米糠发酵生产富集γ－氨基丁酸的研究
郑晓晨，陈野，宋佳，张奕鹏
（天津市食品营养与安全重点实验室，天津科技大学食品工程与生物技术学院，天津300457）
摘
要：以米曲霉为菌种，在保留米糠内其它多种生物活性营养物质的前提下，利用液体和固体两种发
酵方法生产γ－氨基丁酸（GABA ），在单因素实验的基础上采用正交分析法对米糠富集γ－氨基丁酸（GA-BA ）的培养基组分谷氨酸（GLU ）、CaCl 2和Tween －80进行优化。结果表明，米糠富集GABA 的最适培养基组分为谷氨酸5g ，CaCl 24g ，Tween －804mL 。GABA 富集最高量是固体发酵时的142. 04mg /100g。
关键词：米糠；γ－氨基丁酸；发酵；米曲霉；优化
Study on fermentation conditions of rice bran for
production of γ－Aminobutyric acid
ZHENG Xiao-chen ，CHEN Ye *，SONG Jia ，ZHANG Yi-peng （College of Food Engineering and Biotechnology ，Tianjin University of Science
and Technology ，Tianjin 300457）
Abstract ：Ｒicebran was as raw materials ，the γ－aminobutyric acid （γ－GABA ）was produced by liquid －and sol-id －state fermentation using Aspergillus oryzae ．The effect of added the GLU ，CaCl 2and Tween －80during fermenta-tion on produced yield of the γ－GABA was explored．The results showed that the Suitable additives were 5g of GLU ，4g of CaCl 2and 4mL of Tween －80，then the γ－GABA contents in solid －state fermentation was higest ，reached 142. 04mg /100g．
Key words ：rice bran ；γ－aminobutyric acid ；fermentation ；aspergillus oryzae ；optimization
稻谷是我国第一大粮食品种，目前年产2亿吨左右，占全国粮食总产量的42%，世界粮食总产量的37%，是一种产量较大的可再生资源谷加工的主要副产品14%33%
［2］
［1］
种非蛋白质氨基酸，产生于植物，微生物，哺乳类动物由谷氨酸经谷氨酸脱羧酶催化转化而来
［4］
。，氨基丁酸是一种生理活性成分，能降血
［5］
米糠由种皮、果皮、外胚乳和糊粉层组成，是稻
。米糠营养丰富，含油脂
18%、无氮浸出物
12%，
14%和灰分8%
24%、蛋白质12%53%、水分7%
压，改善脑机能，促进长期记忆，促进生长激素分泌，具有活化肾功能、肝功能等功能组织中GABA 的含量通常在0. 3间
［6］
。植物
32. 5μmol /g之
。人们从天然食物中摄取的GABA ，尚不能
［7］
此外还含有生育酚、生育三烯酚、脂多糖、谷维素、α－硫辛酸、角鲨烯、神经酰胺等多种天然抗氧化剂和多种生物活性物质，因此，米糠在国
［3］
内外被誉为“天赐营养源”。
满足人体生理需要。需要对食品原料采用一定的技术处理以达到富集GABA 的目的
。
为了拓展了米糠的开发利用，富集大量的GABA ，从而使其附加值极大地提高。本文采用米曲霉发酵工艺，利用米糠为原材料，通过液体和固体发酵优化试验，提高发酵产物中γ－氨基
米糠中氨基酸组成丰富，特别是含有γ－氨基丁酸（γ－aminobutytric acid ，简称GABA ），一
丁酸含量。使用米曲霉（Aspergillus oryzae ）发酵是由于其具有丰富的蛋白酶系，能产生酸性、中性和碱性蛋白酶，其稳定性高，能耐受较高的温度，广泛地应用于食品、医药及饲料等工业中
［8，9］，
1. 3. 2
种子液的制备
种子培养基（1L ）：马铃薯200g ，酵母膏2. 0g ，KH 2PO 41. 0g ，MgSO 40. 6g 。种子液培养：将活化的菌种接种于种子培养液中，在转速130r /min、温度30℃的摇床中培养16h 。1. 3. 3
液体发酵
在250mL 的锥形瓶中分别加入10g 米糠、100mL 水，高压蒸汽灭菌20min ，取出接种种子液进行培养，接种量7. 5%，培养转速130r /min，培养时间2d ，培养温度为28℃。1. 3. 4
固体发酵
将米糠与水以1∶1（W /V）比例混合均匀，经高压蒸汽灭菌20min ，取出接种种子液进行培养，接种量10%，培养时间3d ，培养温度为32℃，相对湿度90%。1. 3. 5
样品处理
将发酵后的米糠放入烘箱进行鼓风干燥，烘干温度30℃，烘干时间2d ，取出后粉碎，研磨成粉，冷藏备用。1. 4GABA 的富集1. 4. 1
单因素实验
在米糠发酵时分别添加谷氨酸，氯化钙和Tween －80三种组分，通过单因素实验研究各组分对米糠富集GABA 的影响，确定其最佳工艺。1. 4. 2正交实验
在单因素试验的基础上，从均匀分散，整齐可比的角度出发，用正交表来安排少量的实验，从多个因素中分析出哪些是主要的，以及它们对实验的影响规律，从而找出较优的工艺条件，以培养基中谷氨酸（A ）、氯化钙（B ）、Tween －80（C ）3因素与米糠中GABA 含量进行正交试验设计，优化米糠富集GABA 培养液组分添加量。通过方差分析，预测富集的最佳组分添加量。1. 51. 5. 1
产物中GABA 的测定
液相色谱条件的确定
色谱柱：Agilent C 18－5μ250×4. 6mm ；柱温：40℃；
流动相：1. 6g CH 3COONa ·3H 2O （pH7. 2），
。特别是含有的谷氨酰胺酶，可以催化谷
氨酰胺转化为谷氨酸。米曲霉也是美国食品与药物管理局和美国饲料公司协会1989年公布的40余种安全微生物菌种之一。另外，由于米糠中的米胚含有GAD 且活力较高，能将Glu 转化为GA-BA 。在发酵同时，向培养基中添加不同组分激活GAD 以达到GABA 的最大富集量［10］。本文在米糠富集GABA 培养基组分单因素试验基础上，采用正交法优化培养基中各组分添加量，研究了各组分对米糠富集GABA 的影响及交互作用。从而达到富集GABA 的目的。
1
1. 1
材料与方法
材料与试剂
米糠，天津市津田米业有限公司；米曲霉菌
——沪酿3. 042，（即As 3. 951）源于天津科技种—
大学菌种保藏库；γ－氨基丁酸标准品（纯度＞99%），购于sigma 公司；乙腈（色谱纯）、甲醇（色谱纯），天津市康科德科技有限公司；邻苯二甲醛（OPA 化学纯），天津市光复精细化工研究所；β－巯基乙醇（纯度＞99%），AMEＲCO公司；硼酸、CH 3COONa ·3H 2O 、三氯乙酸（TCA ）、次氯酸钠均为分析纯，天津市北方天医化学试剂厂。1. 2
主要仪器设备
ZHWY －2121C 双层小容量恒温培养摇床
（上海智城分析仪器制造有限公司）；HPX －250B 恒温恒湿箱（上海悦丰仪器仪表有限公司）；TDL －5－A 型低速台式大容量离心机（上海安亭科学仪器厂）；Agilent －1200型高效液相色谱仪－附紫外检测器、TC －C18反相色谱柱（4. 6mm ×250mm 5μm ）（AGILENT 公司）。1. 31. 3. 1
米糠发酵斜面培养
斜面培养基：马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA ）；斜面培养：将米曲霉菌种接种于PDA 斜面，30℃，80%相对湿度恒温培养2d ，冷藏备用。
600mL ；甲醇200mL ；乙腈200mL ；检测波长：338nm ，
流速：1. 0mL /min。进样量：20μL ；衍生试剂：邻苯二甲醛（OPA ）100mg ，β－巯基乙醇
200μL ，乙腈25mL 。0. 4mol /L硼酸缓冲液（pH ：10. 4）：硼酸24. 7g ，超纯水1L ，调pH 至10. 4。1. 5. 21. 5. 2. 1
GABA 含量测定的方法：
标准溶液的制备：准确称取适量γ－氨
基丁酸标准品，用高纯去离子水溶解，并定容混匀备用。再分别取适量γ－氨基丁酸标准品储备液于容量瓶中，加水定容至刻度混匀，制成相当于3. 125、6. 25、12. 5、22. 5、32. 5、42. 5mg /L浓度样品，作为标准系列应用液。1. 5. 2. 2
发酵样品制备：将液态、固态发酵样品
准确称取1. 000g ，加入5%TCA 10mL 后再过
图1
GABA 标准品的液相色谱图
0. 45μm 滤膜，取清液作为样品分析液。1. 5. 2. 3
GABA 的衍生：吸取硼酸缓冲液2mL ，
OPA 衍生试剂0. 4mL ，供试品0. 4mL ，混合均匀
通过回归计算求得回归方程y =0. 1135x －0. 4592，相关系数Ｒ2=0. 9996，工作曲线如图2。
后室温反应5min 。
1. 5. 2. 4GABA 的测定：将配置好并衍生后的发酵样品分析液吸取20μL 进样，根据标品峰的出峰时间确定样品峰并记录下峰面积。根据样品峰的峰面积，在标准工作曲线上查含量，再换算。计算公式为：
Y ×2. 8×100Z ==7Y
1000×0. 4
式中：Z 是发酵样品中γ－氨基丁酸含量（发酵单位为：mg /100g，其中液体发酵单位是以其中固体基质为标准确定）；Y 是发酵样品提取后样品分析液中由高效液相色谱法测得的γ－氨基丁酸含量（mg /L）。
图2
GABA 标准曲线
2
2. 1
结果与讨论
GABA 标准色谱图
按选定的色谱条件，将配制好的标准溶液系列应用液进行分析，进样量20μL ，每个浓度重复3次，得到γ－氨基丁酸的标准色谱图。γ－氨基丁酸标准品的HPLC 图在5. 50min 左右会出现一个典型色谱峰，保留时间约为0. 7min （图1）。2. 2绘制GABA 标准曲线
按选定的色谱条件，将配制好的标准溶液系列应用液进行分析，进样量20μL ，每个浓度重复3次，在一定浓度范围内，γ－氨基丁酸的紫外吸收（可转变为某时刻出峰的峰面积大小）与γ－氨基丁酸浓度呈直线关系。以峰面积为横坐标，γ－氨基丁酸浓度为纵坐标，绘制标准工作曲线，
图3
添加富集组分的米糠发酵产物液相色谱图
2. 3发酵产物液相色谱图
2. 4发酵产物GABA 浓度分析2. 4. 1单因素实验结果分析2. 4. 1. 1
谷氨酸对发酵米糠富集GABA 的影响：
对固液发酵的米糠培养基分别加入谷氨酸，进行培养液组分的含量试验。谷氨酸添加量在0－7g ，GABA 的含量随谷氨酸含量的增加呈先上升后下降的趋势（表1）。固态发酵后，谷氨酸添加量为
5g 时米糠GABA 含量达99. 45mg /100g，为不添加谷氨酸时的2. 88倍。液态发酵后，谷氨酸添加
表1
因素
固态发酵GABA （mg /100g）液态发酵GABA （mg /100g）
34. 5216. 01
155. 3437. 62
量为5g 时米糠GABA 含量达59. 02mg /100g，为不添加谷氨酸时的3. 68倍。
谷氨酸对固液发酵米糠富集GABA 含量的影响
谷氨酸/g
259. 7951. 29
382. 4354. 07
493. 2157. 93
599. 4559. 02
657. 1342. 86
750. 1039. 51
2. 4. 1. 2
氯化钙对发酵米糠富集GABA 的影响：
米糠固液态发酵中氯化钙添加量在0－6g 时，米发酵后，氯化钙添加量为4g 时米糠中GABA 含量达到44. 04mg /100g，为对照的1. 28倍。液态发酵后，氯化钙添加量为3g 时米糠中GABA 含量达到32. 30mg /100g，为对照的2. 01倍。
糠GABA 含量随氯化钙添加量的升高呈先上升后下降的趋势，且各处理间差异显著（表2）。固态
表2
因素
固态发酵GABA （mg /100g）液态发酵GABA （mg /100g）
34. 5216. 01
135. 4016. 57
氯化钙对固液发酵米糠富集GABA 含量的影响
氯化钙/g
236. 1124. 20
343. 3432. 30
444. 0432. 01
542. 5132. 05
634. 8932. 03
2. 4. 1. 3
Tween －80对发酵米糠富集GABA 的影
响：如表3所示，固液发酵米糠培养基中Tween －80的含量在07mL 范围内，，GABA 含量随着Tween －80的增加而升高，到7mL 时含量大幅下
表3
因素
〗固态发酵GABA （mg /100g）液态发酵GABA （mg /100g）
34. 5216. 01
153. 9921. 16
降。固态发酵时，当Tween －80为5mL 时GABA
含量最高，达到67. 62mg /100g，为对照的1. 96倍。液态发酵时，当Tween －80为5mL 时GABA 含量最高，达到33. 71mg /100g，为对照的2. 1倍。
Tween －80对固液发酵米糠富集GABA 含量的影响
Tween －80/mL
254. 4727. 14
362. 6533. 57
467. 5533. 64
567. 6233. 71
667. 3133. 65
760. 2128. 33
2. 5
米糠固态发酵正交实验结果分析
在实际发酵情况下，根据单因素试验的结
表4
因素（A ）谷氨酸/g（B ）氯化钙/g
响应面设计因素水平表
水平编码
13. 03. 04. 0
24. 04. 05. 0
35. 05. 06. 0
果，选择谷氨酸添加量（3g 、4g 、5g ）、氯化钙添加量（3g 、4g 、5g ）和Tween －80（4mL 、5mL 、6mL ）为影响因素，选用L 9（34）正交表进行正交试验，以测定固体发酵产物中γ－氨基丁酸的含量，其结果见表4和表5。
（C ）Tween －80/mL
表5
试验号
A 谷氨酸
123456789K1j K2j K3j K1j 2K2j 2K3j 2
[1**********]6. 62399. 29417. 77127177. 82159432. 50174531. 77
正交试验结果与分析
因素
γ－氨基丁酸含量
C Tween [1**********]7. 53389. 23396. 92150179. 50151499. 99157545. 49
D 空列
[1**********]3. 38396. 45393. 85146980. 22157172. 60155117. 82
T =1173. 68（mg /100g）111. 28123. 09122. 25129. 56135. 52134. 21139. 15142. 04136. 58
B 氯化钙
[1**********]9. 99400. 65393. 04144392. 40160520. 42154480. 44
通过公式计算：
T 21173. 6821377524. 74
==153058. 30CT ==
n 99SS A =
1
（K 1j 2+K 2j 2+K 3j 2）3
－CT =655. 73
本实验指标越大越好，对因素A ，B 分析，确定优水平为A3，B2，优水平组合为A3B2C1，即谷氨酸添加量为5g ，氯化钙添加量为4g ，Tween －80添加量为4mL 。GABA 富集最高量为142. 04mg /100g。2. 6
米糠液态发酵正交实验结果分析
在实际发酵情况下，根据单因素试验的结
根据以上计算，进行显著性检验，列出方差分析表，结果见表6。
表6
因素A 谷氨酸（g ）B 氯化钙（g ）C Tween －80（mL ）
误差总和
正交试验方差分析
自由度2222
均方327. 8736. 408. 3515. 96
F 值20. 552. 280. 52
显著性
果，选择谷氨酸添加量（3g 、4g 、5g ）、氯化钙添加量（3g 、4g 、5g ）和Tween －80（4mL 、5mL 、6mL ）为影响因素，选用L 9（34）正交表进行正交试验，以测定固体发酵产物中γ－氨基丁酸的含量，其结果见表7和表8。
表7
因素
平方和655. 7372. 7916. 6931. 91777. 12
响应面设计因素水平表
水平编码
13. 03. 04. 0
24. 04. 05. 0
35. 05. 06. 0
〗（A ）谷氨酸/g
因素A 显著，因素B 和C 不显著。因素主次顺序为A －B －C ，即谷氨酸＞氯化钙＞T ween －80。
（B ）氯化钙/g（C ）Tween －80/mL
表8
试验号
A 谷氨酸
123456789K1j K2j K3j K1j 2K2j 2K3j 2
[1**********]3. 55269. 73277. 3664287. 6072754. 2776928. 57
正交试验结果与分析
因素
γ－氨基丁酸含量
C Tween [1**********]8. 26264. 09268. 2971963. 4369743. 5371979. 52
D 空列
[1**********]8. 32268. 36263. 9671995. 6272017. 0969674. 88
（mg /100g）83. 9984. 7984. 7786. 5491. 5791. 6291. 9592. 6592. 76T =800. 64
B 氯化钙
[1**********]2. 48269. 01269. 1568895. 7572366. 3872441. 72
通过公式计算：
T 2800. 642641024. 41CT ====712224. 93
n 99SS A =
1
（K 1j 2+K 2j 2+K 3j 2）3
－CT =98. 55
T ween －80。
本实验指标越大越好，对因素A ，B 分析，确定优水平为A3，B3，优水平组合为A3B3C2，即谷氨酸添加量为5g ，氯化钙添加量为5g ，Tween －80添加量为4mL 。GABA 富集最高量为92. 76mg /100g。2. 7
验证性实验
由正交试验得到的最佳培养液组分添加量与其他处理富集GABA 量见表10，表11验证性试验结果显示，用正交试验优化出的处理进行米糠富集GABA 时，其含量最高。
表10
固态发酵验证性实验
实验条件
处理
GABA 含量
Glu （g ）
无组分添加正交优化处理最佳单因素组合
055
CaCl 2（g ）054
tween －80（mL ）045
34. 52142. 04140. 58mg /100g
根据以上计算，进行显著性检验，列出方差分析表，结果见表9：
表9
Table 9
正交试验方差分析
The analytic result of extreme
difference of orthogonal test
因素A 谷氨酸（g ）B 氯化钙（g ）C Tween －80（mL ）
误差总和
平方和98. 559. 693. 904. 27128. 83
自由度2222
均方49. 284. 851. 952. 14
F 值23. 082. 270. 91
显著性
因素A 显著，因素B 和C 不显著。因素主次顺序为A －B －C ，即谷氨酸＞氯化钙＞
表11液态发酵验证性实验
实验条件
参考文献：
［1］姚惠源．世界稻米深加工的发展趋势和中国的潜在优势
GABA 含量
［C ］．中国粮油学会第二届学术年会论文选集，2002．［2］刘靖．张石蕊．米糠的营养价值及其开发利用［D ］．湖南
饲料，2010．
［3］顾振新，陈志刚，岳建华，汪志君．发芽糙米制备工艺研究
［J ］．食品工业科技，2004，25（1）：70－72．
［4］马晓博，张晖．利用米糠谷氨酸脱羧酶富集γ－氨基丁酸的
新研究［J ］．粮食与饲料工业，2007（10）：21－22．［5］Suk －Heung －Oh ，Yeon －Jong －Moon ，Chan －Ho －Oh．
Gamma －Aminobutyric Acid （GABA ）Content of Selected Un-cooked Foods ［J ］．Nutraceuticals and Food ，2003，8（1）：75－78．
［6］穆小民，吴显荣．氨基酸杂志［J ］．1994，4：44－47．［7］许建军，江波，许时婴．γ－氨基丁酸（GABA ）—种新型
的功能食品因子［J ］．食品工业科技，2003，11（24）：109－111．
［8］刘丽萍，刘丽华．米曲霉研究进展与应用［J ］．中国调味
品，2008（4）：28－32．
［9］周其洋，陶文沂．米曲霉多酶系优良菌株的诱变选育［J ］．
34（9）：57－60．中国调味品，2009，
［10］陈颖，沈艳，姚惠源．米糠γ－氨基丁酸富集工艺的研究
［J ］．粮食与饲料工业，2005，（4）：5－75．
处理
Glu （g ）
CaCl 2（g ）053
tween －80（mL ）055
mg /100g
无组分添加正交优化处理最佳单因素组合
055
16. 0192. 7685. 32
3结论
在利用米曲霉发酵米糠中添加Glu ，tween －
80，CaCl 2能富集GABA ，固态发酵产生的GABA 含量大于液态发酵产生的GABA 含量。利用正交分析可以看出，固态发酵时：Glu 、CaCl 2、tween －80添加量分别为5g 、5g 、4mL 时GABA 达到最高产量142. 04mg /100g；液态发酵时：Glu 、Cacl 2、tween －80添加量分别为5g 、5g 、5mL 时GABA 达到最高产量92. 76mg /100g，均达到了富檴檴檴檴檴檴檴檴檴檴檴檴檴檴檴檴檴檴檴檴檴檴檴檴檴檴檴檴殜
集γ－氨基丁酸的目的。
檴檴檴檴檴檴檴檴檴檴檴檴檴檴檴檴檴檴檴檴檴檴檴檴檴檴檴檴檴檴檴檴檴檴檴檴檴檴檴檴檴檴檴殜
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行业组织品牌展览
第十八届中国国际食品添加剂和配料展览会（FIC 2014）暨第二十四届全国食品添加剂生产应用技术展示会
Food Ingredients China 2014（FIC2014）
展出时间：2014年3月25日27日展出地点：上海世博展览馆
上海市浦东博成路850号
中国食品添加剂和配料协会中国国际贸易促进委员会轻工行业分会
《中国食品添加剂》杂志社
网址：www. fi －c. com 或www. ChinaFoodAdditives. com
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米糠发酵生产富集γ－氨基丁酸的研究
郑晓晨，陈野，宋佳，张奕鹏
（天津市食品营养与安全重点实验室，天津科技大学食品工程与生物技术学院，天津300457）
摘
要：以米曲霉为菌种，在保留米糠内其它多种生物活性营养物质的前提下，利用液体和固体两种发
酵方法生产γ－氨基丁酸（GABA ），在单因素实验的基础上采用正交分析法对米糠富集γ－氨基丁酸（GA-BA ）的培养基组分谷氨酸（GLU ）、CaCl 2和Tween －80进行优化。结果表明，米糠富集GABA 的最适培养基组分为谷氨酸5g ，CaCl 24g ，Tween －804mL 。GABA 富集最高量是固体发酵时的142. 04mg /100g。
关键词：米糠；γ－氨基丁酸；发酵；米曲霉；优化
Study on fermentation conditions of rice bran for
production of γ－Aminobutyric acid
ZHENG Xiao-chen ，CHEN Ye *，SONG Jia ，ZHANG Yi-peng （College of Food Engineering and Biotechnology ，Tianjin University of Science
and Technology ，Tianjin 300457）
Abstract ：Ｒicebran was as raw materials ，the γ－aminobutyric acid （γ－GABA ）was produced by liquid －and sol-id －state fermentation using Aspergillus oryzae ．The effect of added the GLU ，CaCl 2and Tween －80during fermenta-tion on produced yield of the γ－GABA was explored．The results showed that the Suitable additives were 5g of GLU ，4g of CaCl 2and 4mL of Tween －80，then the γ－GABA contents in solid －state fermentation was higest ，reached 142. 04mg /100g．
Key words ：rice bran ；γ－aminobutyric acid ；fermentation ；aspergillus oryzae ；optimization
稻谷是我国第一大粮食品种，目前年产2亿吨左右，占全国粮食总产量的42%，世界粮食总产量的37%，是一种产量较大的可再生资源谷加工的主要副产品14%33%
［2］
［1］
种非蛋白质氨基酸，产生于植物，微生物，哺乳类动物由谷氨酸经谷氨酸脱羧酶催化转化而来
［4］
。，氨基丁酸是一种生理活性成分，能降血
［5］
米糠由种皮、果皮、外胚乳和糊粉层组成，是稻
。米糠营养丰富，含油脂
18%、无氮浸出物
12%，
14%和灰分8%
24%、蛋白质12%53%、水分7%
压，改善脑机能，促进长期记忆，促进生长激素分泌，具有活化肾功能、肝功能等功能组织中GABA 的含量通常在0. 3间
［6］
。植物
32. 5μmol /g之
。人们从天然食物中摄取的GABA ，尚不能
［7］
此外还含有生育酚、生育三烯酚、脂多糖、谷维素、α－硫辛酸、角鲨烯、神经酰胺等多种天然抗氧化剂和多种生物活性物质，因此，米糠在国
［3］
内外被誉为“天赐营养源”。
满足人体生理需要。需要对食品原料采用一定的技术处理以达到富集GABA 的目的
。
为了拓展了米糠的开发利用，富集大量的GABA ，从而使其附加值极大地提高。本文采用米曲霉发酵工艺，利用米糠为原材料，通过液体和固体发酵优化试验，提高发酵产物中γ－氨基
米糠中氨基酸组成丰富，特别是含有γ－氨基丁酸（γ－aminobutytric acid ，简称GABA ），一
丁酸含量。使用米曲霉（Aspergillus oryzae ）发酵是由于其具有丰富的蛋白酶系，能产生酸性、中性和碱性蛋白酶，其稳定性高，能耐受较高的温度，广泛地应用于食品、医药及饲料等工业中
［8，9］，
1. 3. 2
种子液的制备
种子培养基（1L ）：马铃薯200g ，酵母膏2. 0g ，KH 2PO 41. 0g ，MgSO 40. 6g 。种子液培养：将活化的菌种接种于种子培养液中，在转速130r /min、温度30℃的摇床中培养16h 。1. 3. 3
液体发酵
在250mL 的锥形瓶中分别加入10g 米糠、100mL 水，高压蒸汽灭菌20min ，取出接种种子液进行培养，接种量7. 5%，培养转速130r /min，培养时间2d ，培养温度为28℃。1. 3. 4
固体发酵
将米糠与水以1∶1（W /V）比例混合均匀，经高压蒸汽灭菌20min ，取出接种种子液进行培养，接种量10%，培养时间3d ，培养温度为32℃，相对湿度90%。1. 3. 5
样品处理
将发酵后的米糠放入烘箱进行鼓风干燥，烘干温度30℃，烘干时间2d ，取出后粉碎，研磨成粉，冷藏备用。1. 4GABA 的富集1. 4. 1
单因素实验
在米糠发酵时分别添加谷氨酸，氯化钙和Tween －80三种组分，通过单因素实验研究各组分对米糠富集GABA 的影响，确定其最佳工艺。1. 4. 2正交实验
在单因素试验的基础上，从均匀分散，整齐可比的角度出发，用正交表来安排少量的实验，从多个因素中分析出哪些是主要的，以及它们对实验的影响规律，从而找出较优的工艺条件，以培养基中谷氨酸（A ）、氯化钙（B ）、Tween －80（C ）3因素与米糠中GABA 含量进行正交试验设计，优化米糠富集GABA 培养液组分添加量。通过方差分析，预测富集的最佳组分添加量。1. 51. 5. 1
产物中GABA 的测定
液相色谱条件的确定
色谱柱：Agilent C 18－5μ250×4. 6mm ；柱温：40℃；
流动相：1. 6g CH 3COONa ·3H 2O （pH7. 2），
。特别是含有的谷氨酰胺酶，可以催化谷
氨酰胺转化为谷氨酸。米曲霉也是美国食品与药物管理局和美国饲料公司协会1989年公布的40余种安全微生物菌种之一。另外，由于米糠中的米胚含有GAD 且活力较高，能将Glu 转化为GA-BA 。在发酵同时，向培养基中添加不同组分激活GAD 以达到GABA 的最大富集量［10］。本文在米糠富集GABA 培养基组分单因素试验基础上，采用正交法优化培养基中各组分添加量，研究了各组分对米糠富集GABA 的影响及交互作用。从而达到富集GABA 的目的。
1
1. 1
材料与方法
材料与试剂
米糠，天津市津田米业有限公司；米曲霉菌
——沪酿3. 042，（即As 3. 951）源于天津科技种—
大学菌种保藏库；γ－氨基丁酸标准品（纯度＞99%），购于sigma 公司；乙腈（色谱纯）、甲醇（色谱纯），天津市康科德科技有限公司；邻苯二甲醛（OPA 化学纯），天津市光复精细化工研究所；β－巯基乙醇（纯度＞99%），AMEＲCO公司；硼酸、CH 3COONa ·3H 2O 、三氯乙酸（TCA ）、次氯酸钠均为分析纯，天津市北方天医化学试剂厂。1. 2
主要仪器设备
ZHWY －2121C 双层小容量恒温培养摇床
（上海智城分析仪器制造有限公司）；HPX －250B 恒温恒湿箱（上海悦丰仪器仪表有限公司）；TDL －5－A 型低速台式大容量离心机（上海安亭科学仪器厂）；Agilent －1200型高效液相色谱仪－附紫外检测器、TC －C18反相色谱柱（4. 6mm ×250mm 5μm ）（AGILENT 公司）。1. 31. 3. 1
米糠发酵斜面培养
斜面培养基：马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA ）；斜面培养：将米曲霉菌种接种于PDA 斜面，30℃，80%相对湿度恒温培养2d ，冷藏备用。
600mL ；甲醇200mL ；乙腈200mL ；检测波长：338nm ，
流速：1. 0mL /min。进样量：20μL ；衍生试剂：邻苯二甲醛（OPA ）100mg ，β－巯基乙醇
200μL ，乙腈25mL 。0. 4mol /L硼酸缓冲液（pH ：10. 4）：硼酸24. 7g ，超纯水1L ，调pH 至10. 4。1. 5. 21. 5. 2. 1
GABA 含量测定的方法：
标准溶液的制备：准确称取适量γ－氨
基丁酸标准品，用高纯去离子水溶解，并定容混匀备用。再分别取适量γ－氨基丁酸标准品储备液于容量瓶中，加水定容至刻度混匀，制成相当于3. 125、6. 25、12. 5、22. 5、32. 5、42. 5mg /L浓度样品，作为标准系列应用液。1. 5. 2. 2
发酵样品制备：将液态、固态发酵样品
准确称取1. 000g ，加入5%TCA 10mL 后再过
图1
GABA 标准品的液相色谱图
0. 45μm 滤膜，取清液作为样品分析液。1. 5. 2. 3
GABA 的衍生：吸取硼酸缓冲液2mL ，
OPA 衍生试剂0. 4mL ，供试品0. 4mL ，混合均匀
通过回归计算求得回归方程y =0. 1135x －0. 4592，相关系数Ｒ2=0. 9996，工作曲线如图2。
后室温反应5min 。
1. 5. 2. 4GABA 的测定：将配置好并衍生后的发酵样品分析液吸取20μL 进样，根据标品峰的出峰时间确定样品峰并记录下峰面积。根据样品峰的峰面积，在标准工作曲线上查含量，再换算。计算公式为：
Y ×2. 8×100Z ==7Y
1000×0. 4
式中：Z 是发酵样品中γ－氨基丁酸含量（发酵单位为：mg /100g，其中液体发酵单位是以其中固体基质为标准确定）；Y 是发酵样品提取后样品分析液中由高效液相色谱法测得的γ－氨基丁酸含量（mg /L）。
图2
GABA 标准曲线
2
2. 1
结果与讨论
GABA 标准色谱图
按选定的色谱条件，将配制好的标准溶液系列应用液进行分析，进样量20μL ，每个浓度重复3次，得到γ－氨基丁酸的标准色谱图。γ－氨基丁酸标准品的HPLC 图在5. 50min 左右会出现一个典型色谱峰，保留时间约为0. 7min （图1）。2. 2绘制GABA 标准曲线
按选定的色谱条件，将配制好的标准溶液系列应用液进行分析，进样量20μL ，每个浓度重复3次，在一定浓度范围内，γ－氨基丁酸的紫外吸收（可转变为某时刻出峰的峰面积大小）与γ－氨基丁酸浓度呈直线关系。以峰面积为横坐标，γ－氨基丁酸浓度为纵坐标，绘制标准工作曲线，
图3
添加富集组分的米糠发酵产物液相色谱图
2. 3发酵产物液相色谱图
2. 4发酵产物GABA 浓度分析2. 4. 1单因素实验结果分析2. 4. 1. 1
谷氨酸对发酵米糠富集GABA 的影响：
对固液发酵的米糠培养基分别加入谷氨酸，进行培养液组分的含量试验。谷氨酸添加量在0－7g ，GABA 的含量随谷氨酸含量的增加呈先上升后下降的趋势（表1）。固态发酵后，谷氨酸添加量为
5g 时米糠GABA 含量达99. 45mg /100g，为不添加谷氨酸时的2. 88倍。液态发酵后，谷氨酸添加
表1
因素
固态发酵GABA （mg /100g）液态发酵GABA （mg /100g）
34. 5216. 01
155. 3437. 62
量为5g 时米糠GABA 含量达59. 02mg /100g，为不添加谷氨酸时的3. 68倍。
谷氨酸对固液发酵米糠富集GABA 含量的影响
谷氨酸/g
259. 7951. 29
382. 4354. 07
493. 2157. 93
599. 4559. 02
657. 1342. 86
750. 1039. 51
2. 4. 1. 2
氯化钙对发酵米糠富集GABA 的影响：
米糠固液态发酵中氯化钙添加量在0－6g 时，米发酵后，氯化钙添加量为4g 时米糠中GABA 含量达到44. 04mg /100g，为对照的1. 28倍。液态发酵后，氯化钙添加量为3g 时米糠中GABA 含量达到32. 30mg /100g，为对照的2. 01倍。
糠GABA 含量随氯化钙添加量的升高呈先上升后下降的趋势，且各处理间差异显著（表2）。固态
表2
因素
固态发酵GABA （mg /100g）液态发酵GABA （mg /100g）
34. 5216. 01
135. 4016. 57
氯化钙对固液发酵米糠富集GABA 含量的影响
氯化钙/g
236. 1124. 20
343. 3432. 30
444. 0432. 01
542. 5132. 05
634. 8932. 03
2. 4. 1. 3
Tween －80对发酵米糠富集GABA 的影
响：如表3所示，固液发酵米糠培养基中Tween －80的含量在07mL 范围内，，GABA 含量随着Tween －80的增加而升高，到7mL 时含量大幅下
表3
因素
〗固态发酵GABA （mg /100g）液态发酵GABA （mg /100g）
34. 5216. 01
153. 9921. 16
降。固态发酵时，当Tween －80为5mL 时GABA
含量最高，达到67. 62mg /100g，为对照的1. 96倍。液态发酵时，当Tween －80为5mL 时GABA 含量最高，达到33. 71mg /100g，为对照的2. 1倍。
Tween －80对固液发酵米糠富集GABA 含量的影响
Tween －80/mL
254. 4727. 14
362. 6533. 57
467. 5533. 64
567. 6233. 71
667. 3133. 65
760. 2128. 33
2. 5
米糠固态发酵正交实验结果分析
在实际发酵情况下，根据单因素试验的结
表4
因素（A ）谷氨酸/g（B ）氯化钙/g
响应面设计因素水平表
水平编码
13. 03. 04. 0
24. 04. 05. 0
35. 05. 06. 0
果，选择谷氨酸添加量（3g 、4g 、5g ）、氯化钙添加量（3g 、4g 、5g ）和Tween －80（4mL 、5mL 、6mL ）为影响因素，选用L 9（34）正交表进行正交试验，以测定固体发酵产物中γ－氨基丁酸的含量，其结果见表4和表5。
（C ）Tween －80/mL
表5
试验号
A 谷氨酸
123456789K1j K2j K3j K1j 2K2j 2K3j 2
[1**********]6. 62399. 29417. 77127177. 82159432. 50174531. 77
正交试验结果与分析
因素
γ－氨基丁酸含量
C Tween [1**********]7. 53389. 23396. 92150179. 50151499. 99157545. 49
D 空列
[1**********]3. 38396. 45393. 85146980. 22157172. 60155117. 82
T =1173. 68（mg /100g）111. 28123. 09122. 25129. 56135. 52134. 21139. 15142. 04136. 58
B 氯化钙
[1**********]9. 99400. 65393. 04144392. 40160520. 42154480. 44
通过公式计算：
T 21173. 6821377524. 74
==153058. 30CT ==
n 99SS A =
1
（K 1j 2+K 2j 2+K 3j 2）3
－CT =655. 73
本实验指标越大越好，对因素A ，B 分析，确定优水平为A3，B2，优水平组合为A3B2C1，即谷氨酸添加量为5g ，氯化钙添加量为4g ，Tween －80添加量为4mL 。GABA 富集最高量为142. 04mg /100g。2. 6
米糠液态发酵正交实验结果分析
在实际发酵情况下，根据单因素试验的结
根据以上计算，进行显著性检验，列出方差分析表，结果见表6。
表6
因素A 谷氨酸（g ）B 氯化钙（g ）C Tween －80（mL ）
误差总和
正交试验方差分析
自由度2222
均方327. 8736. 408. 3515. 96
F 值20. 552. 280. 52
显著性
果，选择谷氨酸添加量（3g 、4g 、5g ）、氯化钙添加量（3g 、4g 、5g ）和Tween －80（4mL 、5mL 、6mL ）为影响因素，选用L 9（34）正交表进行正交试验，以测定固体发酵产物中γ－氨基丁酸的含量，其结果见表7和表8。
表7
因素
平方和655. 7372. 7916. 6931. 91777. 12
响应面设计因素水平表
水平编码
13. 03. 04. 0
24. 04. 05. 0
35. 05. 06. 0
〗（A ）谷氨酸/g
因素A 显著，因素B 和C 不显著。因素主次顺序为A －B －C ，即谷氨酸＞氯化钙＞T ween －80。
（B ）氯化钙/g（C ）Tween －80/mL
表8
试验号
A 谷氨酸
123456789K1j K2j K3j K1j 2K2j 2K3j 2
[1**********]3. 55269. 73277. 3664287. 6072754. 2776928. 57
正交试验结果与分析
因素
γ－氨基丁酸含量
C Tween [1**********]8. 26264. 09268. 2971963. 4369743. 5371979. 52
D 空列
[1**********]8. 32268. 36263. 9671995. 6272017. 0969674. 88
（mg /100g）83. 9984. 7984. 7786. 5491. 5791. 6291. 9592. 6592. 76T =800. 64
B 氯化钙
[1**********]2. 48269. 01269. 1568895. 7572366. 3872441. 72
通过公式计算：
T 2800. 642641024. 41CT ====712224. 93
n 99SS A =
1
（K 1j 2+K 2j 2+K 3j 2）3
－CT =98. 55
T ween －80。
本实验指标越大越好，对因素A ，B 分析，确定优水平为A3，B3，优水平组合为A3B3C2，即谷氨酸添加量为5g ，氯化钙添加量为5g ，Tween －80添加量为4mL 。GABA 富集最高量为92. 76mg /100g。2. 7
验证性实验
由正交试验得到的最佳培养液组分添加量与其他处理富集GABA 量见表10，表11验证性试验结果显示，用正交试验优化出的处理进行米糠富集GABA 时，其含量最高。
表10
固态发酵验证性实验
实验条件
处理
GABA 含量
Glu （g ）
无组分添加正交优化处理最佳单因素组合
055
CaCl 2（g ）054
tween －80（mL ）045
34. 52142. 04140. 58mg /100g
根据以上计算，进行显著性检验，列出方差分析表，结果见表9：
表9
Table 9
正交试验方差分析
The analytic result of extreme
difference of orthogonal test
因素A 谷氨酸（g ）B 氯化钙（g ）C Tween －80（mL ）
误差总和
平方和98. 559. 693. 904. 27128. 83
自由度2222
均方49. 284. 851. 952. 14
F 值23. 082. 270. 91
显著性
因素A 显著，因素B 和C 不显著。因素主次顺序为A －B －C ，即谷氨酸＞氯化钙＞
表11液态发酵验证性实验
实验条件
参考文献：
［1］姚惠源．世界稻米深加工的发展趋势和中国的潜在优势
GABA 含量
［C ］．中国粮油学会第二届学术年会论文选集，2002．［2］刘靖．张石蕊．米糠的营养价值及其开发利用［D ］．湖南
饲料，2010．
［3］顾振新，陈志刚，岳建华，汪志君．发芽糙米制备工艺研究
［J ］．食品工业科技，2004，25（1）：70－72．
［4］马晓博，张晖．利用米糠谷氨酸脱羧酶富集γ－氨基丁酸的
新研究［J ］．粮食与饲料工业，2007（10）：21－22．［5］Suk －Heung －Oh ，Yeon －Jong －Moon ，Chan －Ho －Oh．
Gamma －Aminobutyric Acid （GABA ）Content of Selected Un-cooked Foods ［J ］．Nutraceuticals and Food ，2003，8（1）：75－78．
［6］穆小民，吴显荣．氨基酸杂志［J ］．1994，4：44－47．［7］许建军，江波，许时婴．γ－氨基丁酸（GABA ）—种新型
的功能食品因子［J ］．食品工业科技，2003，11（24）：109－111．
［8］刘丽萍，刘丽华．米曲霉研究进展与应用［J ］．中国调味
品，2008（4）：28－32．
［9］周其洋，陶文沂．米曲霉多酶系优良菌株的诱变选育［J ］．
34（9）：57－60．中国调味品，2009，
［10］陈颖，沈艳，姚惠源．米糠γ－氨基丁酸富集工艺的研究
［J ］．粮食与饲料工业，2005，（4）：5－75．
处理
Glu （g ）
CaCl 2（g ）053
tween －80（mL ）055
mg /100g
无组分添加正交优化处理最佳单因素组合
055
16. 0192. 7685. 32
3结论
在利用米曲霉发酵米糠中添加Glu ，tween －
80，CaCl 2能富集GABA ，固态发酵产生的GABA 含量大于液态发酵产生的GABA 含量。利用正交分析可以看出，固态发酵时：Glu 、CaCl 2、tween －80添加量分别为5g 、5g 、4mL 时GABA 达到最高产量142. 04mg /100g；液态发酵时：Glu 、Cacl 2、tween －80添加量分别为5g 、5g 、5mL 时GABA 达到最高产量92. 76mg /100g，均达到了富檴檴檴檴檴檴檴檴檴檴檴檴檴檴檴檴檴檴檴檴檴檴檴檴檴檴檴檴殜
集γ－氨基丁酸的目的。
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行业组织品牌展览
第十八届中国国际食品添加剂和配料展览会（FIC 2014）暨第二十四届全国食品添加剂生产应用技术展示会
Food Ingredients China 2014（FIC2014）
展出时间：2014年3月25日27日展出地点：上海世博展览馆
上海市浦东博成路850号
中国食品添加剂和配料协会中国国际贸易促进委员会轻工行业分会
《中国食品添加剂》杂志社
网址：www. fi －c. com 或www. ChinaFoodAdditives. com
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