ

ｘ０．４咖的中脑腹侧部分，置入约含０．５

ｎｌＬ

取材液（２：１的ＤＭＥ彬Ｆ１２、２

ｇ／Ｌ碳酸氢钠、２０ｇ／Ｌ

Ｂ２７、

１０ｇ／ＬＮ２、０．２ｇ／ＬＤＮ鹅ｅ）的１．５ｌｌｌＬ的ＥＰ管中，分别用

ｌ

ｍＬ和０．２ｍＬ的枪头反复吹吸１５次；静置３ｌｌｌｉｎ，去除沉

淀，依胚胎数量加入１～５ｍＬ培养液（２：１的ＤＭＥＭ／Ｆ１２、ｇ／ＬＢ２７、１０

ｇ／Ｌ

Ｎ２、ｌＯ

ｍＬ／Ｌ

ＦＢｓ、

ｂＦＧＦ、１００斗ｍ彤Ｌ

ＡＡ一２Ｐ），玻璃移液管吹吸分散悬

浮细胞。取ｌｏ止细胞悬液加入１０灿４∥Ｌ台盼蓝溶液，

充分混匀后倒置显微镜下计数并判定活细胞比例；调整细胞悬液密度至３×１０８／Ｌ，部分接种在预先用多聚赖氨酸包被的

ｃｍ２培养瓶中，每个培养瓶中加人３ｍＬ细胞悬液。部分接

种在用多聚赖氨酸包被的２个２４孔培养板中，其中１个２４孔板放置用多聚赖氨酸包被的玻璃爬片，另一个不放，每孔

中加入５００止细胞悬液，３７℃、５０

ｍＬ／Ｌ

ｃＯ：细胞培养箱中

培养２４ｈ，细胞贴壁后吸除全部培养液，重新加入无血清培养液（２：１的ＤＭＥＭｙＦｌ２、２ｇ／Ｌ碳酸氢钠、１０ｇ／ＬＮ２、２０峙／Ｌ

ｂＦＧＦ、１００斗ｍｏＬ／Ｌ从．２Ｐ）继续培养，隔天更换半量培养液。

细胞培养５ｄ后吸除全部培养液，换培养液（Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ、

ｇ／ＬＢ２７、１０ｍＬ／Ｌ

ＦＢＳ、１００¨ｍ彬Ｌ从一２Ｐ、９

ｇ／Ｌ谷胺酰

胺），隔天更换半量培养液继续培养４ｄ。接种在培养板中的细胞爬片在第５、７、９天取出分别用于免疫组化、免疫荧光鉴定。接种在２４孔板中的细胞在第２、４、７、９天接种分别随机取６孔，加入２５ｇ／Ｌ胰酶消化，吹打成单细胞悬液，台盼蓝计数，计算平均每孔细胞数并记录，绘制原代培养细胞生长曲线。在培养瓶中细胞于第１０天换液，并加入终浓度为ｍＬ

Ｄ－ＨａＩｌｌ【ｓ液漂洗２次后加入１２．５ｇ／Ｌ胰酶，倒置显微镜下观

察细胞分散悬浮情况，约８～１０ＩＩｌｉｎ后加人１００

ｍＬ／Ｌ

ＦＢｓ终

止消化：继续用玻璃移液管吹吸分散细胞，细胞悬液收集人

１．５ｒＩｌＬ

ＥＰ管中，４℃下１５００ｒ／ｌｌｌｉｎ离心３ＩＩｌｉｎ；弃去上清液，

ｇ／Ｌ

Ｂ２７、５０ｍＬ／ＬＦＢｓ、５０ｍＬ／Ｌ

０．５姗×０．６

２晷／Ｌ碳酸氢钠、２０２０恤矿Ｌ

２５

２０

７斗ｍｏＬ／Ｌ的阿糖胞苷，培养２天后吸除培养液后加人３加入培养液（Ｎｅｕｒｏｂ嬲ａｌ、２０

！墨型！鲤！＝墨！！！绁塑皇盆王鱼痤堂苤壶（ｇ堕垫』ｇ！！！堕竺！！堡望！！Ｑ１２兰塑墨：丝（业

马血清、１００删Ｌ

ＡＡ－２Ｐ、９

ｇ／Ｌ谷胺酰胺）调整细胞悬液密度至２×１０８／Ｌ，在放置用多聚赖氨包被的玻璃爬片２４孔板中培养，隔天更换半量培养液，第３天取含培养细胞的盖玻片经４０ｇ／Ｌ多聚甲醛固定后行免疫荧光染色。

１．２．２免疫荧光染色免疫荧光染色参照文献［３］的方法。简要操作步骤如下：细胞爬片或冰冻切片用ＰＢＳ冲洗５

Ｉｎｉｎ×３；

加入３７℃预热的含４０ｇ／Ｌ多聚甲醛固定１０ＩＩｌｉｎ；ＰＢｓ漂洗３

次，加入５０９／ＬＢＳＡ和嘶ｔｏｎｘ—１００的０．Ｏｌｍ彬ＬＰＢｓ，室温下

置１ｈ，加入—抗孵育２ｈ，一抗分别为兔抗ＴＨｍＡｂ（１：２０００）、

小鼠抗Ｂ．ＴＩｌⅧｉｎⅢｍＡｂ（１：ｌ

０００）；ＰＢｓ漂洗３次，加入

二抗孵育１ｈ，二抗分别为抗兔ｃｙ３（１：３００）、抗小鼠ｃｙ２（１：３００）；ＰＢｓ漂洗３次后封片，荧光显微镜下观察、拍照片。免疫荧光双标结合Ｈｏｅｃｈｓｔ衬染指的是在一抗孵育的过程中同时加入上述２种一抗，浓度同前，孵育时间同前，并在二抗孵育后的ＰＢｓ漂洗后，加入１：ｌ０００稀释的Ｈｏｃｅｈｓｔ３３２５８孵育２ｍｉｎ复染细胞核，然后再继续ＰＢＳ漂洗３次后封片。阴性对照用ＭＰＢｓ代替特异性一抗，阳性对照采用雄性

３５０

ｇ左右的ｓｐｒａｇｌｌｅ．Ｄａｗｌｅｙ大鼠的中脑黑质冰冻切片，其他

步骤同上。荧光显微镜下观察并分类计数细胞。荧光显微镜

使用铬滤片，ｃｙ３激发波长５５４啪，发射波长５７０咖；ｃｙ２激发波长４９５砌，发射波长５２５ｎｍ；Ｈｏｃｅｈｓｔ３３２５８激发波长３５４砌，发射波长４５４ｎｍ。

２结果

２．１

Ｅ１２鼠胚ＭＰｃ体外生长的形态学的观察体外培养第

ｌ天培养细胞呈比较均匀的单个分散或数个聚集的贴壁生长，细胞周围有较强的折光性；４８ｈ后即可形成集落状贴壁生长的细胞团；随着培养时间的延长细胞团直径进一步增大，３—

４

ｄ后可形成肉眼可见细胞团。４～５ｄ细胞团边缘可见大量

长突起，少量细胞从细胞团内向外迁移，这些具有长突起的细胞形态相对成熟；６～７ｄ时当培养液中撤去ｂＦＧＦ后，从神经球向外迁移的细胞明显增多，细胞形态进一步成熟（图１）。联合使用Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ和Ａｍ－ｃ后，细胞生长受到抑制，胞体呈多边形的胶质细胞皱缩，悬浮，换液后多为胞体椭圆的神经元细胞。

２．２

Ｅ１２鼠胚ＭＰＣ细胞体外生长增殖能力的观察

ＭＰＣ接

种后部分细胞死亡，第２天细胞数轻度下降，随后迅速升高，培养１周后细胞数量达到培养前的（１６．５４±１．２５）倍（乃＝６），随后增长速度放缓，９ｄ后，细胞数量为培养前的（２１．３５±２．０３）倍。

２．３

Ｅ１２鼠胚ＭＰｃ细胞体外培养后分化能力的观察及其鉴

定细胞培养后的第２、６、１０、１２天后，应用ｃｙ３（红色）、ｃｙ２（绿色）加Ｈｏｅｃｈｓｔ（蓝色）复染细胞核的免疫荧光标记技术定性观察培养细胞。结果显示，细胞培养的第２天，ＴＨ阳性细胞不明显，第６天阳性细胞主要出现在细胞团块中，并且细胞突起明显。神经球内部以及神经球之间的多巴胺神经元形成广泛突触联系。ＴＨ阳性神经元的比例与神经球的大小有关，神经球越大，阳性细胞的比例相对越高。第１０天，ＴＨ阳性神经元的数量继续增多，且有大量细胞开始向外迁移

万　

方数据（图２）。在高倍视野下随机选取５个视野，以Ｈ∞ｃｌｌｓｔ标记的细胞核数代表细胞总数，Ｂ－ＴｕｂｕＨｎⅢ阳性细胞数代表成熟神

经元数，７ｍ阳性细胞数代表多巴胺神经元数，取其５个视野

的平均数作为该爬片的实际细胞数，随机抽取５个爬片。结果显示Ｂ－ＴｕｂｌｌｌｉｎⅢ阳性细胞占总细胞的（４９．５３士２．３４）％，’ＩＨ阳性细胞占总细胞的（２６．７６±２．３６）％。第１２天，使用Ａｍ．ｃ抑制胶质细胞生长后，神经元数量有所下降，但不明显，胶质细胞绝大多数消失，神经元比例达（９４±７．３２）％，其中多巴胺神经元占总细胞数的（３５．５６±４．１３）％（图３）。

图１从神经球向外迁移的细胞（×４００）

图２免疫荧光（ｃｙ３标记一红色荧光）显示大量神经元从神经球中外迁（×１００）

图３免疫荧光双标结合Ｈｏｅｃｌｌｓｔ衬染的多巴胺神经元（×４００）

３讨论

来自胚胎不同部位的神经前体细胞经体外培养后细胞分化有明显的区域特异性，来自中脑和间脑的神经前体细胞有更高的ＴＨ抗原阳性细胞分化率，细胞形态也更接近于中脑ＤＡ能神经元Ｈ１。我们选择Ｅ１２胎龄鼠胚作为实验对象，收集中脑腹侧细胞进行体外培养。ｂＦＧＦ是促进有丝分裂的小蛋白分子或多肽类物质，具有促进神经元存活和生长发育作用。当ｂＦＧＦ浓度达到１０—２０斗ｇ／Ｌ时，细胞增殖达较高水平，之后随着ｂＦＧＦ浓度增加，细胞增殖速度反而下降。ｂＦＧＦ有促进早期胚胎ＭＰｃ增殖的能力，

ｂＦＧＦ促进ＭＰＣ增殖有２个高峰，第１个高峰是神经元增殖高峰，出现在原代培养的前５

ｄ，６～９

ｄ主要

促进胶质细胞的增殖。抗坏血酸（ＡＡ）是人体生长和发育必需的营养素，最近研究表明其也有诱导中脑前体细胞分化为ＤＡ能神经元的作用。ｋｅ等”１发现一定剂量的ＡＡ单独也能诱导神经干细胞分化为ＤＡ能神经元。其机制可能是通过上调中脑前体细胞内ＥＰｏ和ＢＭＰ７的表达来介导ＤＡ能神经元的诱导分化。我们所用的ＡＡ一２Ｐ是一种性状更加稳定的ＡＡ衍生物。在ｂＦＧＦ和ＡＡ一２Ｐ作用下，Ｅ１２鼠胚中脑腹侧细胞体外培养４ｄ后能增殖形成肉眼可见的细胞簇，ＭＰｃ扩增培养７ｄ后，细胞数量大约增加到培养前的（１６．５４±１．２５）倍，９

ｄ后，细胞数量为培养前

！曼盟！Ｑ盟＝墨Ｚ三！细照生筮王鱼蕉堂苤盔（垡地坠』￡！！！塑壁！！坐堡坚望Ｑ！）塑墨：丝（垒）

的（２１．３５±２．０３）倍。１０ｄ后培养细胞中ＴＨ阳性细胞约占细胞总数的（２６．７６±２．３６）％。体外扩增培养第３天开始细胞簇之间和细胞簇的边缘有一些贴壁生长、具有长突起的形态相对成熟的细胞，随时间延长呈逐渐增多的趋势；培养液中撤去ｂＦＧＦ后，更多的细胞从细胞簇向外迁出、分化。

考虑到Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ主要有利于神经元的生长、增殖，对胶质细胞生长起抑制作用，但不能促使胶质细胞凋亡。抑制细胞有丝分裂的药物Ａｎ—ｃ可迅速作用分裂的神经胶质细胞，使之抑制或死亡，主要被胶质细胞摄取，引起胶质细胞凋亡，但也有部分被神经元摄取，导致神经元凋亡，且随时间和剂量呈正相关，因此我们在神经胶质细胞增殖的高峰期短期内加入Ａｒａ—ｃ。试验结果显示二者合用培养２ｄ，细胞总数下降到原来的（５４．６５±３．３８）％，胶质细胞绝大多数消失，神经元比例达９４％以上，其中多巴胺神经元占总细胞数的（３５．５６±４．１３）％。

综上所述，我们认为Ｅ１２鼠胚ＭＰｃ在包含有ｂＦ－ＧＦ和ＡＡ一２Ｐ的培养液中扩增良好，该培养液不仅能明显增加细胞数量，同时也能提高培养细胞向ＤＡ能神经元的分化比例。联合使用Ｎｅｕｍｂ鹊ａｌ和Ａｒａ－ｃ可

参考文献：

４０５

明显降低胶质细胞的含量，神经元的比例上升到９４％以上，多巴胺神经元的比例更是达到了（３５．５６±４．１３）％，提示Ｅ１２鼠胚ＭＰＣ原代培养，联合使用ｂＦＧＦ和ＡＡ．２Ｐ，合并使用Ａｒａ—ｃ是建立高纯度ＤＡ能神经元培养体系可靠途径。

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ｇｅｎｅｔｉｃ

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（１０）：１４０１—１４０４．

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（上接４０２页）

加入胸苷的时间，因生长活性好的ＶＳＭＣ，生长周期一般为２０ｈ左右，一般要继续培养ｓ＋Ｇ，／Ｍ期时间（约为１４ｈ）；（４）同步ＶｓＭＣ，消耗时间长，采用ＦｃＭ密切监测其通过Ｇ。／Ｓ期、ｓ期进程，同时最终结果，需连续重复３次以上实验一致才有一定的意义，而对于Ｇ：／Ｍ期，采用经Ｓ期过后，１００ｍｍｏＬ／Ｌ胎牛血清刺激后，流式细胞术监测同步效果一般在２０％一３０％左右（未列图）。而通过血清饥饿法后，采用秋水仙素１００ｍ∥Ｌ刺激能达到５０％以上的效果，根据实验结果，相对于细胞株来说，能够达到实验要求‘８｜。

ＶｓＭｃ属于增殖潜能的细胞，其增殖过程受细胞周期的调控，生理状态下血管平滑肌细胞位于血管中层，处于静息状态，在细胞周期中停留在Ｇ。／Ｇ。期，为可分化的、可收缩表型。而在某些情况下，血管中层的ＶＳＭＣ就会被激活、开始ＤＮＡ复制，ＶｓＭｃ转化为合成表型。ＤＮＡ复制一旦被启动（Ｇ，／ｓ期），就会继续进入ｓ期、Ｇ：期和Ｍ期，完成一个细胞周期。随着ＶｓＭｃ细胞周期的运行，分泌大量细胞外基质，导致血管新生内膜形成及增生，因此ＶＳＭＣ是再狭窄的主要作用细胞，也是再狭窄防治研究最重

要的靶细胞。本实验中采用细胞周期的同步化，首次对于体外血管平滑肌培养，采用胸苷、秋水仙素同步，使细胞停留于Ｇ，／Ｓ期（ＤＮＡ合成起始转换点）、ｓ、Ｇ：／Ｍ期（有丝分裂诱导转换点）。为进一步研究血管平滑肌细胞增殖调控机制提供依据。参考文献：

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ｃｉｎｅ

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万方数据　

一种高纯度多巴胺神经元原代培养方法的建立

作者：作者单位：

白龙梅， 李学忠， 张志琳， 刘春风

白龙梅,张志琳(苏州大学附属第二医院神经内科,江苏,苏州,215004)， 李学忠,刘春风(苏州大学附属第二医院神经内科,江苏,苏州,215004;苏州大学衰老与神经疾病实验室,江苏,苏州,215004)

细胞与分子免疫学杂志

CHINESE JOURNAL OF CELLULAR AND MOLECULAR IMMUNOLOGY2008,24(4)

刊名：英文刊名：年，卷(期)：

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本文链接：http://d.g.wanfangdata.com.cn/Periodical_xbyfzmyxzz200804030.aspx

！曼型！鲤２二墨！兰墨绁胞皇公王丝痤堂盘查（垦ｂ也』垦趔丛！！！型塑婪望竺１２至塑墨：丝（璺２・论著・

４０３

文章编号：１００７—８７３８（２００８）０４—０４０３—０３

一种高纯度多巴胺神经元原代培养方法的建立

白龙梅１，李学忠１一，张志琳１，刘春风１’２・

（苏州大学：１附属第二医院神经内科，２衰老与神经疾病实验室，江苏苏州２１５００４）

［摘要］目的：通过胚胎中脑祖细胞（ＭＰＣ）体外培养获得高纯度的多巴胺神经元培养体系。方法：取自Ｅ１２鼠胚中脑

腹侧的ＭＰＣ悬液在添加ｂＦＧＦ的ＤＭＥｗＦｌ２／Ｎ２／Ｉ广抗坏血酸一２一磷酸酯倍半镁盐（从－２Ｐ）培养液中扩增培养，５ｄ后停用ｂＦＧＦ，促进细胞分化，４ｄ后通过Ｎｅｕｒｏｂ鹊彬阿糖胞苷

（Ａｍ－ｃ）抑制胶质细胞生长，获得纯神经元，使用７ｍ鉴定细

胞，计数细胞比例和纯度，Ｂ－ｔｕｂｕｌｉｎⅡＩ鉴定成熟神经元，并计数细胞比例和纯度。结果：在添加了ｂＦＧＦ

２０彬Ｌ的

ＤＭＥⅣＦ１２／Ｎ２／ＡＡ－２Ｐ培养液中ＭＰＣ增殖良好，体外培养

７

ｄ后细胞数量扩增到培养前的（１６．５４±１．２５）倍；使用Ｎｅｕ－

ｍｂ船ａＬ／阿糖胞苷后胶质细胞受抑制，神经元占９４％以上，其中多巴胺（ＤＡ）能神经元的比例约（３５．５６士４．１３）％。结论：Ｅ１２鼠胚ＭＰＣ原代培养合并使用阿糖胞苷是获取高纯度ＤＡ能神经元培养体系的可靠途径。

［关键词］中脑前体细胞；多巴胺能神经元；细胞培养［中图分类号】Ｒ３９２．１

【文献标识码】Ａ

为探讨帕金森病的发病机制及治疗方法，常需在单细胞水平了解黑质多巴胺能神经元的生理生化

特性及其对各种毒物、药物的反应。因此，高纯度、

高质量、稳定地进行原代黑质多巴胺能神经元培养，是进行这一领域研究的关键技术。我们应用大鼠胚胎中脑祖细胞（ｍｅｓｅｎｃｅｐｈａｌｉｃ

ｐｍｇｅｎｉｔｏｒ

ｃｅⅡｓ，ＭＰＣ）

体外培养技术，旨在能够获得较高纯度及较高质量的原代黑质多巴胺能神经元培养体系。１材料和方法

１．１材料Ｅ１２Ｓｐ礓ｇＬｌｅ—Ｄａｗｌｅｙ孕鼠由苏州大学动物中心提

供；ＤＭＥｗＦｌ２培养液、无血清培养添加剂Ｎ２、胎牛血清

（ＦＢＳ）、２５ｇ／Ｌ胰酶消化液均购自Ｇｉｂｃｏ公司；碱性成纤维生

长因子（ｂ鹊ｉｃ硒ｍｂｌ鹊ｔ鲫他ｆａｃｔｏｒ，ｂＦＧＦ）、Ｌ－抗坏血酸一２－

磷酸酯倍半镁盐（Ｌ—ａ８ｃｒ｝ｏｉｄａｃｉｄ一２一ｐｈｏｓｐｈａｔｅ

ｓｅｓｑｕｉｍａ印ｅ８ｉ啪

ｓａｌｔ，从一２Ｐ）、阿糖胞苷（眦ｂｉｎｏｓｙｌｃｙｔ０８ｉｎ，Ａ姐一ｃ）均购自

ｓｉ蛐公司；兔抗酪氨酸羟化酶（ＴＨ）单克隆抗体（ｍＡｂ）购自

Ｎｏｖｌｌｓ公司（编号３００—１０９）；小鼠抗Ｂ．ＴｕｂＩｄｉｎⅢｍＡｂ购自

收稿日期：２００７—０４一１９；接受日期：２００７一０９—１２基金项目：江苏省“六大人才高峰”资助课题（卫生０２—２）作者简介：白龙梅（１９８０一），女，内蒙古鄂尔多斯人，硕士

Ｔｂｌ：０５１２—６７７８３３０ｒ７；Ｅ－ｍａｉｌ：Ｈｕｃ亿Ｏ＠ｈｏ劬ａｉｌ．ｃ咖木Ｃｏｍ８ｐｏｎｄｉｌｌｇ¨ｔｈｏｒ

万　

方数据ｃｈｅＩＩｌｉｃｏｎ公司；免疫组化试剂盒购自Ｂｏｓｔｅｒ公司；抗小鼠ｃｙ２免疫荧光染色试剂盒、抗兔ｃｙ３免疫荧光染色试剂盒和

Ｈ０ｅｃｌｌｓｔ

３３２５８免疫荧光染色试剂盒均购自碧云天生物技术研

究所。１．２方法

１．２．１

细胞培养及绘制生长曲线ＭＰＣ的培养参照Ｙｕ

等Ｈ’纠方法并适当修改，简述如下，Ｅ１２孕鼠以乙醚麻醉后腹部消毒，剖腹取出子宫置于ｌＯｃｍ的消毒玻璃培养皿中；剪开子宫取出胚囊，用镊子撕破羊膜囊取出长约６～８ｍｍ（顶臀径）的胚胎，置入另一盛有Ｄ—ＨａＩｌｌ【ｓ液的玻璃皿中；在解剖显微镜下切取中脑曲。切开中脑导水管腹侧，切取中央约

ｍｍ

ｘ０．４咖的中脑腹侧部分，置入约含０．５

ｎｌＬ

取材液（２：１的ＤＭＥ彬Ｆ１２、２

ｇ／Ｌ碳酸氢钠、２０ｇ／Ｌ

Ｂ２７、

１０ｇ／ＬＮ２、０．２ｇ／ＬＤＮ鹅ｅ）的１．５ｌｌｌＬ的ＥＰ管中，分别用

ｌ

ｍＬ和０．２ｍＬ的枪头反复吹吸１５次；静置３ｌｌｌｉｎ，去除沉

淀，依胚胎数量加入１～５ｍＬ培养液（２：１的ＤＭＥＭ／Ｆ１２、ｇ／ＬＢ２７、１０

ｇ／Ｌ

Ｎ２、ｌＯ

ｍＬ／Ｌ

ＦＢｓ、

ｂＦＧＦ、１００斗ｍ彤Ｌ

ＡＡ一２Ｐ），玻璃移液管吹吸分散悬

浮细胞。取ｌｏ止细胞悬液加入１０灿４∥Ｌ台盼蓝溶液，

充分混匀后倒置显微镜下计数并判定活细胞比例；调整细胞悬液密度至３×１０８／Ｌ，部分接种在预先用多聚赖氨酸包被的

ｃｍ２培养瓶中，每个培养瓶中加人３ｍＬ细胞悬液。部分接

种在用多聚赖氨酸包被的２个２４孔培养板中，其中１个２４孔板放置用多聚赖氨酸包被的玻璃爬片，另一个不放，每孔

中加入５００止细胞悬液，３７℃、５０

ｍＬ／Ｌ

ｃＯ：细胞培养箱中

培养２４ｈ，细胞贴壁后吸除全部培养液，重新加入无血清培养液（２：１的ＤＭＥＭｙＦｌ２、２ｇ／Ｌ碳酸氢钠、１０ｇ／ＬＮ２、２０峙／Ｌ

ｂＦＧＦ、１００斗ｍｏＬ／Ｌ从．２Ｐ）继续培养，隔天更换半量培养液。

细胞培养５ｄ后吸除全部培养液，换培养液（Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ、

ｇ／ＬＢ２７、１０ｍＬ／Ｌ

ＦＢＳ、１００¨ｍ彬Ｌ从一２Ｐ、９

ｇ／Ｌ谷胺酰

胺），隔天更换半量培养液继续培养４ｄ。接种在培养板中的细胞爬片在第５、７、９天取出分别用于免疫组化、免疫荧光鉴定。接种在２４孔板中的细胞在第２、４、７、９天接种分别随机取６孔，加入２５ｇ／Ｌ胰酶消化，吹打成单细胞悬液，台盼蓝计数，计算平均每孔细胞数并记录，绘制原代培养细胞生长曲线。在培养瓶中细胞于第１０天换液，并加入终浓度为ｍＬ

Ｄ－ＨａＩｌｌ【ｓ液漂洗２次后加入１２．５ｇ／Ｌ胰酶，倒置显微镜下观

察细胞分散悬浮情况，约８～１０ＩＩｌｉｎ后加人１００

ｍＬ／Ｌ

ＦＢｓ终

止消化：继续用玻璃移液管吹吸分散细胞，细胞悬液收集人

１．５ｒＩｌＬ

ＥＰ管中，４℃下１５００ｒ／ｌｌｌｉｎ离心３ＩＩｌｉｎ；弃去上清液，

ｇ／Ｌ

Ｂ２７、５０ｍＬ／ＬＦＢｓ、５０ｍＬ／Ｌ

０．５姗×０．６

２晷／Ｌ碳酸氢钠、２０２０恤矿Ｌ

２５

２０

７斗ｍｏＬ／Ｌ的阿糖胞苷，培养２天后吸除培养液后加人３加入培养液（Ｎｅｕｒｏｂ嬲ａｌ、２０

！墨型！鲤！＝墨！！！绁塑皇盆王鱼痤堂苤壶（ｇ堕垫』ｇ！！！堕竺！！堡望！！Ｑ１２兰塑墨：丝（业

马血清、１００删Ｌ

ＡＡ－２Ｐ、９

ｇ／Ｌ谷胺酰胺）调整细胞悬液密度至２×１０８／Ｌ，在放置用多聚赖氨包被的玻璃爬片２４孔板中培养，隔天更换半量培养液，第３天取含培养细胞的盖玻片经４０ｇ／Ｌ多聚甲醛固定后行免疫荧光染色。

１．２．２免疫荧光染色免疫荧光染色参照文献［３］的方法。简要操作步骤如下：细胞爬片或冰冻切片用ＰＢＳ冲洗５

Ｉｎｉｎ×３；

加入３７℃预热的含４０ｇ／Ｌ多聚甲醛固定１０ＩＩｌｉｎ；ＰＢｓ漂洗３

次，加入５０９／ＬＢＳＡ和嘶ｔｏｎｘ—１００的０．Ｏｌｍ彬ＬＰＢｓ，室温下

置１ｈ，加入—抗孵育２ｈ，一抗分别为兔抗ＴＨｍＡｂ（１：２０００）、

小鼠抗Ｂ．ＴＩｌⅧｉｎⅢｍＡｂ（１：ｌ

０００）；ＰＢｓ漂洗３次，加入

二抗孵育１ｈ，二抗分别为抗兔ｃｙ３（１：３００）、抗小鼠ｃｙ２（１：３００）；ＰＢｓ漂洗３次后封片，荧光显微镜下观察、拍照片。免疫荧光双标结合Ｈｏｅｃｈｓｔ衬染指的是在一抗孵育的过程中同时加入上述２种一抗，浓度同前，孵育时间同前，并在二抗孵育后的ＰＢｓ漂洗后，加入１：ｌ０００稀释的Ｈｏｃｅｈｓｔ３３２５８孵育２ｍｉｎ复染细胞核，然后再继续ＰＢＳ漂洗３次后封片。阴性对照用ＭＰＢｓ代替特异性一抗，阳性对照采用雄性

３５０

ｇ左右的ｓｐｒａｇｌｌｅ．Ｄａｗｌｅｙ大鼠的中脑黑质冰冻切片，其他

步骤同上。荧光显微镜下观察并分类计数细胞。荧光显微镜

使用铬滤片，ｃｙ３激发波长５５４啪，发射波长５７０咖；ｃｙ２激发波长４９５砌，发射波长５２５ｎｍ；Ｈｏｃｅｈｓｔ３３２５８激发波长３５４砌，发射波长４５４ｎｍ。

２结果

２．１

Ｅ１２鼠胚ＭＰｃ体外生长的形态学的观察体外培养第

ｌ天培养细胞呈比较均匀的单个分散或数个聚集的贴壁生长，细胞周围有较强的折光性；４８ｈ后即可形成集落状贴壁生长的细胞团；随着培养时间的延长细胞团直径进一步增大，３—

４

ｄ后可形成肉眼可见细胞团。４～５ｄ细胞团边缘可见大量

长突起，少量细胞从细胞团内向外迁移，这些具有长突起的细胞形态相对成熟；６～７ｄ时当培养液中撤去ｂＦＧＦ后，从神经球向外迁移的细胞明显增多，细胞形态进一步成熟（图１）。联合使用Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ和Ａｍ－ｃ后，细胞生长受到抑制，胞体呈多边形的胶质细胞皱缩，悬浮，换液后多为胞体椭圆的神经元细胞。

２．２

Ｅ１２鼠胚ＭＰＣ细胞体外生长增殖能力的观察

ＭＰＣ接

种后部分细胞死亡，第２天细胞数轻度下降，随后迅速升高，培养１周后细胞数量达到培养前的（１６．５４±１．２５）倍（乃＝６），随后增长速度放缓，９ｄ后，细胞数量为培养前的（２１．３５±２．０３）倍。

２．３

Ｅ１２鼠胚ＭＰｃ细胞体外培养后分化能力的观察及其鉴

定细胞培养后的第２、６、１０、１２天后，应用ｃｙ３（红色）、ｃｙ２（绿色）加Ｈｏｅｃｈｓｔ（蓝色）复染细胞核的免疫荧光标记技术定性观察培养细胞。结果显示，细胞培养的第２天，ＴＨ阳性细胞不明显，第６天阳性细胞主要出现在细胞团块中，并且细胞突起明显。神经球内部以及神经球之间的多巴胺神经元形成广泛突触联系。ＴＨ阳性神经元的比例与神经球的大小有关，神经球越大，阳性细胞的比例相对越高。第１０天，ＴＨ阳性神经元的数量继续增多，且有大量细胞开始向外迁移

万　

方数据（图２）。在高倍视野下随机选取５个视野，以Ｈ∞ｃｌｌｓｔ标记的细胞核数代表细胞总数，Ｂ－ＴｕｂｕＨｎⅢ阳性细胞数代表成熟神

经元数，７ｍ阳性细胞数代表多巴胺神经元数，取其５个视野

的平均数作为该爬片的实际细胞数，随机抽取５个爬片。结果显示Ｂ－ＴｕｂｌｌｌｉｎⅢ阳性细胞占总细胞的（４９．５３士２．３４）％，’ＩＨ阳性细胞占总细胞的（２６．７６±２．３６）％。第１２天，使用Ａｍ．ｃ抑制胶质细胞生长后，神经元数量有所下降，但不明显，胶质细胞绝大多数消失，神经元比例达（９４±７．３２）％，其中多巴胺神经元占总细胞数的（３５．５６±４．１３）％（图３）。

图１从神经球向外迁移的细胞（×４００）

图２免疫荧光（ｃｙ３标记一红色荧光）显示大量神经元从神经球中外迁（×１００）

图３免疫荧光双标结合Ｈｏｅｃｌｌｓｔ衬染的多巴胺神经元（×４００）

３讨论

来自胚胎不同部位的神经前体细胞经体外培养后细胞分化有明显的区域特异性，来自中脑和间脑的神经前体细胞有更高的ＴＨ抗原阳性细胞分化率，细胞形态也更接近于中脑ＤＡ能神经元Ｈ１。我们选择Ｅ１２胎龄鼠胚作为实验对象，收集中脑腹侧细胞进行体外培养。ｂＦＧＦ是促进有丝分裂的小蛋白分子或多肽类物质，具有促进神经元存活和生长发育作用。当ｂＦＧＦ浓度达到１０—２０斗ｇ／Ｌ时，细胞增殖达较高水平，之后随着ｂＦＧＦ浓度增加，细胞增殖速度反而下降。ｂＦＧＦ有促进早期胚胎ＭＰｃ增殖的能力，

ｂＦＧＦ促进ＭＰＣ增殖有２个高峰，第１个高峰是神经元增殖高峰，出现在原代培养的前５

ｄ，６～９

ｄ主要

促进胶质细胞的增殖。抗坏血酸（ＡＡ）是人体生长和发育必需的营养素，最近研究表明其也有诱导中脑前体细胞分化为ＤＡ能神经元的作用。ｋｅ等”１发现一定剂量的ＡＡ单独也能诱导神经干细胞分化为ＤＡ能神经元。其机制可能是通过上调中脑前体细胞内ＥＰｏ和ＢＭＰ７的表达来介导ＤＡ能神经元的诱导分化。我们所用的ＡＡ一２Ｐ是一种性状更加稳定的ＡＡ衍生物。在ｂＦＧＦ和ＡＡ一２Ｐ作用下，Ｅ１２鼠胚中脑腹侧细胞体外培养４ｄ后能增殖形成肉眼可见的细胞簇，ＭＰｃ扩增培养７ｄ后，细胞数量大约增加到培养前的（１６．５４±１．２５）倍，９

ｄ后，细胞数量为培养前

！曼盟！Ｑ盟＝墨Ｚ三！细照生筮王鱼蕉堂苤盔（垡地坠』￡！！！塑壁！！坐堡坚望Ｑ！）塑墨：丝（垒）

的（２１．３５±２．０３）倍。１０ｄ后培养细胞中ＴＨ阳性细胞约占细胞总数的（２６．７６±２．３６）％。体外扩增培养第３天开始细胞簇之间和细胞簇的边缘有一些贴壁生长、具有长突起的形态相对成熟的细胞，随时间延长呈逐渐增多的趋势；培养液中撤去ｂＦＧＦ后，更多的细胞从细胞簇向外迁出、分化。

考虑到Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ主要有利于神经元的生长、增殖，对胶质细胞生长起抑制作用，但不能促使胶质细胞凋亡。抑制细胞有丝分裂的药物Ａｎ—ｃ可迅速作用分裂的神经胶质细胞，使之抑制或死亡，主要被胶质细胞摄取，引起胶质细胞凋亡，但也有部分被神经元摄取，导致神经元凋亡，且随时间和剂量呈正相关，因此我们在神经胶质细胞增殖的高峰期短期内加入Ａｒａ—ｃ。试验结果显示二者合用培养２ｄ，细胞总数下降到原来的（５４．６５±３．３８）％，胶质细胞绝大多数消失，神经元比例达９４％以上，其中多巴胺神经元占总细胞数的（３５．５６±４．１３）％。

综上所述，我们认为Ｅ１２鼠胚ＭＰｃ在包含有ｂＦ－ＧＦ和ＡＡ一２Ｐ的培养液中扩增良好，该培养液不仅能明显增加细胞数量，同时也能提高培养细胞向ＤＡ能神经元的分化比例。联合使用Ｎｅｕｍｂ鹊ａｌ和Ａｒａ－ｃ可

参考文献：

４０５

明显降低胶质细胞的含量，神经元的比例上升到９４％以上，多巴胺神经元的比例更是达到了（３５．５６±４．１３）％，提示Ｅ１２鼠胚ＭＰＣ原代培养，联合使用ｂＦＧＦ和ＡＡ．２Ｐ，合并使用Ａｒａ—ｃ是建立高纯度ＤＡ能神经元培养体系可靠途径。

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ｃｅｎｔｒａｌ

ｎｅｒｖａｕｓ

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ｄ叩ａｌＩｌｉｎｅ画ｃｎｅｕｒｏ∞ａｎｄ

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ｉｎｄｕｃｅｄ

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ｈｕｍａｎ

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［５］Ｌ∞ＪＹ，ＫｏｈＨｃ，ｃｈ肌ｇＭＹ，甜羽．Ｅｒｙｔｈｍｐｏｉｅｔｉｎ明ｄｂｏｎｅ

ｇｅｎｅｔｉｃ

ｍｏｒｐｈｏ－

ｐＩＤｔｅｉｎ—ｍｅｄｉａｌｅ艄ｃｏｒｂａｔｅ—ｉｎｄｕｃｅｄ

台啪鲫ｂｒ）ｒ痂ｃｍｅ∞ｎｃｅｐｈａＪｉｃ

（１０）：１４０１—１４０４．

ｄ叩ａｎｌｉｎｅｒｇｉｃ删．ｅ”ｍｉａｔｉｏｎ

ｐｒｅｃｕ培懈［Ｊ］．肫啪即们，２００３，１４

◆●，◆－●ｌ‘◆‘●【｜●“◆＿＿◆－¨＿◆ｌ＿◆◆・●●‘●’◆”◆“◆－◆１◆●・一◆ｒ◆‘◆，ｌ｜◆◆Ｉ｜◆●１◆一＿｜◆ｌ’●ｌ、◆＿｜●・¨◆１’◆Ⅲ●ｒ¨＿●ｌ｜◆ｍ●Ｉ－◆『＿＿●｛’◆－ｌ｜●＿＿◆一ｌ’◆－¨＿◆一Ｉ【ｌ◆小

（上接４０２页）

加入胸苷的时间，因生长活性好的ＶＳＭＣ，生长周期一般为２０ｈ左右，一般要继续培养ｓ＋Ｇ，／Ｍ期时间（约为１４ｈ）；（４）同步ＶｓＭＣ，消耗时间长，采用ＦｃＭ密切监测其通过Ｇ。／Ｓ期、ｓ期进程，同时最终结果，需连续重复３次以上实验一致才有一定的意义，而对于Ｇ：／Ｍ期，采用经Ｓ期过后，１００ｍｍｏＬ／Ｌ胎牛血清刺激后，流式细胞术监测同步效果一般在２０％一３０％左右（未列图）。而通过血清饥饿法后，采用秋水仙素１００ｍ∥Ｌ刺激能达到５０％以上的效果，根据实验结果，相对于细胞株来说，能够达到实验要求‘８｜。

ＶｓＭｃ属于增殖潜能的细胞，其增殖过程受细胞周期的调控，生理状态下血管平滑肌细胞位于血管中层，处于静息状态，在细胞周期中停留在Ｇ。／Ｇ。期，为可分化的、可收缩表型。而在某些情况下，血管中层的ＶＳＭＣ就会被激活、开始ＤＮＡ复制，ＶｓＭｃ转化为合成表型。ＤＮＡ复制一旦被启动（Ｇ，／ｓ期），就会继续进入ｓ期、Ｇ：期和Ｍ期，完成一个细胞周期。随着ＶｓＭｃ细胞周期的运行，分泌大量细胞外基质，导致血管新生内膜形成及增生，因此ＶＳＭＣ是再狭窄的主要作用细胞，也是再狭窄防治研究最重

要的靶细胞。本实验中采用细胞周期的同步化，首次对于体外血管平滑肌培养，采用胸苷、秋水仙素同步，使细胞停留于Ｇ，／Ｓ期（ＤＮＡ合成起始转换点）、ｓ、Ｇ：／Ｍ期（有丝分裂诱导转换点）。为进一步研究血管平滑肌细胞增殖调控机制提供依据。参考文献：

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ｃｉｎｅ

Ｒｓ，Ｂｏｑｕ既ｔ

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万方数据　

一种高纯度多巴胺神经元原代培养方法的建立

作者：作者单位：

白龙梅， 李学忠， 张志琳， 刘春风

白龙梅,张志琳(苏州大学附属第二医院神经内科,江苏,苏州,215004)， 李学忠,刘春风(苏州大学附属第二医院神经内科,江苏,苏州,215004;苏州大学衰老与神经疾病实验室,江苏,苏州,215004)

细胞与分子免疫学杂志

CHINESE JOURNAL OF CELLULAR AND MOLECULAR IMMUNOLOGY2008,24(4)

刊名：英文刊名：年，卷(期)：

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