凯氏定氮实验的原理与操作方法
测定原理
待测天然含氮有机物与浓硫酸共热时，被氧化成为二氧化碳和水，而氮转变成氨，氨再与硫酸结合生成硫酸铵。为了加速有机物质的分解反应，在消化时常加入促进剂，硫酸铜可用作催化剂，硫酸钾或硫酸钠可提高消化液的沸点，氧化剂如过氧化氢也能加速反应。 操作方法
样品处理 测定某一固体样品中蛋白质的含量都是按100克物质的干重中所含蛋白质的克数来表示。因此在定氮前应先将固体样品中的水分除去。步骤：先将样品磨细，在已称重的称量瓶中称入一定量样品，然后置105度（100度无法除去非游离水）的烘箱内干燥2小时后称重，以后每1小时再称重，直至2次称重数不变为止。
若样品属于液体物质，可取一定体积经适当稀释后，取一定量进行消化。
消化
根据样品量的多少选择适宜的凯氏烧瓶4个（此处以50毫升为例），其中2个为对照。向烧瓶内加入准确称量的样品，注意要把样品加至烧瓶底部，切勿沾在瓶口及瓶颈上。另外2个作空白对照，好对样品进行校正。
在每个烧瓶中加入约300毫克硫酸钾-硫酸铜混合物（硫酸钾：五水硫酸铜=3：1、6：1或10：1均可），再用量筒加入3毫升浓硫酸。将上述4个凯氏烧瓶放在通风良好处（最好在通风橱中进行）加热消化。先用小火加热至沸腾。此时会产生大量泡沫，应特别注意不能让黑色物质上升到烧瓶颈部，否则将严重影响分析结果。当混合物停止冒泡，蒸汽与二氧化硫也均匀地放出时，将火焰调节到保持瓶内液体微微沸腾。假若发现瓶颈上有黑色颗粒，应小心地将烧瓶倾斜振摇，用消化液将其洗下。在消化过程中要时常转动烧瓶，使全部样品都浸在消化液中。当消化液呈清澈淡蓝色时即告消化结束。时间一般在5~6小时！若样品中含
赖氨酸或组氨酸较多时，消化时间需要延长1~2倍。因为这两种氨基酸中的氮在短时间内不易消化完全。
蒸馏
采用改良式凯氏定氮仪。
1、洗涤蒸馏仪：用硼酸指示剂（取100毫升2%硼酸溶液，滴加混合指示剂约1毫升，摇匀后呈紫红色即可；混合指示剂：50毫升0.1%甲烯蓝乙醇+200毫升0.1%甲基红乙醇，存于棕色瓶中）检测是否清洗干净。干净标准：指示剂不变色。
2、样品和空白的蒸馏：取2毫升稀释消化液至加样口加入反应室，关闭加样口，另取1个装硼酸指示剂的三角瓶接于冷凝管下端。取30%氢氧化钠（W/W）溶液约10毫升，从加样口缓慢加入，当未加完时关闭，并加入约3毫升蒸馏水，再继续缓慢加入一半后关闭，让剩下的水作液封。将加热器重新放在蒸汽发生器下加热（注：在清洗仪器完毕后应拿走加热器），待三角瓶中液体由紫红变成鲜绿色起开始计时，蒸馏5分钟，然后移动三角瓶使液面离开冷凝管口约1厘米，并用少量蒸馏水洗涤冷凝管口外周，继续蒸馏1分钟。空白同样。
3、清洗仪器：同上，不必用指示剂。
滴定
用0.0100mol/L标准盐酸（要标定，费时）滴定三角瓶中收集的氨，直至硼酸指示剂由绿变紫红。
注意：蒸馏时试验室环境中切忌有碱性雾气，否则要影响分析精度。
凯式定氮法：
凝胶层析法(凝胶过滤)脱盐和分离蛋白质
原理
凡盐析所获得的粗制蛋白质（盐析得到的IgG）中均含有硫酸铵等盐类，这类将影响以后的纯化，所以纯化前均应除去，此过程称为―脱盐‖（desalthing）。脱盐常用透析法和凝胶过滤法，这两种方法各有利弊。前者的优点是透析后析品终体积较小，但所需时间较长，且盐不易除尽；凝胶过滤法则能将盐除尽，所需时间也短，但其凝胶过滤后样品体积较大。所以，要根据具体情况选择使用。凝胶达滤后样品体积不会太增加，所以选用凝胶过滤法。
凝胶过滤（gel filtration），又称为凝胶层析（gel chromatography）、分子筛过滤（molecularsieve filtration）、凝胶渗透层析（gel osmotic chromatography）等。它是20世纪60年代发展起来的一种层析技术。其基本原理是利用被分离物质分子大小不同及固定相（凝胶）具有分子筛的特点，将被分离物质各成分按分子大小分开，达到分离的方法。
凝胶是由胶体粒子构成的立体网状结构。网眼里吸满水后凝胶膨胀呈柔软而富于弹性的半固体状态。人工合成的凝胶网眼较均匀地分布在凝胶颗粒上有如筛眼，小于筛眼的物质分子均可通过，大于筛眼的物质分子则不能，故称为―分子筛‖。凝胶之所以能将不同分子的物质分开是因为当被分离物质的各成分通过凝胶时，小于筛眼的分子将完全渗入凝胶网眼，并随着流动相的移动沿凝胶网眼孔道移动，从一个颗粒的网眼流出，又进入另一颗粒的网眼，如此连续下去，直到流过整个凝胶柱为止，因而流程长、阻力大、流速慢；大于筛眼的分子则完全被筛眼排阻而不能进入凝胶网眼，只能随流动相沿凝胶颗粒的间隙流动，其流程短、阻力小、流速快，比小分子先流出层析柱；小分子最后流出。分子大小介于完全排阻不能进入或完全渗入凝胶筛眼之间的物质分子，则居中流出。这样被分离物质即被按分子的大小分开。
用于凝胶层析的凝胶均为人工合成的产品，主要有交联葡聚糖（商品名为Sephadex）、琼脂糖（商品名为Sepharose）、聚丙烯酰胺凝胶（商品名为Bio–gel）及具有一定网眼的细玻璃珠等和这些凝胶的衍生物。
下面主要介绍葡聚糖凝胶，这是由葡萄糖的多聚物与1–氯– 2、3–环氧丙烷交连而成。环氧丙烷引入丙三醇基将链状的多聚葡萄糖单位交联起来，凝胶网眼的大小由多聚葡萄糖的分子和环氧丙烷的比例（交联度）来控制。
葡聚糖具有较强的亲水性，在水和电解质溶液中膨胀成为柔软而富于弹性的凝胶，其吸水能力与葡聚糖凝胶的交联度有密切关系。交联度大的，孔径小，吸水少，膨胀的程度小；交联度小的，孔径大，吸水多，膨胀的程度大。因此，葡聚糖凝胶孔径的大小可以其吸水量的大小来表示，常以G–10至G–200号码标记。G后面的数字是其吸水量（毫升水/克干胶）乘以10所得的值。如G–25即表示吸水量为2.5ml/2干胶。市售有G–10、G–5、G–50、G–
75、G–100、G–150、G–200等型号。G–75以上的胶因吸水量大，膨胀后形态柔软易变，统称为软胶。G–75以下的称为硬胶。
葡聚糖凝胶可分离的分子大小从几百到数十万。可根据被分离物质的分子大小及目的选择使用。一般说Sephadex G–l0～15通常用于分离肽及―脱盐‖。Sephadex G–75～200用以分离各类蛋白质。
凝胶层析是一种物理分离法。葡聚糖凝胶基本上不带电荷呈多惰性，不与被分离物质发生反应，所以分离的效果较好。然而由于它是葡萄糖的聚合物，因而仍有少量活性羟基，能吸附少量蛋白质等被分离的物质。为了克服这个缺点，一般使用含有离子强度达0.08的NaCl等中性盐缓冲液作洗脱液。
操作方法
（1）取层析柱1支（1.5cm×20cm），垂直固定在支架上，关闭下端出口。将已经溶胀好的Sephadex G-25中的水倾倒出去，加入2倍体积的0.0175mol/L，pH6.7磷酸盐缓冲液，
并搅拌成悬浮液，然后灌注入柱，打开柱的下端出口，继续加入搅匀的Sephadex G-25，使凝胶自然沉降高度到17cm左右，关闭出口。待凝胶柱形成后，在洗脱瓶中加入0.0175mol/L，pH6.7磷酸盐缓冲液以3倍柱体积的磷酸盐缓冲流过凝胶柱，以平衡凝胶。
（2）凝胶平衡后，用皮头滴管除去凝胶柱面的溶液，将盐析所得全部IgG样品加到凝胶柱表面，打开柱下口，控制流速让IgG样品溶液慢慢浸入凝胶内。凝胶柱面上加一层的0.0175mol/L，pH6.7磷酸盐缓冲液，并用此缓冲液洗脱，控制流速为0.5ml/min左右。用试管收集洗脱液，每管10滴。
3）在开始收集洗脱液的同时检查蛋白质是否已开始流出。为此，由每支收集管中取出1滴溶液置于黑色比色磁盘中，加入1滴20%磺基水杨酸，若呈现白色絮状沉淀即证明已有蛋白质出现，直到检查不出白色沉淀时，停止收集洗脱液。
（4）由经检查含有蛋白质的每管中，取1滴溶液，放置在白色比色盘孔中，加入1滴奈氏试剂，若呈现棕黄色沉淀说明它含有硫酸铵。合并检查后不含硫酸铵的各管收集液，即为―脱盐‖后的IgG。
注意：在检测时，用皮头滴管吸取管中溶液后应及时洗净，再吸取下一管，以免造成相互污染假象。
试剂和器材
（1）Sephadex G-25。
（2）0.0175mol/L，pH6.7磷酸盐缓冲液。
（3）奈氏（Nessler）试剂：于500ml锥形瓶内加入碘化钾150g，碘110g，汞150g及蒸馏水100ml。用力振荡7～15min，至碘的棕色开始转变时，混合液温度升高，将此瓶浸于冷水内继续振荡，直到棕色的碘转变为带绿色的碘化钾汞液为止。将上清液倾入2000ml量筒内，加蒸馏水至2000ml，混匀备用。
（4）20%（W/V）磺基水杨酸溶液。
（5）1.5cm×20cm层析柱。
（6）黑、白比色磁盘。
附：凝胶处理的基本操作
（1）凝胶溶胀（水化）商品葡聚糖凝胶和聚丙烯酰胺凝胶均为干燥颗粒。使用前必须水化溶胀。商品琼脂糖凝胶呈悬浮胶体可直接用，玻璃球不用溶胀。
凝胶溶胀有两种方法：一种是将所需葡聚糖凝胶浸入蒸馏水中于室温下溶胀；另一种是置于沸水浴中溶胀。各种葡聚糖在上述溶胀方法中所需的时间见下表：
必须浸泡足够的时间以使凝胶充分溶胀。两种方法中，沸水浴溶胀不但节省时间，还可以杀灭凝胶中污染的细菌并排出网眼中气体。
凝胶溶胀后，需用蒸馏水洗涤几次，每次应将沉降缓慢的细小颗粒随水倾倒出去，以免在装柱后产生阻塞现象，降低流速。洗后将凝胶浸泡在洗脱液中待用。
一支层析柱中应该装入的干胶量可以用下法推算：称取1g所需型号的葡聚糖干胶，放在5ml量筒中，用室温溶胀的方法充分溶胀，观察溶胀后凝胶的体积。然后在层析柱中加水到
所需柱床高度，将水倒出，量取柱床体积。根据1g干胶溶胀后的体积和所需柱床体积，即可推算出干胶的需要量。
（2）装柱将层析剂装入柱中进行层析的方法称柱层析法。作层析用的柱子称层析柱。层析柱有玻璃和透明塑料的两种。柱子的一端为进口，另一端为出口，出口端底部有烧结玻璃砂板或尼龙布，能阻止层析剂流出，溶剂则可流过。如果没有市售的层析柱，可以选用粗细均匀，长短合适的玻璃管，在两端塞上合适的胶塞，胶塞中插人细玻璃管，在一端放一层尼龙布为出口，即可作为层析柱使用。层析柱的长短粗细根据实验的目的而定，一般说来，凝胶层析时柱越长，分离效果越好。但柱过长，层析时间长，样品易稀释造成扩散，反而影响分离效果。柱的内径不宜较细，直径1cm以下的柱易发生―管壁效应‖，即柱中部分的物质组分移动较快，管壁周围的则移动较慢，造成分离混乱。当然柱的内径也不宜过粗。
凝胶层析中，在把小分子物质（mw
装柱的操作过程如下：将层析柱垂直固定在支架上，打开柱下口开关。将溶胀好的凝胶放在烧杯中，使凝胶表面上的水层与凝胶体积相等。用玻璃棒搅匀凝胶液，顺玻璃棒灌入柱内。此时柱下口一边排水，上口一边加入搅匀的凝胶，可见凝胶连续均匀地沉降，逐步形成凝胶柱。当到达所需凝胶柱高度时，立即关闭下口，待凝胶自然沉降形成凝胶柱床。凝胶柱床一般应离柱顶3~5cm，并覆盖一层溶液。
灌注凝胶时要求将均匀的凝胶一直加到所需柱床高度，不能时断时续，否则将出现分层或―纹路‖等毛病。若中途出现这些现象，可以用玻璃棒将已形成的柱床逐步搅起，直至出毛病的部分再让凝胶重新沉降或继续加入搅匀的凝胶悬液。若在灌好胶后才发现―纹路‖、分层等现象时，要重新装柱，以免影响层析效果。在做大型的凝胶柱时，灌注的凝胶是否均匀往往从
表面上看不出来。所以使用前应该用一些带色的大分子物质如细胞色素C、血红蛋白或专用的蓝色葡聚糖–2 000 （Blue dextran–2 000）通过凝胶柱，观察形成的色斑带是否整齐，若斑带歪斜，应该重新装柱，直至达到要求。
刚从冰箱中取出的凝胶液，不能马上用来灌柱，应平衡至室温后再用，不然装好的凝胶会产生大量的气泡影响层析。
在整个灌注凝胶的过程及使用中，凝胶柱面上一定要覆盖着一层溶液，以免进入空气。若进空气再加入溶液时，凝胶柱中易形成气泡。
（3）平衡装好的凝胶柱，使用前应该用相当于柱床体积两倍或更多的洗脱液流过凝胶柱，以压实凝胶，称为平衡。
（4）上样将样品加入到凝胶柱中，准备层析的过程称上样。上样时，应该注意上样量的多少、样品的黏稠度及离子强度。这三个因素会影响到以后层析的效果。一般来说―脱盐‖层析时，上样体积可为柱体积的10%～25%；生物大分子的分级分离，约为柱体积的1%～5%。样品的黏稠度一般不宜大于洗脱液黏稠度的2倍以上，不然洗脱峰会变宽和歪斜。离子强度要达到0.08，以免产生特异性吸附。
上样操作：先打开层析柱的下口开关，放出凝胶柱面上的溶液，或用皮头吸管吸取，使液面与凝胶表面相平齐，但切忌液面低于凝胶表面。然后将样品加在凝胶表面，打开柱下口开关，控制流速，使样品慢慢渗入凝胶内。加样时注意勿将凝胶柱面冲起形成凹面，也不能沿管壁流下，以免样品沿柱壁与凝胶柱的间凝胶隙漏下。当慢慢渗入凝胶的样品液液面与凝胶柱面相平时，关闭下口，完成上样。然后在凝胶柱面上加一层（3～5cm）洗脱液，接上洗脱瓶准备洗脱。
（5）洗脱用规定的溶液流过样品，使分子量不同的样品逐步分开并先后由柱床流出的过程称为洗脱。所用溶液称洗脱液。洗脱液放在贮液瓶（洗脱瓶）中并与层析柱相通连。洗脱时只要打开层析柱下口开关，洗脱液即可流出。
洗脱过程中保持恒定的流速是柱层析获得良好分离效果的重要条件。因为凝胶层析的分离作用主要取决于分子扩散进入凝胶的机会，流速过快有些分子来不及在分子筛中分配而流出；过慢时已分离的分子会因扩散而混合。因而要保持适当的恒定流速。洗脱液的流速取决于它的静水压。静水压是指洗脱瓶中洗脱液的液面高出于层析柱出口产生的液体压力（或接触空气的两个液面间的高差），这个高度差越大，静水压越大，洗脱液的流速就越快。这个压力差可以调动，如提高洗脱瓶的位置或瓶中液面的增减；或者降低或提高层析柱出口的位置等，因此静水压又称操作压。
由于静水压越大，洗脱液的流速就越快。在固定洗脱瓶与出口位置的情况下，静水压会在洗脱过程中，随着洗脱瓶中溶液减少液面不断下降而减少，难以维持流速的恒定。为了解决这个问题，Marriotte首次将洗脱瓶加塞塞紧，塞中插入玻璃管，使玻管下口深入到洗脱液的底部，这样洗脱液的静水压便等于此玻管下口的液面高出层析柱出口液面的高度（因为当洗脱瓶液体流出时，瓶顶形成真空，空气只从玻璃管中进入，玻管下口即为接触空气点），因此只要溶液不低于玻璃管下口，玻璃管口以上溶液的增减将不影响静水压，从而自动保持了流速的恒定，此洗脱瓶称为恒压瓶，也叫马氏瓶。当然，当洗脱液减少至液面低于玻管的下口时，便会失去作用，但这时可用及时加入洗脱液来解决。
在凝胶层析中，不仅要保持静水压的恒定，还要保持适当的静水压。这是因为G–75以上的软胶胶体柔软易变形，对静水压仅有一定的承受能力，不同软胶的承受能力也不相同，静水压超过凝胶的承受能力时，最初流速会很快；其后随着静水压力过大将使软胶变形压紧，流速逐渐降低，最后甚至流不出。所以，保持恒定正确的静水压是凝胶层析时获得满意结果的必要条件。
脱盐一般使用的是G–25属于硬胶，硬胶不易变形，受静水压的影响较小，实验过程中的流速可用恒压瓶下口橡皮管上的螺旋夹控制在0.5ml/min左右，随着洗脱液的流出，样品逐步被分开。用试管收集洗脱液，按顺序每管收集2ml。
（6）检测 在收集的同时，检查蛋白质是否流出。于每管中取出1滴放在黑色比色板孔中（按编号顺序），再分别加入1滴20%磺酰水扬酸，如出现白色沉淀即表示蛋白质已流出凝胶柱，如此一直检查到蛋白质全流出为止。与此同时，再从蛋白质的管中取出1滴于白色比板中，加入奈氏试剂1滴，如蛋白管中不出现棕色，即表示蛋白质中的硫酸铵已除去。合并纯化后的蛋白质管以待用。以光密度值为纵坐标，以收集管的顺序号为横坐标，在坐标纸上绘图。可获具有一条洗脱峰的曲线，称为洗脱曲线，用以表示被分离物质流出的状态。
（7）凝胶的洗涤及保存由于凝胶对被分离的物质基本无吸附作用，所以无需―再生‖，只要用洗脱液冲洗后即可连续使用。但因多次使用凝胶颗粒将逐渐沉积压紧，流速将减慢，所以使用一段时间后应倒出来，清洗后重新装柱。
凝胶暂时不使用可浸泡在溶液中，存放在4℃冰箱中。若放在室温保存应加入0.02%叠氮钠（NaN3）或0.01%乙酸汞等防腐剂，以防发霉。用时以水洗去防腐剂即可使用。凝胶长期不用，可用水洗净，分次加入百分浓度递增的乙醇溶液，每次停留一段时间，使之平衡，再换一下浓度的乙醇，让凝胶逐步脱水，再用乙醚除乙醇，抽干即可，或将凝胶洗净后抽干，在表面皿上30℃逐步烘干
蛋白质纯化(protein purification)实用技术
研究的最后还是要看基因表达产物,无论是用于检测还是用于棉衣保护,都需要将表达出的蛋白质分离和纯化,然而蛋白质性质各异,故纯化方法不同,现共享一些基本的纯化方法,以飨读者:
蛋白质的一级、二级、三级和四级结构决定了它的物理、化学、生物化学、物理化学和生物学性质，综述了不同蛋白质之间的性质存在差异或者改变条件是使之具有差异，利用一种同时多种性质差异，在兼顾收率和纯度的情况下，选择蛋白质提纯的方法。
蛋白质在组织或细胞中一般都是以复杂的混合物形式存在，每种类型的细胞都含有成千种不同的蛋白质。蛋白质的分离和提纯工作是一项艰巨而繁重的任务，到目前为止，还没有一个
单独的或一套现成的方法能把任何一种蛋白质从复杂的混合物中提取出来，但对任何一种蛋白质都有可能选择一套适当的分离提纯程序来获取高纯度的制品。
蛋白质提纯的总目标是设法增加制品纯度或比活性，对纯化的要求是以合理的效率、速度、收率和纯度，将需要蛋白质从细胞的全部其他成分特别是不想要的杂蛋白中分离出来，同时仍保留有这种多肽的生物学活性和化学完整性。
能从成千上万种蛋白质混合物中纯化出一种蛋白质的原因，是不同的蛋白质在它们的许多物理、化学、物理化学和生物学性质有着极大的不同，这些性质是由于蛋白质的氨基酸的序列和数目不同造成的，连接在多肽主链上氨基酸残基可是荷正电的、荷负电的、极性的或非极性的、亲水的或疏水的，此外多肽可折叠成非常确定的二级结构（α螺旋、β折叠和各种转角）、三级结构和四级结构，形成独特的大小、形状和残基在蛋白质表面的分布状况，利用待分离的蛋白质与其它蛋白质之间在性质的差异，即能设计出一组合理的分级分离步骤。 可依据蛋白质不同性质与之相对应的方法将蛋白质混合物分离：
1．分子大小
不同种类的蛋白质在分子大小方面有一定的差别，可用一些简便的方法，使蛋白质混合物得到初步分离。
1．1透析和超滤
透析在纯化中极为常用，可除去盐类（脱盐及置换缓冲液）、有机溶剂、低分子量的抑制剂等。透析膜的截留分子量为5000左右，如分子量小于 10000的酶液就有泄露的危险，在纯化中极为常用，可除去盐类、有机溶剂、低分子量的抑制剂等。超滤一般用于浓缩和脱色
1．2离心分离置换缓冲液
许多酶富集于某一细胞器内，匀浆后离心得得到某一亚细胞成分，使酶富集10~20倍，再对特定的酶进行纯化。差速离心，分辨率较低，仅适用于粗提或浓缩。速率区带法，如离心
时间太长所有的物质都会沉淀下来，故需选择最佳分离时间，可得到相当纯的亚细胞成分用于进一步纯化，避免了差速离心中大小组分一起沉淀的问题，但容量较小，只能用于少量制备。等密度梯度离心常用的离主介质有蔗糖、聚蔗糖、氯化铯、溴化钾、碘化钠等等
1．3凝胶过滤
这是根据分子大小分离蛋白质混合物最有效的方法之一，注意使要离的蛋白质分子量落在凝胶的工作范围内。选择不同的分子量凝胶可用于脱盐、置换缓冲液及利用分子量的差异除去热源。
2．形状
蛋白质在离心通过溶液运动时，或通过膜、凝胶过滤填料颗粒或电泳凝胶中的小孔运动时，都会受到形状的影响：对两种相同质量的蛋白质而言，球状蛋白质具有较小的有效半径（斯托克半径），通过溶液沉降时遇到的摩擦力小，沉降较快而显得比其它形状的蛋白质大；反之，在体积排阻色谱时，斯托克半径较小的球状蛋白质更容易扩散进入凝胶过滤填料颗粒内部，较迟洗脱出来，因而显得比其它形状的蛋白质要小。
3．溶解度
利用蛋白质的溶解度的差别来分别各种蛋白质常用的方法。影响蛋白质溶解度的外界因素很多，其中主要有：溶液的pH、离子强度、介电常数和温度，但在同一的特定外界条件下，不同的蛋白质具有不同的溶解度。适当改变外界条件，控制蛋白质混合物中某一成分的溶解度
3．1pH控制和等电点沉淀
蛋白质在其等电点一般较不易溶解。
3．2蛋白质的盐溶和盐析
3．3有机溶剂分级法
蛋白质在不同的溶剂中的溶解度有很大不同，从基本不溶（＜10μg/ml）直至极易溶解（＞300mg/ml）不等。影响蛋白质溶解度的可变因素包括温度、pH、溶剂的极性、离子性质和离子强度。引起蛋白质沉淀的有机溶剂的浓度不同，故控制有机溶剂的浓度可分离蛋白质。 水溶性非离子聚合物如聚乙二醇也能引起蛋白质的沉淀。
3．4温度
不同的蛋白质在不同的温度具有不同的溶解度和活性。大多数蛋白质在低温下比较稳定，故分离操作一般在0℃或更低温度下进行。
4．电荷
蛋白质净电荷取决于氨基酸残基所带的正负电荷的总和，如中性溶液中带净负电荷则称为酸性蛋白质，
4．1电泳
不仅是分离蛋白质混合物和鉴定蛋白质纯度的重要手段，而且也是研究蛋白质性质很有用的方法。
等电聚焦分辨率很高，pI有0.02pH的差异就能分开。
2D-PAGE分离蛋白质分辨率已经发展到100000个蛋白点。
4．2离子交换层析
改变蛋白质混合物溶液中的盐离子强度、pH和（阴、阳）离子交换填料，不同蛋白质对不同的离子交换填料的吸附容量不同，蛋白质因吸附容量不同或不被吸附而分离。
洗脱可采用保持洗脱剂成分一直不变，也可采用改变洗脱剂的盐度或pH的方法洗脱，后一种可分分段洗脱和梯度洗脱。梯度洗脱一般效果好，分辨率高，特别是使用交换容量小，对
盐浓度敏感的离子交换剂，多用梯度洗脱。控制洗脱剂的体积（与柱床体体积相比）、盐浓度和pH，样品组分能从离子交换柱上分别洗脱下来。
蛋白分子暴露在外表面的侧链基团的种类和数量不同，故在一定的PH值和离子强度的缓冲液的所带的电荷不同
5．电荷分布
电荷的氨基酸残基可均匀地分布于蛋白质的表面，既可以适当的强度与阳离子交换柱结合也能以适当强度与阴离子结合，因多数蛋白质都有不能在单一的溶剂条件下同时与两种类型的离子交换柱结合，故可得用此性质纯化；电荷的氨基酸残基亦可成簇分布，使某一区域带强正电荷而另一区域带强负电荷，呈强酸性或强碱性，只能在极端pH与阳离子交换树脂或阴离子交换树脂结合，如钙调蛋白只能在pH2时与阳离子交换树脂结合。
6．疏水性
多数疏水性的氨基酸残基藏在蛋白质的内部，但也有一些在表面。蛋白质表面的疏水性氨基酸残基的数目和空间分布决定了该蛋白质是否具有与疏水柱填料结合从而利用它来进行分离的能力。
因其廉价和纯化后的蛋白质具有生物活性，是一种通用性的分离和纯化蛋白质的工具。高浓度盐水溶液中蛋白质在柱上保留，在低盐或水溶液中蛋白质从柱上被洗脱，故特别适用于浓硫酸铵溶液沉淀分离后的母液以及该沉淀用盐溶解后的含有目标产品的溶液直接进样到柱上，当然也适用7mol/盐酸胍或8mol/L 脲的大肠杆菌的治疗蛋白质提取液直接进样到柱上，在分离的同时也进行了复性。
7．密度
多数蛋白质的密度在1.3~1.4g/cm3之间，分级分离蛋白质时一般不常用此性质，不过对含有大量磷酸盐或脂质的蛋白质与一般蛋白质在密度上明显不同，可用密度梯度法离心与大部分蛋白质分离。
8．基因工程构建的纯化标记
通过改变cDNA在被表达的蛋白的氨基端或羧基端加入少许几个额外氨基酸，这个加入的标记可用来作为一个有效的纯化依据。
8．1GST融合载体
使要表达的蛋白质和谷胱甘肽S转移酶一起表达，然后利用Glutathione Sepharose 4B作亲和纯化，再利用凝血酶或因子Xa切开。
8．2蛋白A融合载体
使要表达的蛋白和蛋白A的IgG结合部位融合在一起表达，以IgG Sepharose纯化。
8．3含组氨酸标记（Histidine-tagged）Chelating Sepharose
最通行的标记之一，是在蛋白质的氨基端加上6~10个组氨酸，在一般或变性条件（如8M尿素）下借助它能与Ni2+螯合柱紧紧结合的能力，用咪唑洗脱，或将pH降至5.9使组氨酸充分质子化，不再与结合Ni2+使之得以纯化。
重组蛋白在设计、构建时已融入纯化构想。样品多夹杂了破碎细胞或可溶产物，扩张床吸附技术STREAmlINE适合做粗分离。
9．亲和能力
结合效率高，分离速度快的特点。配基可是酶的底物、抑制剂、辅因子、特异性的抗体、 吸附后可改变缓冲液的离子强度和PH的方法，洗耳恭听脱下来，也可用更高浓度的同一配体溶液或亲和力更强的配体溶液洗脱
亲和层析固定相的配基与生物分子之间的特殊的生物大分子亲和能力不同来进行相互分离的，依亲和选择性的高低分为：基团性亲和层析，固定相上的配基对一类基团的极强的亲和力。如含有糖基的一类蛋白质或糖蛋白对三嗪染料显示特别强的吸附能力；高选择性（专一
性）亲和层析，配基仅对某一种蛋白质有特别强的亲和性。如单克隆抗体对抗原的特异性的吸附。
亲和层析除特异性的吸附外，仍然会因分子的错误认别和分子间非选择性的作用力而吸附一些杂蛋白质，另洗脱过程中的配体不可避免的脱落进入分离体系。
与超滤结合起来，将两者优点集中形成超滤亲和纯化，具有高分离效率和大规模工业化的优点，适用于初分离。
按配基的不同可分为：
（1）金属螯合介质
过渡金属离子Cu、Zn和Ni 2＋2＋2＋等以亚胺络合物的形式键合到因定相上，由于这些金属离子与色氨酸、组氨酸和半胱氨酸之间形成了配价键，从而形成了亚胺金属—蛋白螯合物，使含有这些氨基酸的蛋白被这种金属螯合亲和色谱的固定相吸附。螯合物的稳定性受单个组氨酸和半胱氨酸解离常数所控制，从而亦受流动相的pH和温度的影响，控制条件可以使不同蛋白质相互分离。
（2）小配体亲和介质
配体有精氨酸、苯甲酰胺、钙调因子、明胶、肝素和赖氨酸等等。
（3）抗体亲和介质
即免疫亲和层析，配体有重组蛋白A和重组蛋白G，但蛋白A比蛋白G专一，蛋白G能结合更多不同源的IgG。
（4）颜料亲和介质
染料层析的效果除主要取决于染料配基与酶的亲和力大小外，还与洗脱缓冲液的种类、离子强度、PH值及待分离的样品的纯度有关。配体有 Cibacron Blue和Procion Red两种。
在一定的条件下，固定化的染料能起阳离子交换剂的作用，为了避免此现象的发生，最好要离子强度小于0。1和PH大于7时操作。
（5）外源凝集素亲和介质
配体有刀豆球蛋白、扁豆外源凝集素和麦芽外源凝集素，固相外源凝集素能和数种糖类残基发生可逆反应，适合纯化多糖、糖蛋白。
10．非极性基团之间作用力
溶质分子中的非极性基团与非极性固定相间的相互作用力（非选择性分散力或伦敦力）大小与溶质分子极性基团与流动力相中极性分子在相反方向上相互作用力的差异进行分离。因其流动相中的置换剂是极性小于水的有机溶剂（如甲醇、乙腈、四氢呋喃等），这些有机溶剂可能使许多蛋白质分子产生不可逆的变性；流动相中须有离子对试剂（如三氟乙酸、甲酸、磷酸等）存在才可使分离有效地进行和获得高的质量回收率；分离须在酸性介质中进行（一般pH在2~3之间），又有一些蛋白质会在后两种条件下产生不可逆的分子构象变化，故在生物大分子中人分离纯化中受到限制，但分子构象变化可逆的蛋白质而言是有效的方法。 正相色谱在生物大分子中的分离和纯化中应用相对较少，因所用的溶剂很贵。
11．可逆性缔合
在某些溶液条件下，有一些酶能聚合成二聚体、四聚体等，而在另一种条件下则形成单体，如相继在这两种不同的条件下按大小就可以进行分级分离。
12．稳定性
12．1热稳定性
大多数蛋白质加热到95℃时会解折叠或沉淀，利用这一性质，可容易地将一种经这样加热后仍保持其可溶性活性的蛋白质从大部分其它细胞蛋白质中分离开。
12．2蛋白酶解稳定性
用蛋白酶处理上清液，消化杂蛋白，留下抗蛋白酶解抗性蛋白质。
13．分配系数
即利用双水相萃取分离，常用的生物物质分离体系有：聚乙二醇（PEG）/葡聚糖（DEXTRAN）、PEG/磷酸盐、PEG/硫酸铵等。由于具有含水比例高、选用的聚合物及盐对酶无毒性、分离设备与化学工业通用等优点，在工业上目益受重视。
分配行为受聚合物分子大小、成相浓度、PH、无机盐种类等因素影响，
发展：具有亲和双水相萃取及膜分离双水相萃取等新型双水相分离技术。
双向水溶液系统的蛋白质纯化
一些与水混合多聚物的不相溶性导致依赖于多聚物浓度的两相系统的液-液分配技术，可以由两不同的高水溶性的多聚物或一种多聚物各一种盐，用于从微生物匀浆中除支细胞碎片、后续分配步骤进一步纯化。分离的选择性一般随着分离分子或颗粒大小面增加。
14．表面活性
14．1泡沫分离
蛋白质溶液具有表面活性，气体在溶液中鼓泡，气泡与液相主体分离，在塔顶富集，达到分离和浓缩的目的。
14．2反胶团相转移法
反胶团相转移法是80年代兴起的一种新型分离技术，它利用表面活性剂分子在有机溶剂中自发形成的反向胶团（反胶团），在一定条件下将水溶性蛋白质分子增溶进反胶团的极性核（水池）中，再创造条件将蛋白质抽提至另一水相，实现蛋白质的相转移，达到分离和提纯蛋白质的目的。反胶团中的蛋白质分子受到周围水分子和表面活性剂极性头的保护，仍保持一定的活性，甚至表现出超活性。由于蛋白质增溶于反胶团与蛋白质所带电荷及反胶团内表面电荷间的静电作用及反胶团的大小有关，因而表面活性剂的种类、水溶液的pH值及离子
强度等因素均影响反胶团对蛋白质的相转移。据报道利用AOT/异辛烷反胶团对酵母脂肪酶进行相转移。
14．3聚合物-盐-水液-固苯取体系是90年代在国内开发的种新的萃取体系，成功地用于萃取金属离子及卞果酸脱氢酶等生物活性物质较强的吸附及乳化作用等缺陷，成相容易成相后直接倾出液相即可使液固的相分离，勿需特殊技术处理，不用有机溶剂，无毒性，成相聚合物及盐对生物活性物质有稳定和保护作用，萃取分离选择性好消耗低、易于规模放大的分离生队物活件物质的新技术在聚乙二醇修饰物的聚乙二醇/葡聚糖双水相萃取体系共价作用：主要用于含巯基酶的纯化，通过共价键结合在层析介质上，偶联是可逆的，能还原二硫键的低分子化合物洗脱，如空间位阻，可在含变性剂的缓冲液时吸附，如已含二硫键，则先用还原剂打开。
蛋白质分离纯化的一般程序
一）材料的预处理及细胞破碎
分离提纯某一种蛋白质时，首先要把蛋白质从组织或细胞中释放出来并保持原来的天然状态，不丧失活性。所以要采用适当的方法将组织和细胞破碎。常用的破碎组织细胞的方法有：
1.机械破碎法
这种方法是利用机械力的剪切作用，使细胞破碎。常用设备有，高速组织捣碎机、匀浆器、研钵等。
2.渗透破碎法
这种方法是在低渗条件使细胞溶胀而破碎。
3.反复冻融法
生物组织经冻结后，细胞内液结冰膨胀而使细胞胀破。这种方法简单方便，但要注意那些对温度变化敏感的蛋白质不宜采用此法。
4.超声波法
使用超声波震荡器使细胞膜上所受张力不均而使细胞破碎。
5.酶法
如用溶菌酶破坏微生物细胞等。
(二)蛋白质的抽提
通常选择适当的缓冲液溶剂把蛋白质提取出来。抽提所用缓冲液的pH、离子强度、组成成分等条件的选择应根据欲制备的蛋白质的性质而定。如膜蛋白的抽提，抽提缓冲液中一般要加入表面活性剂（十二烷基磺酸钠、tritonX-100 等），使膜结构破坏，利于蛋白质与膜分离。在抽提过程中，应注意温度，避免剧烈搅拌等，以防止蛋白质的变性。
（三）蛋白质粗制品的获得
选用适当的方法将所要的蛋白质与其它杂蛋白分离开来。比较方便的有效方法是根据蛋白质溶解度的差异进行的分离。常用的有下列几种方法：
1.等电点沉淀法
不同蛋白质的等电点不同，可用等电点沉淀法使它们相互分离。
2.盐析法
不同蛋白质盐析所需要的盐饱和度不同，所以可通过调节盐浓度将目的蛋白沉淀析出。被盐析沉淀下来的蛋白质仍保持其天然性质，并能再度溶解而不变性。
3.有机溶剂沉淀法
中性有机溶剂如乙醇、丙酮，它们的介电常数比水低。能使大多数球状蛋白质在水溶液中的溶解度降低，进而从溶液中沉淀出来，因此可用来沉淀蛋白质。此外，有机溶剂会破坏蛋白
质表面的水化层，促使蛋白质分子变得不稳定而析出。由于有机溶剂会使蛋白质变性，使用该法时，要注意在低温下操作，选择合适的有机溶剂浓度。
（四）样品的进一步分离纯化
用等电点沉淀法、盐析法所得到的蛋白质一般含有其他蛋白质杂质，须进一步分离提纯才能得到有一定纯度的样品。常用的纯化方法有：凝胶过滤层析、离子交换纤维素层析、亲和层析等等。
有时还需要这几种方法联合使用才能得到较高纯度的蛋白质样品。
下游纯化工艺简介
Downstream（下游）与上游相对的概念，一般而言，上游指基因克隆、细胞培养等目的产物表达工序，下游指从表达有目的产物的复杂的混合液中分离纯化得到符合要求的目的产物的一系列步骤。美、日、欧等发达国家生物技术产品工业化的实践证明：生物技术产品的产业化高度依赖于基因工程下游工序技术及设备的进步。
一、纯化工艺常用衔接技术：
1、盐析。常采用硫酸铵、硫酸钠盐析，获得的盐析沉淀物在低温冰箱(
2、等电点沉淀。根据蛋白质、多肽在等电点时溶解度最小的特点进行。
3、有机溶剂沉淀。采用冷的丙酮、乙醇沉淀蛋白质。例如人血浆蛋白的乙醇分级沉淀。
4、透析。根据目的蛋白质、多肽的分子量，选取适宜的透析袋进行透析，可以起到更换缓冲液以及去除一些低分子杂质的目的。
5、超滤。根据目的蛋白质、多肽的分子量，选取适宜截留分子量(MWcutoff)的超滤膜进行超滤。
6、真空冷冻干燥。利用在低温和高真空条件下，冰不经融化为液态水而直接升华为水蒸气的原理。可以很好地浓缩样品和保存蛋白质、多肽的生物活性。
7、变性沉淀。根据目的蛋白质、多肽对于温度或者酸碱性的耐受性，在较高的温度或者较极端的pH条件下处理样品，使杂质去除的方法。例如胸腺肽制备中使用的热变性(~80℃)去除杂蛋白。如果目的蛋白、多肽本身热稳定性、酸碱稳定性不高则不宜采用。
8、离心沉淀。利用离心沉降力将不溶性颗粒物与溶液分离的技术，常采用高速冷冻离心机进行。
9、脱盐。透析、超滤可用于进行脱盐，Sephadex G25、G50常用于蛋白质脱盐。
10、过滤
澄清过滤、除菌过滤（0.22微米膜过滤）、超滤（1000~300000道尔顿）
二、蛋白质、多肽液相色谱纯化方法简介
chromatography，色谱，层析
表1 常用的液相色谱纯化方法及其原理
1、纯化的一般目标和方法
首先，自然来源或者重组表达的蛋白质经过一些粗提的步骤（例如：匀浆、离心、硫酸铵沉淀等）成为稳定的可以用于色谱分离的样品。
然后进行捕获色谱（capture chromatography），主要目标是浓缩和去除大量的容易去除的杂质，此步最关心的是流速和载量，常采用高载量、快流速凝胶。
经过浓缩的部分纯化的样品进行中级色谱（intermediate chromatography），目的是去除较难去除的杂质，此步最关心的是分辨率，常采用高分辨率的细颗粒凝胶。
最后为了得到符合要求的最终产品，去除残存的杂质以及目的蛋白的多聚物或者降解片断，进行精制色谱（polishing chromatography），常采用具有高分辨率的凝胶过滤凝胶进行凝胶过滤色谱。
2、纯化前的准备工作
（1）样品稳定性试验
a、测定样品在pH 2-9的稳定性；
b、测定样品在0-4 mol/L NaCl及0-2 mol/L 硫酸铵中的稳定性；
c、测定样品在0-50%乙醇、甲醇中的稳定性；
d、测定样品在4-40℃的稳定性；
e、室温下静置过夜，测定对蛋白水解酶的稳定性。
2）样品预处理
a、去除样品中颗粒物（0.45-0.22微米膜过滤或者10000 g离心15分钟）
b、去除样品中脂类（10000 g离心15分钟或有机溶剂抽提）
c、去除样品中核酸（加入核酸酶消化或者使核酸沉淀）
d、抑制样品中蛋白水解酶（加入蛋白酶抑制剂、低温下快速第一步分离或在蛋白酶缺陷宿主中表达重组蛋白）
表 2 样品中有害杂质及去除办法
由于不同的色谱方法的原理不同，其对样品的要求也不相同，所以必须在进行色谱之前，根据特定色谱方法的要求对样品进行进一步的处理。如下表所示：
表3 不同色谱方法对于样品的要求
（3）样品的保存条件：
短期储存（小于24小时）
a、避免接近或超过样品的稳定极限防止蛋白质变性或沉淀
b、在密闭容器中冰箱冷藏
较长期储存（数天）
a、b、同上
c、加入适当的抑菌剂
长期储存
a、同上
b、冰冻或者最好冻干（真空冷冻干燥）保存。
3、对每一纯化步骤的评价相关方法的建立
a、目的蛋白含量测定
酶活性测定、生物活性测定、放射免疫、酶联免疫、免疫电泳、荧光。
b、总蛋白含量测定
紫外吸收法、Lowry法、Bradford染料结合法（考马斯亮兰G-250）等。
c、样品复杂度检测
HPLC（离子交换、凝胶过滤、反相）、SDS-PAGE、等电聚焦、毛细管电泳（CE）。
4、蛋白质的来源
（1）天然蛋白： 天然产物中的目的蛋白一般含量很少而且组分极复杂，在分离过程中须采用多个步骤才能去除各种杂质，并应在整个过程中降低蛋白水解酶的活性。
（2）重组蛋白： 重组蛋白则目标蛋白的丰度较高。重组蛋白主要有三种表达定位：
a、细胞质：在这种情况下，必须破坏细胞结构才能得到目的蛋白质，同时伴随着大量核酸和其它上千种宿主蛋白质的释放；在表达量较高的条件下，一般形成包涵体，包涵体含有过表达目的蛋白，且容易通过高速离心分离，但是包涵体的溶解与复性是较复杂的。
b、外周质： 表达的蛋白质存在于细菌内膜与外膜之间，这样目的蛋白可以较少地受到蛋白酶的作用并减少了宿主蛋白的污染。
c、分泌到培养基：这种表达一般蛋白质浓度较低，主要受到培养基中的污染。
表4 不同来源的蛋白质样品概述
三、常用液相色谱纯化方法
1、凝胶过滤（gel filtration，molecular sieve chromatography 分子筛、size exclusion chromatography 大小排阻色谱，gel permeation chromatography 凝胶渗入色谱）。 根据分子大小和形状进行分离的一种方法，分子量（Stroke半径）较大的先出峰，分子量小的后出峰。最常用的经典凝胶为Sephadex G系列，此外还有Sephacryl、Sepharose、Superose、Superdex等凝胶系列。凝胶过滤法方法简单、重现性强，目前广泛应用。 凝胶过滤具有很多不同分离范围的凝胶系列供选择。
要点: 采用细长（L/D~20）的柱、选择合适的凝胶、上样体积较小、流速较慢。 以下为常用凝胶过滤用凝胶及其基本参数
系列 名称 分离范围 颗粒大小 应用
Superdex prep grade系列 Superdex 30PG 小于10000 24~44微米 小肽
Superdex 75PG 3000~70000 24~44微米 一般蛋白
Superdex 200PG 10000~600000 24~44微米 单抗、大分子蛋白Superose系列 Superose 6 PG 5000~5000000 20-40微米 蛋白、多糖、核酸、病毒
Superose 12 PG 1000~300000 20-40微米 蛋白、多糖、核酸
Sephacryl HR系列 Sephacryl S-100 1000~10000 25-75微米 肽类、小蛋白
Sephacryl S-200 5000~250000 25-75微米 一般蛋白
Sephacryl S-300 10000~1500000 25-75微米 抗体等较大蛋白
Sephacryl S-400 ~28000000 25-75微米 多糖、蛋白多糖、脂质体
Sephacryl S-500 ~60000000 25-75微米
Sephacryl S-1000 ~100000000 40-105微米
Sepharose xB（CL-xB）系列 Sepharose 2B 70000~40000000 60-200微米 大分子复合物
Sepharose 4B 60000~20000000 45-165微米 病毒等大分子
Sepharose 6B 10000~4000000 45-165微米 大分子
Sephadex LH系列 Sephadex LH20 100-4000 30-100微米 天然产物
Sephadex LH60 400-20000 40-120微米 天然产物
Sephadex系列 Sephadex G-10 小于700 40-120
Sephadex G-15 小于1500 40-120
Sephadex G-25 coarse 1000-5000 100-300 脱盐及更换缓冲液用
Sephadex G-25 medium 1000-5000 50-150
Sephadex G-25 fine 1000-5000 20-80
Sephadex G-25 superfine 1000-5000 10-40
Sephadex G-50 coarse 1500-30000 100-300 小蛋白、多肽的分离
Sephadex G-50 medium 1500-30000 50-150
Sephadex G-50 fine 1500-30000 20-80
Sephadex G-50 superfine 1500-30000 10-40
Sephadex G-75 3000-80000 40-120 一般蛋白的分离
Sephadex G-75 superfine 3000-70000 10-40
Sephadex G-100 4000-150000 40-120 较大蛋白的分离
Sephadex G-100 superfine 4000-100000 10-40
Sephadex G-150 5000-300000 40-120 大蛋白的分离
Sephadex G-150 superfine 5000-150000 10-40
Sephadex G-200 5000-600000 40-120 大蛋白的分离
Sephadex G-200 superfine 5000-250000 10-40
2、离子交换色谱（ion exchange chromatography）
蛋白质、多肽均属于两性电解质，在缓冲液pH小于其等电点时，带净正电荷，而在缓冲液pH大于其等电点时，带净负电荷。阴离子交换凝胶本身带有正电荷基团，阳离子交换凝胶本身带负电荷基团。由于静电相互作用而使样品结合到凝胶上，再采用盐浓度梯度或者更换缓冲液的pH值进行洗脱
对于等电点小于5.0的酸性蛋白质，推荐使用阴离子交换，对于等电点大于7.0的碱性蛋白质，推荐使用阳离子交换。
两种模式：一种使目的蛋白结合凝胶，通过梯度洗脱；一种使目的蛋白不结合凝胶，而大部分杂质结合凝胶，则穿过液中含有目的蛋白。
column chromatography（柱色谱）
batch chromatography（批色谱）
c、疏水作用色谱
利用蛋白质、多肽在高盐存在下，可以结合疏水凝胶，而在盐浓度降低时又可以解脱的原理实现分离。
d、亲和色谱
利用蛋白质、多肽与某些配基的特异性相互作用而进行分离。例如：酶-底物，酶-抑制剂，糖蛋白-凝集素，抗原-抗体等。近来发展了金属螯合亲和色谱，用于纯化表面含色氨酸、酪氨酸、组氨酸等的蛋白质以及(His)6-tagged重组蛋白。
亲和色谱分为特异性亲和色谱和组别亲和色谱两类。肝素、凝集素、染料、金属螯合亲和色谱均为组别亲和色谱（同一配基可以结合许多种蛋白质）。
e、反相色谱
常用于蛋白质、多肽的HPLC分析，以及多肽的精细制备分离，分辨率极高，可以分离两种仅相差一个氨基酸的多肽。如血管紧张素（angiotensin）的几个亚型通过反相色谱可以很好地分离。
同一个样品在同一Source 30 RPC柱上进行分离，由于色谱条件进行了改变，色谱图截然不同，说明反相色谱具有高度的选择性。
四、应用举例
例一、一种抗HIV gp120单克隆抗体的Fab片断（E.coli中表达）
分子量：50 kD
等电点：11
表达定位：周质（periplasmic）
纯化策略：渗透压休克提取周质，阳离子交换去除大部分杂质，疏水作用色谱进一步去除杂质，最后用凝胶过滤分离。
例二、重组表达的α-淀粉酶
分子量：49.2 kD；等电点：~6
先采用阴离子交换，再进行疏水作用色谱，最后进行凝胶过滤。
例三、重组表达的乙型肝炎表面抗原的分离
1、史克公司：（酵母细胞表达）
破碎细胞，表面活性剂抽提，离心沉淀、超滤，再经凝胶过滤、阴离子交换，超速离心纯化，脱盐，除菌过滤，吸附，分装。
2、Merck公司：（酵母细胞表达）
破碎细胞，去碎片，抗原用多孔硅玻璃吸附，洗脱，凝胶过滤，甲醛处理，明矾吸附，疫苗。
3、巴斯德研究所：（CHO细胞表达）
培养上清液，离心去碎片，50%硫酸铵沉淀，离心，50%KBr处理，脱盐、超滤浓缩、Sepharose CL-4B凝胶柱分离。
4、Below，M.Bioseparation.1(1991).397工艺
破细胞，去碎片，加硫酸铵至一定浓度后，直接上Butyl-Sepharose 4 FF疏水柱，脱盐后上DEAE-Sepharose FF，超滤浓缩后上Sepharose 4 FF凝胶过滤柱.
例四、尖吻蝮蛇毒凝血酶样酶的分离
（注射用降纤酶）
分子量：38 kD；等电点：~5.4
原工艺：阴离子交换，凝胶过滤，第二次阴离子交换，凝胶过滤
达到95%以上纯度，产量6000-10000单位/克蛇毒。(两周)
新工艺：亲和色谱，阴离子交换，凝胶过滤，亲和色谱（一周）
纯度达到98.5%以上，产量达20000-25000单位/克蛇毒。
尖吻蝮蛇毒经过五个步骤的分离纯化后，获得了单成分降纤酶组分，电泳为一条带，HPLC为单峰。
如上所示，由于每一个步骤均会带来一定的损失，故在可能的情况下应尽量减少下游纯化的步骤（在保证达到所需纯度的前提下）。
凯氏定氮实验的原理与操作方法
测定原理
待测天然含氮有机物与浓硫酸共热时，被氧化成为二氧化碳和水，而氮转变成氨，氨再与硫酸结合生成硫酸铵。为了加速有机物质的分解反应，在消化时常加入促进剂，硫酸铜可用作催化剂，硫酸钾或硫酸钠可提高消化液的沸点，氧化剂如过氧化氢也能加速反应。 操作方法
样品处理 测定某一固体样品中蛋白质的含量都是按100克物质的干重中所含蛋白质的克数来表示。因此在定氮前应先将固体样品中的水分除去。步骤：先将样品磨细，在已称重的称量瓶中称入一定量样品，然后置105度（100度无法除去非游离水）的烘箱内干燥2小时后称重，以后每1小时再称重，直至2次称重数不变为止。
若样品属于液体物质，可取一定体积经适当稀释后，取一定量进行消化。
消化
根据样品量的多少选择适宜的凯氏烧瓶4个（此处以50毫升为例），其中2个为对照。向烧瓶内加入准确称量的样品，注意要把样品加至烧瓶底部，切勿沾在瓶口及瓶颈上。另外2个作空白对照，好对样品进行校正。
在每个烧瓶中加入约300毫克硫酸钾-硫酸铜混合物（硫酸钾：五水硫酸铜=3：1、6：1或10：1均可），再用量筒加入3毫升浓硫酸。将上述4个凯氏烧瓶放在通风良好处（最好在通风橱中进行）加热消化。先用小火加热至沸腾。此时会产生大量泡沫，应特别注意不能让黑色物质上升到烧瓶颈部，否则将严重影响分析结果。当混合物停止冒泡，蒸汽与二氧化硫也均匀地放出时，将火焰调节到保持瓶内液体微微沸腾。假若发现瓶颈上有黑色颗粒，应小心地将烧瓶倾斜振摇，用消化液将其洗下。在消化过程中要时常转动烧瓶，使全部样品都浸在消化液中。当消化液呈清澈淡蓝色时即告消化结束。时间一般在5~6小时！若样品中含
赖氨酸或组氨酸较多时，消化时间需要延长1~2倍。因为这两种氨基酸中的氮在短时间内不易消化完全。
蒸馏
采用改良式凯氏定氮仪。
1、洗涤蒸馏仪：用硼酸指示剂（取100毫升2%硼酸溶液，滴加混合指示剂约1毫升，摇匀后呈紫红色即可；混合指示剂：50毫升0.1%甲烯蓝乙醇+200毫升0.1%甲基红乙醇，存于棕色瓶中）检测是否清洗干净。干净标准：指示剂不变色。
2、样品和空白的蒸馏：取2毫升稀释消化液至加样口加入反应室，关闭加样口，另取1个装硼酸指示剂的三角瓶接于冷凝管下端。取30%氢氧化钠（W/W）溶液约10毫升，从加样口缓慢加入，当未加完时关闭，并加入约3毫升蒸馏水，再继续缓慢加入一半后关闭，让剩下的水作液封。将加热器重新放在蒸汽发生器下加热（注：在清洗仪器完毕后应拿走加热器），待三角瓶中液体由紫红变成鲜绿色起开始计时，蒸馏5分钟，然后移动三角瓶使液面离开冷凝管口约1厘米，并用少量蒸馏水洗涤冷凝管口外周，继续蒸馏1分钟。空白同样。
3、清洗仪器：同上，不必用指示剂。
滴定
用0.0100mol/L标准盐酸（要标定，费时）滴定三角瓶中收集的氨，直至硼酸指示剂由绿变紫红。
注意：蒸馏时试验室环境中切忌有碱性雾气，否则要影响分析精度。
凯式定氮法：
凝胶层析法(凝胶过滤)脱盐和分离蛋白质
原理
凡盐析所获得的粗制蛋白质（盐析得到的IgG）中均含有硫酸铵等盐类，这类将影响以后的纯化，所以纯化前均应除去，此过程称为―脱盐‖（desalthing）。脱盐常用透析法和凝胶过滤法，这两种方法各有利弊。前者的优点是透析后析品终体积较小，但所需时间较长，且盐不易除尽；凝胶过滤法则能将盐除尽，所需时间也短，但其凝胶过滤后样品体积较大。所以，要根据具体情况选择使用。凝胶达滤后样品体积不会太增加，所以选用凝胶过滤法。
凝胶过滤（gel filtration），又称为凝胶层析（gel chromatography）、分子筛过滤（molecularsieve filtration）、凝胶渗透层析（gel osmotic chromatography）等。它是20世纪60年代发展起来的一种层析技术。其基本原理是利用被分离物质分子大小不同及固定相（凝胶）具有分子筛的特点，将被分离物质各成分按分子大小分开，达到分离的方法。
凝胶是由胶体粒子构成的立体网状结构。网眼里吸满水后凝胶膨胀呈柔软而富于弹性的半固体状态。人工合成的凝胶网眼较均匀地分布在凝胶颗粒上有如筛眼，小于筛眼的物质分子均可通过，大于筛眼的物质分子则不能，故称为―分子筛‖。凝胶之所以能将不同分子的物质分开是因为当被分离物质的各成分通过凝胶时，小于筛眼的分子将完全渗入凝胶网眼，并随着流动相的移动沿凝胶网眼孔道移动，从一个颗粒的网眼流出，又进入另一颗粒的网眼，如此连续下去，直到流过整个凝胶柱为止，因而流程长、阻力大、流速慢；大于筛眼的分子则完全被筛眼排阻而不能进入凝胶网眼，只能随流动相沿凝胶颗粒的间隙流动，其流程短、阻力小、流速快，比小分子先流出层析柱；小分子最后流出。分子大小介于完全排阻不能进入或完全渗入凝胶筛眼之间的物质分子，则居中流出。这样被分离物质即被按分子的大小分开。
用于凝胶层析的凝胶均为人工合成的产品，主要有交联葡聚糖（商品名为Sephadex）、琼脂糖（商品名为Sepharose）、聚丙烯酰胺凝胶（商品名为Bio–gel）及具有一定网眼的细玻璃珠等和这些凝胶的衍生物。
下面主要介绍葡聚糖凝胶，这是由葡萄糖的多聚物与1–氯– 2、3–环氧丙烷交连而成。环氧丙烷引入丙三醇基将链状的多聚葡萄糖单位交联起来，凝胶网眼的大小由多聚葡萄糖的分子和环氧丙烷的比例（交联度）来控制。
葡聚糖具有较强的亲水性，在水和电解质溶液中膨胀成为柔软而富于弹性的凝胶，其吸水能力与葡聚糖凝胶的交联度有密切关系。交联度大的，孔径小，吸水少，膨胀的程度小；交联度小的，孔径大，吸水多，膨胀的程度大。因此，葡聚糖凝胶孔径的大小可以其吸水量的大小来表示，常以G–10至G–200号码标记。G后面的数字是其吸水量（毫升水/克干胶）乘以10所得的值。如G–25即表示吸水量为2.5ml/2干胶。市售有G–10、G–5、G–50、G–
75、G–100、G–150、G–200等型号。G–75以上的胶因吸水量大，膨胀后形态柔软易变，统称为软胶。G–75以下的称为硬胶。
葡聚糖凝胶可分离的分子大小从几百到数十万。可根据被分离物质的分子大小及目的选择使用。一般说Sephadex G–l0～15通常用于分离肽及―脱盐‖。Sephadex G–75～200用以分离各类蛋白质。
凝胶层析是一种物理分离法。葡聚糖凝胶基本上不带电荷呈多惰性，不与被分离物质发生反应，所以分离的效果较好。然而由于它是葡萄糖的聚合物，因而仍有少量活性羟基，能吸附少量蛋白质等被分离的物质。为了克服这个缺点，一般使用含有离子强度达0.08的NaCl等中性盐缓冲液作洗脱液。
操作方法
（1）取层析柱1支（1.5cm×20cm），垂直固定在支架上，关闭下端出口。将已经溶胀好的Sephadex G-25中的水倾倒出去，加入2倍体积的0.0175mol/L，pH6.7磷酸盐缓冲液，
并搅拌成悬浮液，然后灌注入柱，打开柱的下端出口，继续加入搅匀的Sephadex G-25，使凝胶自然沉降高度到17cm左右，关闭出口。待凝胶柱形成后，在洗脱瓶中加入0.0175mol/L，pH6.7磷酸盐缓冲液以3倍柱体积的磷酸盐缓冲流过凝胶柱，以平衡凝胶。
（2）凝胶平衡后，用皮头滴管除去凝胶柱面的溶液，将盐析所得全部IgG样品加到凝胶柱表面，打开柱下口，控制流速让IgG样品溶液慢慢浸入凝胶内。凝胶柱面上加一层的0.0175mol/L，pH6.7磷酸盐缓冲液，并用此缓冲液洗脱，控制流速为0.5ml/min左右。用试管收集洗脱液，每管10滴。
3）在开始收集洗脱液的同时检查蛋白质是否已开始流出。为此，由每支收集管中取出1滴溶液置于黑色比色磁盘中，加入1滴20%磺基水杨酸，若呈现白色絮状沉淀即证明已有蛋白质出现，直到检查不出白色沉淀时，停止收集洗脱液。
（4）由经检查含有蛋白质的每管中，取1滴溶液，放置在白色比色盘孔中，加入1滴奈氏试剂，若呈现棕黄色沉淀说明它含有硫酸铵。合并检查后不含硫酸铵的各管收集液，即为―脱盐‖后的IgG。
注意：在检测时，用皮头滴管吸取管中溶液后应及时洗净，再吸取下一管，以免造成相互污染假象。
试剂和器材
（1）Sephadex G-25。
（2）0.0175mol/L，pH6.7磷酸盐缓冲液。
（3）奈氏（Nessler）试剂：于500ml锥形瓶内加入碘化钾150g，碘110g，汞150g及蒸馏水100ml。用力振荡7～15min，至碘的棕色开始转变时，混合液温度升高，将此瓶浸于冷水内继续振荡，直到棕色的碘转变为带绿色的碘化钾汞液为止。将上清液倾入2000ml量筒内，加蒸馏水至2000ml，混匀备用。
（4）20%（W/V）磺基水杨酸溶液。
（5）1.5cm×20cm层析柱。
（6）黑、白比色磁盘。
附：凝胶处理的基本操作
（1）凝胶溶胀（水化）商品葡聚糖凝胶和聚丙烯酰胺凝胶均为干燥颗粒。使用前必须水化溶胀。商品琼脂糖凝胶呈悬浮胶体可直接用，玻璃球不用溶胀。
凝胶溶胀有两种方法：一种是将所需葡聚糖凝胶浸入蒸馏水中于室温下溶胀；另一种是置于沸水浴中溶胀。各种葡聚糖在上述溶胀方法中所需的时间见下表：
必须浸泡足够的时间以使凝胶充分溶胀。两种方法中，沸水浴溶胀不但节省时间，还可以杀灭凝胶中污染的细菌并排出网眼中气体。
凝胶溶胀后，需用蒸馏水洗涤几次，每次应将沉降缓慢的细小颗粒随水倾倒出去，以免在装柱后产生阻塞现象，降低流速。洗后将凝胶浸泡在洗脱液中待用。
一支层析柱中应该装入的干胶量可以用下法推算：称取1g所需型号的葡聚糖干胶，放在5ml量筒中，用室温溶胀的方法充分溶胀，观察溶胀后凝胶的体积。然后在层析柱中加水到
所需柱床高度，将水倒出，量取柱床体积。根据1g干胶溶胀后的体积和所需柱床体积，即可推算出干胶的需要量。
（2）装柱将层析剂装入柱中进行层析的方法称柱层析法。作层析用的柱子称层析柱。层析柱有玻璃和透明塑料的两种。柱子的一端为进口，另一端为出口，出口端底部有烧结玻璃砂板或尼龙布，能阻止层析剂流出，溶剂则可流过。如果没有市售的层析柱，可以选用粗细均匀，长短合适的玻璃管，在两端塞上合适的胶塞，胶塞中插人细玻璃管，在一端放一层尼龙布为出口，即可作为层析柱使用。层析柱的长短粗细根据实验的目的而定，一般说来，凝胶层析时柱越长，分离效果越好。但柱过长，层析时间长，样品易稀释造成扩散，反而影响分离效果。柱的内径不宜较细，直径1cm以下的柱易发生―管壁效应‖，即柱中部分的物质组分移动较快，管壁周围的则移动较慢，造成分离混乱。当然柱的内径也不宜过粗。
凝胶层析中，在把小分子物质（mw
装柱的操作过程如下：将层析柱垂直固定在支架上，打开柱下口开关。将溶胀好的凝胶放在烧杯中，使凝胶表面上的水层与凝胶体积相等。用玻璃棒搅匀凝胶液，顺玻璃棒灌入柱内。此时柱下口一边排水，上口一边加入搅匀的凝胶，可见凝胶连续均匀地沉降，逐步形成凝胶柱。当到达所需凝胶柱高度时，立即关闭下口，待凝胶自然沉降形成凝胶柱床。凝胶柱床一般应离柱顶3~5cm，并覆盖一层溶液。
灌注凝胶时要求将均匀的凝胶一直加到所需柱床高度，不能时断时续，否则将出现分层或―纹路‖等毛病。若中途出现这些现象，可以用玻璃棒将已形成的柱床逐步搅起，直至出毛病的部分再让凝胶重新沉降或继续加入搅匀的凝胶悬液。若在灌好胶后才发现―纹路‖、分层等现象时，要重新装柱，以免影响层析效果。在做大型的凝胶柱时，灌注的凝胶是否均匀往往从
表面上看不出来。所以使用前应该用一些带色的大分子物质如细胞色素C、血红蛋白或专用的蓝色葡聚糖–2 000 （Blue dextran–2 000）通过凝胶柱，观察形成的色斑带是否整齐，若斑带歪斜，应该重新装柱，直至达到要求。
刚从冰箱中取出的凝胶液，不能马上用来灌柱，应平衡至室温后再用，不然装好的凝胶会产生大量的气泡影响层析。
在整个灌注凝胶的过程及使用中，凝胶柱面上一定要覆盖着一层溶液，以免进入空气。若进空气再加入溶液时，凝胶柱中易形成气泡。
（3）平衡装好的凝胶柱，使用前应该用相当于柱床体积两倍或更多的洗脱液流过凝胶柱，以压实凝胶，称为平衡。
（4）上样将样品加入到凝胶柱中，准备层析的过程称上样。上样时，应该注意上样量的多少、样品的黏稠度及离子强度。这三个因素会影响到以后层析的效果。一般来说―脱盐‖层析时，上样体积可为柱体积的10%～25%；生物大分子的分级分离，约为柱体积的1%～5%。样品的黏稠度一般不宜大于洗脱液黏稠度的2倍以上，不然洗脱峰会变宽和歪斜。离子强度要达到0.08，以免产生特异性吸附。
上样操作：先打开层析柱的下口开关，放出凝胶柱面上的溶液，或用皮头吸管吸取，使液面与凝胶表面相平齐，但切忌液面低于凝胶表面。然后将样品加在凝胶表面，打开柱下口开关，控制流速，使样品慢慢渗入凝胶内。加样时注意勿将凝胶柱面冲起形成凹面，也不能沿管壁流下，以免样品沿柱壁与凝胶柱的间凝胶隙漏下。当慢慢渗入凝胶的样品液液面与凝胶柱面相平时，关闭下口，完成上样。然后在凝胶柱面上加一层（3～5cm）洗脱液，接上洗脱瓶准备洗脱。
（5）洗脱用规定的溶液流过样品，使分子量不同的样品逐步分开并先后由柱床流出的过程称为洗脱。所用溶液称洗脱液。洗脱液放在贮液瓶（洗脱瓶）中并与层析柱相通连。洗脱时只要打开层析柱下口开关，洗脱液即可流出。
洗脱过程中保持恒定的流速是柱层析获得良好分离效果的重要条件。因为凝胶层析的分离作用主要取决于分子扩散进入凝胶的机会，流速过快有些分子来不及在分子筛中分配而流出；过慢时已分离的分子会因扩散而混合。因而要保持适当的恒定流速。洗脱液的流速取决于它的静水压。静水压是指洗脱瓶中洗脱液的液面高出于层析柱出口产生的液体压力（或接触空气的两个液面间的高差），这个高度差越大，静水压越大，洗脱液的流速就越快。这个压力差可以调动，如提高洗脱瓶的位置或瓶中液面的增减；或者降低或提高层析柱出口的位置等，因此静水压又称操作压。
由于静水压越大，洗脱液的流速就越快。在固定洗脱瓶与出口位置的情况下，静水压会在洗脱过程中，随着洗脱瓶中溶液减少液面不断下降而减少，难以维持流速的恒定。为了解决这个问题，Marriotte首次将洗脱瓶加塞塞紧，塞中插入玻璃管，使玻管下口深入到洗脱液的底部，这样洗脱液的静水压便等于此玻管下口的液面高出层析柱出口液面的高度（因为当洗脱瓶液体流出时，瓶顶形成真空，空气只从玻璃管中进入，玻管下口即为接触空气点），因此只要溶液不低于玻璃管下口，玻璃管口以上溶液的增减将不影响静水压，从而自动保持了流速的恒定，此洗脱瓶称为恒压瓶，也叫马氏瓶。当然，当洗脱液减少至液面低于玻管的下口时，便会失去作用，但这时可用及时加入洗脱液来解决。
在凝胶层析中，不仅要保持静水压的恒定，还要保持适当的静水压。这是因为G–75以上的软胶胶体柔软易变形，对静水压仅有一定的承受能力，不同软胶的承受能力也不相同，静水压超过凝胶的承受能力时，最初流速会很快；其后随着静水压力过大将使软胶变形压紧，流速逐渐降低，最后甚至流不出。所以，保持恒定正确的静水压是凝胶层析时获得满意结果的必要条件。
脱盐一般使用的是G–25属于硬胶，硬胶不易变形，受静水压的影响较小，实验过程中的流速可用恒压瓶下口橡皮管上的螺旋夹控制在0.5ml/min左右，随着洗脱液的流出，样品逐步被分开。用试管收集洗脱液，按顺序每管收集2ml。
（6）检测 在收集的同时，检查蛋白质是否流出。于每管中取出1滴放在黑色比色板孔中（按编号顺序），再分别加入1滴20%磺酰水扬酸，如出现白色沉淀即表示蛋白质已流出凝胶柱，如此一直检查到蛋白质全流出为止。与此同时，再从蛋白质的管中取出1滴于白色比板中，加入奈氏试剂1滴，如蛋白管中不出现棕色，即表示蛋白质中的硫酸铵已除去。合并纯化后的蛋白质管以待用。以光密度值为纵坐标，以收集管的顺序号为横坐标，在坐标纸上绘图。可获具有一条洗脱峰的曲线，称为洗脱曲线，用以表示被分离物质流出的状态。
（7）凝胶的洗涤及保存由于凝胶对被分离的物质基本无吸附作用，所以无需―再生‖，只要用洗脱液冲洗后即可连续使用。但因多次使用凝胶颗粒将逐渐沉积压紧，流速将减慢，所以使用一段时间后应倒出来，清洗后重新装柱。
凝胶暂时不使用可浸泡在溶液中，存放在4℃冰箱中。若放在室温保存应加入0.02%叠氮钠（NaN3）或0.01%乙酸汞等防腐剂，以防发霉。用时以水洗去防腐剂即可使用。凝胶长期不用，可用水洗净，分次加入百分浓度递增的乙醇溶液，每次停留一段时间，使之平衡，再换一下浓度的乙醇，让凝胶逐步脱水，再用乙醚除乙醇，抽干即可，或将凝胶洗净后抽干，在表面皿上30℃逐步烘干
蛋白质纯化(protein purification)实用技术
研究的最后还是要看基因表达产物,无论是用于检测还是用于棉衣保护,都需要将表达出的蛋白质分离和纯化,然而蛋白质性质各异,故纯化方法不同,现共享一些基本的纯化方法,以飨读者:
蛋白质的一级、二级、三级和四级结构决定了它的物理、化学、生物化学、物理化学和生物学性质，综述了不同蛋白质之间的性质存在差异或者改变条件是使之具有差异，利用一种同时多种性质差异，在兼顾收率和纯度的情况下，选择蛋白质提纯的方法。
蛋白质在组织或细胞中一般都是以复杂的混合物形式存在，每种类型的细胞都含有成千种不同的蛋白质。蛋白质的分离和提纯工作是一项艰巨而繁重的任务，到目前为止，还没有一个
单独的或一套现成的方法能把任何一种蛋白质从复杂的混合物中提取出来，但对任何一种蛋白质都有可能选择一套适当的分离提纯程序来获取高纯度的制品。
蛋白质提纯的总目标是设法增加制品纯度或比活性，对纯化的要求是以合理的效率、速度、收率和纯度，将需要蛋白质从细胞的全部其他成分特别是不想要的杂蛋白中分离出来，同时仍保留有这种多肽的生物学活性和化学完整性。
能从成千上万种蛋白质混合物中纯化出一种蛋白质的原因，是不同的蛋白质在它们的许多物理、化学、物理化学和生物学性质有着极大的不同，这些性质是由于蛋白质的氨基酸的序列和数目不同造成的，连接在多肽主链上氨基酸残基可是荷正电的、荷负电的、极性的或非极性的、亲水的或疏水的，此外多肽可折叠成非常确定的二级结构（α螺旋、β折叠和各种转角）、三级结构和四级结构，形成独特的大小、形状和残基在蛋白质表面的分布状况，利用待分离的蛋白质与其它蛋白质之间在性质的差异，即能设计出一组合理的分级分离步骤。 可依据蛋白质不同性质与之相对应的方法将蛋白质混合物分离：
1．分子大小
不同种类的蛋白质在分子大小方面有一定的差别，可用一些简便的方法，使蛋白质混合物得到初步分离。
1．1透析和超滤
透析在纯化中极为常用，可除去盐类（脱盐及置换缓冲液）、有机溶剂、低分子量的抑制剂等。透析膜的截留分子量为5000左右，如分子量小于 10000的酶液就有泄露的危险，在纯化中极为常用，可除去盐类、有机溶剂、低分子量的抑制剂等。超滤一般用于浓缩和脱色
1．2离心分离置换缓冲液
许多酶富集于某一细胞器内，匀浆后离心得得到某一亚细胞成分，使酶富集10~20倍，再对特定的酶进行纯化。差速离心，分辨率较低，仅适用于粗提或浓缩。速率区带法，如离心
时间太长所有的物质都会沉淀下来，故需选择最佳分离时间，可得到相当纯的亚细胞成分用于进一步纯化，避免了差速离心中大小组分一起沉淀的问题，但容量较小，只能用于少量制备。等密度梯度离心常用的离主介质有蔗糖、聚蔗糖、氯化铯、溴化钾、碘化钠等等
1．3凝胶过滤
这是根据分子大小分离蛋白质混合物最有效的方法之一，注意使要离的蛋白质分子量落在凝胶的工作范围内。选择不同的分子量凝胶可用于脱盐、置换缓冲液及利用分子量的差异除去热源。
2．形状
蛋白质在离心通过溶液运动时，或通过膜、凝胶过滤填料颗粒或电泳凝胶中的小孔运动时，都会受到形状的影响：对两种相同质量的蛋白质而言，球状蛋白质具有较小的有效半径（斯托克半径），通过溶液沉降时遇到的摩擦力小，沉降较快而显得比其它形状的蛋白质大；反之，在体积排阻色谱时，斯托克半径较小的球状蛋白质更容易扩散进入凝胶过滤填料颗粒内部，较迟洗脱出来，因而显得比其它形状的蛋白质要小。
3．溶解度
利用蛋白质的溶解度的差别来分别各种蛋白质常用的方法。影响蛋白质溶解度的外界因素很多，其中主要有：溶液的pH、离子强度、介电常数和温度，但在同一的特定外界条件下，不同的蛋白质具有不同的溶解度。适当改变外界条件，控制蛋白质混合物中某一成分的溶解度
3．1pH控制和等电点沉淀
蛋白质在其等电点一般较不易溶解。
3．2蛋白质的盐溶和盐析
3．3有机溶剂分级法
蛋白质在不同的溶剂中的溶解度有很大不同，从基本不溶（＜10μg/ml）直至极易溶解（＞300mg/ml）不等。影响蛋白质溶解度的可变因素包括温度、pH、溶剂的极性、离子性质和离子强度。引起蛋白质沉淀的有机溶剂的浓度不同，故控制有机溶剂的浓度可分离蛋白质。 水溶性非离子聚合物如聚乙二醇也能引起蛋白质的沉淀。
3．4温度
不同的蛋白质在不同的温度具有不同的溶解度和活性。大多数蛋白质在低温下比较稳定，故分离操作一般在0℃或更低温度下进行。
4．电荷
蛋白质净电荷取决于氨基酸残基所带的正负电荷的总和，如中性溶液中带净负电荷则称为酸性蛋白质，
4．1电泳
不仅是分离蛋白质混合物和鉴定蛋白质纯度的重要手段，而且也是研究蛋白质性质很有用的方法。
等电聚焦分辨率很高，pI有0.02pH的差异就能分开。
2D-PAGE分离蛋白质分辨率已经发展到100000个蛋白点。
4．2离子交换层析
改变蛋白质混合物溶液中的盐离子强度、pH和（阴、阳）离子交换填料，不同蛋白质对不同的离子交换填料的吸附容量不同，蛋白质因吸附容量不同或不被吸附而分离。
洗脱可采用保持洗脱剂成分一直不变，也可采用改变洗脱剂的盐度或pH的方法洗脱，后一种可分分段洗脱和梯度洗脱。梯度洗脱一般效果好，分辨率高，特别是使用交换容量小，对
盐浓度敏感的离子交换剂，多用梯度洗脱。控制洗脱剂的体积（与柱床体体积相比）、盐浓度和pH，样品组分能从离子交换柱上分别洗脱下来。
蛋白分子暴露在外表面的侧链基团的种类和数量不同，故在一定的PH值和离子强度的缓冲液的所带的电荷不同
5．电荷分布
电荷的氨基酸残基可均匀地分布于蛋白质的表面，既可以适当的强度与阳离子交换柱结合也能以适当强度与阴离子结合，因多数蛋白质都有不能在单一的溶剂条件下同时与两种类型的离子交换柱结合，故可得用此性质纯化；电荷的氨基酸残基亦可成簇分布，使某一区域带强正电荷而另一区域带强负电荷，呈强酸性或强碱性，只能在极端pH与阳离子交换树脂或阴离子交换树脂结合，如钙调蛋白只能在pH2时与阳离子交换树脂结合。
6．疏水性
多数疏水性的氨基酸残基藏在蛋白质的内部，但也有一些在表面。蛋白质表面的疏水性氨基酸残基的数目和空间分布决定了该蛋白质是否具有与疏水柱填料结合从而利用它来进行分离的能力。
因其廉价和纯化后的蛋白质具有生物活性，是一种通用性的分离和纯化蛋白质的工具。高浓度盐水溶液中蛋白质在柱上保留，在低盐或水溶液中蛋白质从柱上被洗脱，故特别适用于浓硫酸铵溶液沉淀分离后的母液以及该沉淀用盐溶解后的含有目标产品的溶液直接进样到柱上，当然也适用7mol/盐酸胍或8mol/L 脲的大肠杆菌的治疗蛋白质提取液直接进样到柱上，在分离的同时也进行了复性。
7．密度
多数蛋白质的密度在1.3~1.4g/cm3之间，分级分离蛋白质时一般不常用此性质，不过对含有大量磷酸盐或脂质的蛋白质与一般蛋白质在密度上明显不同，可用密度梯度法离心与大部分蛋白质分离。
8．基因工程构建的纯化标记
通过改变cDNA在被表达的蛋白的氨基端或羧基端加入少许几个额外氨基酸，这个加入的标记可用来作为一个有效的纯化依据。
8．1GST融合载体
使要表达的蛋白质和谷胱甘肽S转移酶一起表达，然后利用Glutathione Sepharose 4B作亲和纯化，再利用凝血酶或因子Xa切开。
8．2蛋白A融合载体
使要表达的蛋白和蛋白A的IgG结合部位融合在一起表达，以IgG Sepharose纯化。
8．3含组氨酸标记（Histidine-tagged）Chelating Sepharose
最通行的标记之一，是在蛋白质的氨基端加上6~10个组氨酸，在一般或变性条件（如8M尿素）下借助它能与Ni2+螯合柱紧紧结合的能力，用咪唑洗脱，或将pH降至5.9使组氨酸充分质子化，不再与结合Ni2+使之得以纯化。
重组蛋白在设计、构建时已融入纯化构想。样品多夹杂了破碎细胞或可溶产物，扩张床吸附技术STREAmlINE适合做粗分离。
9．亲和能力
结合效率高，分离速度快的特点。配基可是酶的底物、抑制剂、辅因子、特异性的抗体、 吸附后可改变缓冲液的离子强度和PH的方法，洗耳恭听脱下来，也可用更高浓度的同一配体溶液或亲和力更强的配体溶液洗脱
亲和层析固定相的配基与生物分子之间的特殊的生物大分子亲和能力不同来进行相互分离的，依亲和选择性的高低分为：基团性亲和层析，固定相上的配基对一类基团的极强的亲和力。如含有糖基的一类蛋白质或糖蛋白对三嗪染料显示特别强的吸附能力；高选择性（专一
性）亲和层析，配基仅对某一种蛋白质有特别强的亲和性。如单克隆抗体对抗原的特异性的吸附。
亲和层析除特异性的吸附外，仍然会因分子的错误认别和分子间非选择性的作用力而吸附一些杂蛋白质，另洗脱过程中的配体不可避免的脱落进入分离体系。
与超滤结合起来，将两者优点集中形成超滤亲和纯化，具有高分离效率和大规模工业化的优点，适用于初分离。
按配基的不同可分为：
（1）金属螯合介质
过渡金属离子Cu、Zn和Ni 2＋2＋2＋等以亚胺络合物的形式键合到因定相上，由于这些金属离子与色氨酸、组氨酸和半胱氨酸之间形成了配价键，从而形成了亚胺金属—蛋白螯合物，使含有这些氨基酸的蛋白被这种金属螯合亲和色谱的固定相吸附。螯合物的稳定性受单个组氨酸和半胱氨酸解离常数所控制，从而亦受流动相的pH和温度的影响，控制条件可以使不同蛋白质相互分离。
（2）小配体亲和介质
配体有精氨酸、苯甲酰胺、钙调因子、明胶、肝素和赖氨酸等等。
（3）抗体亲和介质
即免疫亲和层析，配体有重组蛋白A和重组蛋白G，但蛋白A比蛋白G专一，蛋白G能结合更多不同源的IgG。
（4）颜料亲和介质
染料层析的效果除主要取决于染料配基与酶的亲和力大小外，还与洗脱缓冲液的种类、离子强度、PH值及待分离的样品的纯度有关。配体有 Cibacron Blue和Procion Red两种。
在一定的条件下，固定化的染料能起阳离子交换剂的作用，为了避免此现象的发生，最好要离子强度小于0。1和PH大于7时操作。
（5）外源凝集素亲和介质
配体有刀豆球蛋白、扁豆外源凝集素和麦芽外源凝集素，固相外源凝集素能和数种糖类残基发生可逆反应，适合纯化多糖、糖蛋白。
10．非极性基团之间作用力
溶质分子中的非极性基团与非极性固定相间的相互作用力（非选择性分散力或伦敦力）大小与溶质分子极性基团与流动力相中极性分子在相反方向上相互作用力的差异进行分离。因其流动相中的置换剂是极性小于水的有机溶剂（如甲醇、乙腈、四氢呋喃等），这些有机溶剂可能使许多蛋白质分子产生不可逆的变性；流动相中须有离子对试剂（如三氟乙酸、甲酸、磷酸等）存在才可使分离有效地进行和获得高的质量回收率；分离须在酸性介质中进行（一般pH在2~3之间），又有一些蛋白质会在后两种条件下产生不可逆的分子构象变化，故在生物大分子中人分离纯化中受到限制，但分子构象变化可逆的蛋白质而言是有效的方法。 正相色谱在生物大分子中的分离和纯化中应用相对较少，因所用的溶剂很贵。
11．可逆性缔合
在某些溶液条件下，有一些酶能聚合成二聚体、四聚体等，而在另一种条件下则形成单体，如相继在这两种不同的条件下按大小就可以进行分级分离。
12．稳定性
12．1热稳定性
大多数蛋白质加热到95℃时会解折叠或沉淀，利用这一性质，可容易地将一种经这样加热后仍保持其可溶性活性的蛋白质从大部分其它细胞蛋白质中分离开。
12．2蛋白酶解稳定性
用蛋白酶处理上清液，消化杂蛋白，留下抗蛋白酶解抗性蛋白质。
13．分配系数
即利用双水相萃取分离，常用的生物物质分离体系有：聚乙二醇（PEG）/葡聚糖（DEXTRAN）、PEG/磷酸盐、PEG/硫酸铵等。由于具有含水比例高、选用的聚合物及盐对酶无毒性、分离设备与化学工业通用等优点，在工业上目益受重视。
分配行为受聚合物分子大小、成相浓度、PH、无机盐种类等因素影响，
发展：具有亲和双水相萃取及膜分离双水相萃取等新型双水相分离技术。
双向水溶液系统的蛋白质纯化
一些与水混合多聚物的不相溶性导致依赖于多聚物浓度的两相系统的液-液分配技术，可以由两不同的高水溶性的多聚物或一种多聚物各一种盐，用于从微生物匀浆中除支细胞碎片、后续分配步骤进一步纯化。分离的选择性一般随着分离分子或颗粒大小面增加。
14．表面活性
14．1泡沫分离
蛋白质溶液具有表面活性，气体在溶液中鼓泡，气泡与液相主体分离，在塔顶富集，达到分离和浓缩的目的。
14．2反胶团相转移法
反胶团相转移法是80年代兴起的一种新型分离技术，它利用表面活性剂分子在有机溶剂中自发形成的反向胶团（反胶团），在一定条件下将水溶性蛋白质分子增溶进反胶团的极性核（水池）中，再创造条件将蛋白质抽提至另一水相，实现蛋白质的相转移，达到分离和提纯蛋白质的目的。反胶团中的蛋白质分子受到周围水分子和表面活性剂极性头的保护，仍保持一定的活性，甚至表现出超活性。由于蛋白质增溶于反胶团与蛋白质所带电荷及反胶团内表面电荷间的静电作用及反胶团的大小有关，因而表面活性剂的种类、水溶液的pH值及离子
强度等因素均影响反胶团对蛋白质的相转移。据报道利用AOT/异辛烷反胶团对酵母脂肪酶进行相转移。
14．3聚合物-盐-水液-固苯取体系是90年代在国内开发的种新的萃取体系，成功地用于萃取金属离子及卞果酸脱氢酶等生物活性物质较强的吸附及乳化作用等缺陷，成相容易成相后直接倾出液相即可使液固的相分离，勿需特殊技术处理，不用有机溶剂，无毒性，成相聚合物及盐对生物活性物质有稳定和保护作用，萃取分离选择性好消耗低、易于规模放大的分离生队物活件物质的新技术在聚乙二醇修饰物的聚乙二醇/葡聚糖双水相萃取体系共价作用：主要用于含巯基酶的纯化，通过共价键结合在层析介质上，偶联是可逆的，能还原二硫键的低分子化合物洗脱，如空间位阻，可在含变性剂的缓冲液时吸附，如已含二硫键，则先用还原剂打开。
蛋白质分离纯化的一般程序
一）材料的预处理及细胞破碎
分离提纯某一种蛋白质时，首先要把蛋白质从组织或细胞中释放出来并保持原来的天然状态，不丧失活性。所以要采用适当的方法将组织和细胞破碎。常用的破碎组织细胞的方法有：
1.机械破碎法
这种方法是利用机械力的剪切作用，使细胞破碎。常用设备有，高速组织捣碎机、匀浆器、研钵等。
2.渗透破碎法
这种方法是在低渗条件使细胞溶胀而破碎。
3.反复冻融法
生物组织经冻结后，细胞内液结冰膨胀而使细胞胀破。这种方法简单方便，但要注意那些对温度变化敏感的蛋白质不宜采用此法。
4.超声波法
使用超声波震荡器使细胞膜上所受张力不均而使细胞破碎。
5.酶法
如用溶菌酶破坏微生物细胞等。
(二)蛋白质的抽提
通常选择适当的缓冲液溶剂把蛋白质提取出来。抽提所用缓冲液的pH、离子强度、组成成分等条件的选择应根据欲制备的蛋白质的性质而定。如膜蛋白的抽提，抽提缓冲液中一般要加入表面活性剂（十二烷基磺酸钠、tritonX-100 等），使膜结构破坏，利于蛋白质与膜分离。在抽提过程中，应注意温度，避免剧烈搅拌等，以防止蛋白质的变性。
（三）蛋白质粗制品的获得
选用适当的方法将所要的蛋白质与其它杂蛋白分离开来。比较方便的有效方法是根据蛋白质溶解度的差异进行的分离。常用的有下列几种方法：
1.等电点沉淀法
不同蛋白质的等电点不同，可用等电点沉淀法使它们相互分离。
2.盐析法
不同蛋白质盐析所需要的盐饱和度不同，所以可通过调节盐浓度将目的蛋白沉淀析出。被盐析沉淀下来的蛋白质仍保持其天然性质，并能再度溶解而不变性。
3.有机溶剂沉淀法
中性有机溶剂如乙醇、丙酮，它们的介电常数比水低。能使大多数球状蛋白质在水溶液中的溶解度降低，进而从溶液中沉淀出来，因此可用来沉淀蛋白质。此外，有机溶剂会破坏蛋白
质表面的水化层，促使蛋白质分子变得不稳定而析出。由于有机溶剂会使蛋白质变性，使用该法时，要注意在低温下操作，选择合适的有机溶剂浓度。
（四）样品的进一步分离纯化
用等电点沉淀法、盐析法所得到的蛋白质一般含有其他蛋白质杂质，须进一步分离提纯才能得到有一定纯度的样品。常用的纯化方法有：凝胶过滤层析、离子交换纤维素层析、亲和层析等等。
有时还需要这几种方法联合使用才能得到较高纯度的蛋白质样品。
下游纯化工艺简介
Downstream（下游）与上游相对的概念，一般而言，上游指基因克隆、细胞培养等目的产物表达工序，下游指从表达有目的产物的复杂的混合液中分离纯化得到符合要求的目的产物的一系列步骤。美、日、欧等发达国家生物技术产品工业化的实践证明：生物技术产品的产业化高度依赖于基因工程下游工序技术及设备的进步。
一、纯化工艺常用衔接技术：
1、盐析。常采用硫酸铵、硫酸钠盐析，获得的盐析沉淀物在低温冰箱(
2、等电点沉淀。根据蛋白质、多肽在等电点时溶解度最小的特点进行。
3、有机溶剂沉淀。采用冷的丙酮、乙醇沉淀蛋白质。例如人血浆蛋白的乙醇分级沉淀。
4、透析。根据目的蛋白质、多肽的分子量，选取适宜的透析袋进行透析，可以起到更换缓冲液以及去除一些低分子杂质的目的。
5、超滤。根据目的蛋白质、多肽的分子量，选取适宜截留分子量(MWcutoff)的超滤膜进行超滤。
6、真空冷冻干燥。利用在低温和高真空条件下，冰不经融化为液态水而直接升华为水蒸气的原理。可以很好地浓缩样品和保存蛋白质、多肽的生物活性。
7、变性沉淀。根据目的蛋白质、多肽对于温度或者酸碱性的耐受性，在较高的温度或者较极端的pH条件下处理样品，使杂质去除的方法。例如胸腺肽制备中使用的热变性(~80℃)去除杂蛋白。如果目的蛋白、多肽本身热稳定性、酸碱稳定性不高则不宜采用。
8、离心沉淀。利用离心沉降力将不溶性颗粒物与溶液分离的技术，常采用高速冷冻离心机进行。
9、脱盐。透析、超滤可用于进行脱盐，Sephadex G25、G50常用于蛋白质脱盐。
10、过滤
澄清过滤、除菌过滤（0.22微米膜过滤）、超滤（1000~300000道尔顿）
二、蛋白质、多肽液相色谱纯化方法简介
chromatography，色谱，层析
表1 常用的液相色谱纯化方法及其原理
1、纯化的一般目标和方法
首先，自然来源或者重组表达的蛋白质经过一些粗提的步骤（例如：匀浆、离心、硫酸铵沉淀等）成为稳定的可以用于色谱分离的样品。
然后进行捕获色谱（capture chromatography），主要目标是浓缩和去除大量的容易去除的杂质，此步最关心的是流速和载量，常采用高载量、快流速凝胶。
经过浓缩的部分纯化的样品进行中级色谱（intermediate chromatography），目的是去除较难去除的杂质，此步最关心的是分辨率，常采用高分辨率的细颗粒凝胶。
最后为了得到符合要求的最终产品，去除残存的杂质以及目的蛋白的多聚物或者降解片断，进行精制色谱（polishing chromatography），常采用具有高分辨率的凝胶过滤凝胶进行凝胶过滤色谱。
2、纯化前的准备工作
（1）样品稳定性试验
a、测定样品在pH 2-9的稳定性；
b、测定样品在0-4 mol/L NaCl及0-2 mol/L 硫酸铵中的稳定性；
c、测定样品在0-50%乙醇、甲醇中的稳定性；
d、测定样品在4-40℃的稳定性；
e、室温下静置过夜，测定对蛋白水解酶的稳定性。
2）样品预处理
a、去除样品中颗粒物（0.45-0.22微米膜过滤或者10000 g离心15分钟）
b、去除样品中脂类（10000 g离心15分钟或有机溶剂抽提）
c、去除样品中核酸（加入核酸酶消化或者使核酸沉淀）
d、抑制样品中蛋白水解酶（加入蛋白酶抑制剂、低温下快速第一步分离或在蛋白酶缺陷宿主中表达重组蛋白）
表 2 样品中有害杂质及去除办法
由于不同的色谱方法的原理不同，其对样品的要求也不相同，所以必须在进行色谱之前，根据特定色谱方法的要求对样品进行进一步的处理。如下表所示：
表3 不同色谱方法对于样品的要求
（3）样品的保存条件：
短期储存（小于24小时）
a、避免接近或超过样品的稳定极限防止蛋白质变性或沉淀
b、在密闭容器中冰箱冷藏
较长期储存（数天）
a、b、同上
c、加入适当的抑菌剂
长期储存
a、同上
b、冰冻或者最好冻干（真空冷冻干燥）保存。
3、对每一纯化步骤的评价相关方法的建立
a、目的蛋白含量测定
酶活性测定、生物活性测定、放射免疫、酶联免疫、免疫电泳、荧光。
b、总蛋白含量测定
紫外吸收法、Lowry法、Bradford染料结合法（考马斯亮兰G-250）等。
c、样品复杂度检测
HPLC（离子交换、凝胶过滤、反相）、SDS-PAGE、等电聚焦、毛细管电泳（CE）。
4、蛋白质的来源
（1）天然蛋白： 天然产物中的目的蛋白一般含量很少而且组分极复杂，在分离过程中须采用多个步骤才能去除各种杂质，并应在整个过程中降低蛋白水解酶的活性。
（2）重组蛋白： 重组蛋白则目标蛋白的丰度较高。重组蛋白主要有三种表达定位：
a、细胞质：在这种情况下，必须破坏细胞结构才能得到目的蛋白质，同时伴随着大量核酸和其它上千种宿主蛋白质的释放；在表达量较高的条件下，一般形成包涵体，包涵体含有过表达目的蛋白，且容易通过高速离心分离，但是包涵体的溶解与复性是较复杂的。
b、外周质： 表达的蛋白质存在于细菌内膜与外膜之间，这样目的蛋白可以较少地受到蛋白酶的作用并减少了宿主蛋白的污染。
c、分泌到培养基：这种表达一般蛋白质浓度较低，主要受到培养基中的污染。
表4 不同来源的蛋白质样品概述
三、常用液相色谱纯化方法
1、凝胶过滤（gel filtration，molecular sieve chromatography 分子筛、size exclusion chromatography 大小排阻色谱，gel permeation chromatography 凝胶渗入色谱）。 根据分子大小和形状进行分离的一种方法，分子量（Stroke半径）较大的先出峰，分子量小的后出峰。最常用的经典凝胶为Sephadex G系列，此外还有Sephacryl、Sepharose、Superose、Superdex等凝胶系列。凝胶过滤法方法简单、重现性强，目前广泛应用。 凝胶过滤具有很多不同分离范围的凝胶系列供选择。
要点: 采用细长（L/D~20）的柱、选择合适的凝胶、上样体积较小、流速较慢。 以下为常用凝胶过滤用凝胶及其基本参数
系列 名称 分离范围 颗粒大小 应用
Superdex prep grade系列 Superdex 30PG 小于10000 24~44微米 小肽
Superdex 75PG 3000~70000 24~44微米 一般蛋白
Superdex 200PG 10000~600000 24~44微米 单抗、大分子蛋白Superose系列 Superose 6 PG 5000~5000000 20-40微米 蛋白、多糖、核酸、病毒
Superose 12 PG 1000~300000 20-40微米 蛋白、多糖、核酸
Sephacryl HR系列 Sephacryl S-100 1000~10000 25-75微米 肽类、小蛋白
Sephacryl S-200 5000~250000 25-75微米 一般蛋白
Sephacryl S-300 10000~1500000 25-75微米 抗体等较大蛋白
Sephacryl S-400 ~28000000 25-75微米 多糖、蛋白多糖、脂质体
Sephacryl S-500 ~60000000 25-75微米
Sephacryl S-1000 ~100000000 40-105微米
Sepharose xB（CL-xB）系列 Sepharose 2B 70000~40000000 60-200微米 大分子复合物
Sepharose 4B 60000~20000000 45-165微米 病毒等大分子
Sepharose 6B 10000~4000000 45-165微米 大分子
Sephadex LH系列 Sephadex LH20 100-4000 30-100微米 天然产物
Sephadex LH60 400-20000 40-120微米 天然产物
Sephadex系列 Sephadex G-10 小于700 40-120
Sephadex G-15 小于1500 40-120
Sephadex G-25 coarse 1000-5000 100-300 脱盐及更换缓冲液用
Sephadex G-25 medium 1000-5000 50-150
Sephadex G-25 fine 1000-5000 20-80
Sephadex G-25 superfine 1000-5000 10-40
Sephadex G-50 coarse 1500-30000 100-300 小蛋白、多肽的分离
Sephadex G-50 medium 1500-30000 50-150
Sephadex G-50 fine 1500-30000 20-80
Sephadex G-50 superfine 1500-30000 10-40
Sephadex G-75 3000-80000 40-120 一般蛋白的分离
Sephadex G-75 superfine 3000-70000 10-40
Sephadex G-100 4000-150000 40-120 较大蛋白的分离
Sephadex G-100 superfine 4000-100000 10-40
Sephadex G-150 5000-300000 40-120 大蛋白的分离
Sephadex G-150 superfine 5000-150000 10-40
Sephadex G-200 5000-600000 40-120 大蛋白的分离
Sephadex G-200 superfine 5000-250000 10-40
2、离子交换色谱（ion exchange chromatography）
蛋白质、多肽均属于两性电解质，在缓冲液pH小于其等电点时，带净正电荷，而在缓冲液pH大于其等电点时，带净负电荷。阴离子交换凝胶本身带有正电荷基团，阳离子交换凝胶本身带负电荷基团。由于静电相互作用而使样品结合到凝胶上，再采用盐浓度梯度或者更换缓冲液的pH值进行洗脱
对于等电点小于5.0的酸性蛋白质，推荐使用阴离子交换，对于等电点大于7.0的碱性蛋白质，推荐使用阳离子交换。
两种模式：一种使目的蛋白结合凝胶，通过梯度洗脱；一种使目的蛋白不结合凝胶，而大部分杂质结合凝胶，则穿过液中含有目的蛋白。
column chromatography（柱色谱）
batch chromatography（批色谱）
c、疏水作用色谱
利用蛋白质、多肽在高盐存在下，可以结合疏水凝胶，而在盐浓度降低时又可以解脱的原理实现分离。
d、亲和色谱
利用蛋白质、多肽与某些配基的特异性相互作用而进行分离。例如：酶-底物，酶-抑制剂，糖蛋白-凝集素，抗原-抗体等。近来发展了金属螯合亲和色谱，用于纯化表面含色氨酸、酪氨酸、组氨酸等的蛋白质以及(His)6-tagged重组蛋白。
亲和色谱分为特异性亲和色谱和组别亲和色谱两类。肝素、凝集素、染料、金属螯合亲和色谱均为组别亲和色谱（同一配基可以结合许多种蛋白质）。
e、反相色谱
常用于蛋白质、多肽的HPLC分析，以及多肽的精细制备分离，分辨率极高，可以分离两种仅相差一个氨基酸的多肽。如血管紧张素（angiotensin）的几个亚型通过反相色谱可以很好地分离。
同一个样品在同一Source 30 RPC柱上进行分离，由于色谱条件进行了改变，色谱图截然不同，说明反相色谱具有高度的选择性。
四、应用举例
例一、一种抗HIV gp120单克隆抗体的Fab片断（E.coli中表达）
分子量：50 kD
等电点：11
表达定位：周质（periplasmic）
纯化策略：渗透压休克提取周质，阳离子交换去除大部分杂质，疏水作用色谱进一步去除杂质，最后用凝胶过滤分离。
例二、重组表达的α-淀粉酶
分子量：49.2 kD；等电点：~6
先采用阴离子交换，再进行疏水作用色谱，最后进行凝胶过滤。
例三、重组表达的乙型肝炎表面抗原的分离
1、史克公司：（酵母细胞表达）
破碎细胞，表面活性剂抽提，离心沉淀、超滤，再经凝胶过滤、阴离子交换，超速离心纯化，脱盐，除菌过滤，吸附，分装。
2、Merck公司：（酵母细胞表达）
破碎细胞，去碎片，抗原用多孔硅玻璃吸附，洗脱，凝胶过滤，甲醛处理，明矾吸附，疫苗。
3、巴斯德研究所：（CHO细胞表达）
培养上清液，离心去碎片，50%硫酸铵沉淀，离心，50%KBr处理，脱盐、超滤浓缩、Sepharose CL-4B凝胶柱分离。
4、Below，M.Bioseparation.1(1991).397工艺
破细胞，去碎片，加硫酸铵至一定浓度后，直接上Butyl-Sepharose 4 FF疏水柱，脱盐后上DEAE-Sepharose FF，超滤浓缩后上Sepharose 4 FF凝胶过滤柱.
例四、尖吻蝮蛇毒凝血酶样酶的分离
（注射用降纤酶）
分子量：38 kD；等电点：~5.4
原工艺：阴离子交换，凝胶过滤，第二次阴离子交换，凝胶过滤
达到95%以上纯度，产量6000-10000单位/克蛇毒。(两周)
新工艺：亲和色谱，阴离子交换，凝胶过滤，亲和色谱（一周）
纯度达到98.5%以上，产量达20000-25000单位/克蛇毒。
尖吻蝮蛇毒经过五个步骤的分离纯化后，获得了单成分降纤酶组分，电泳为一条带，HPLC为单峰。
如上所示，由于每一个步骤均会带来一定的损失，故在可能的情况下应尽量减少下游纯化的步骤（在保证达到所需纯度的前提下）。