免疫学杂志2011年3月第27卷第3期IMMUNOLOGICALJOURNALVol.27No.3Mar.2011
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·论著·
[文章编号]1000-8861（2011）03-0225-04
油菜花粉过敏原的分析、鉴定与纯化
陈小文*，尧荣凤，李建春，易金萍
[摘要]目的
对油菜花粉的变应原组分进行鉴定及初步的分离及纯化。方法
提取油菜花粉粗提液，然后通过十二烷基
油菜花粉粗提液对油菜花粉变应原
采用免疫印迹(Westernblotting)硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离油菜花粉的蛋白质组分并测定其相对分子质量，
法鉴定其变应原成分，并通过离子交换层析对油菜花粉变应原进行初步分离纯化，免疫印迹进行检测。结果15000和10000为主要变应原；离子交换层析结果显示主要过敏原成分主要分布在Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ峰中。结论进行了初步的分离、鉴定和纯化，为临床油菜花粉变态反应疾病的诊断和治疗奠定了基础。
[关键词]油菜花粉；变应原；离子交换层析[中图分类号]R392.8
[文献标识码]A
有10余条蛋白带，其中相对分子质量为30000、25000、15000和10000的蛋白可与油菜花粉过敏性病人血清IgE结合，其中
Analysis,characterizationandpurificationofallergeninoilseedrapepollen
CHENXiaowen,YAORongfeng,LIJianqing,YIJinping
DepartmentofClinicalLaboratory,FirstAffiliatedHospitalofNanchangUniversity,Nanchang330006,China[Abstract]Inthispaper,weaimedtocharacterizeandpurifytheallergeniccomponentsofoilseedrape
pollen.Firstly,rapepollencoarseextractionfluidwasextracted,andtheproteinsandtheirmolecularwereana－lyzedbySDS-PAGE.TheallergeniccomponentsofOilseedrapepollenextractwereseparatedbyion-exchangechromatographywithDE-52,andthenanalyzedbyWestern-blotting.Theextractofoilseedrapepollendisplayed10proteinbands,butonlyfourbands(relativemolecularweightare30000,25000,15000,and10000,re－spectively)couldreactwithIgEintheseraofpatientswithoilseedrapepollenallergy.Amongthefourbands,twoproteinswerethemajorallergen,whoserelativemolecularweightwas15000and10000,andfoundintheⅠ,Ⅱand,Ⅲpeaksofion-exchangechromatography.Ourstudyofpreliminaryisolation,identificationandpurificationoftheallergeniccomponentsinoilseedrapepollenwillbeusedasabasefordiagnosisandtherapyoilseedrapepollenrelatedallergy.
[Keywords]Oilseedrapepollen;Allergen;Ion-exchangechromatography
变态反应性疾病(过敏性疾病)是临床上的常见病、多发病[1]，世界各国变态反应性疾病的总发病率高达10%～30%。在众多的过敏原中，花粉是一种重要的过敏原，它可引起“花粉症”(枯草热)等疾病的发生及相应病症，如鼻粘膜、眼结膜和支气管炎症，甚至哮喘发作。
油菜具有种植面积广泛，花期长的特点，为春季主要花粉之一。我国南方种植的油菜是甘兰型油菜，90％属冬油菜，我国北部、西部和东北部，以及欧洲均以种植白菜型春油菜为主。国内谢水祥和曾继红等分别报道油菜花粉在全年花粉中分别占到了0.94%和1.8%[2-3]。Hemmer[4]等通过皮肤点刺实验和放射性过敏原吸收试验（RAST）进行为期1年的实
基金项目：南昌大学科技基金（医科类）（2009）
作者单位：330006，南昌大学第一附属医院检验科（陈小文，李建春，
验来评估对油菜花粉过敏的频率。发现对花粉过敏患者中有7.1%对油菜花粉过敏。国内未见甘兰型油
菜花粉过敏原的有关报道，因此我们对我国南方种植的甘兰型油菜花粉进行分离纯化，并同时对油菜花粉变应原免疫学特性进行鉴定。
1材料与方法
1.1研究对象
油菜花粉采自南昌市郊；患者血清由
南昌大学第一附属医院提供，其中混合血清来自于
5个对油菜花粉过敏的患者。
1.2主要仪器和试剂垂直电泳槽、转膜电泳槽、凝胶成像及分析系统；层析柱、快速蛋白液相层析系统(FPLC)。丙烯酰胺(Acr)(BBI)；十二烷基硫酸钠(SDS)(BIO-RAD)；预染蛋白Marker；生物素标记的IgE二抗、辣根过氧化物酶标记的亲和素(链霉亲和素)；硝酸纤维膜(NC膜)；DEAE-Cellulose（DE-52）。其余均为国产分析纯试剂。
易金萍）；330006，南昌大学医学院免疫学教研室（尧荣凤）*通信作者：陈小文，E-mail：[1**********]@139.com.
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免疫学杂志2011年3月第27卷第3期IMMUNOLOGICALJOURNALVol.27No.3Mar.2011
1.3油菜花粉粗提液的提取取油菜花粉于液氮中30000、25000、15000和10000，其中相对分子质量为15000和10000的为主要变应原。
2.3油菜花粉变应原的纯化
2.3.1油菜花粉变应原的离子交换层析用对DE-52离子交换层析缓冲液充分透析的油菜花粉粗浸液上柱。如图3结果显示，主要有8个蛋白峰。2.3.2SDS-PAGE和Westernblotting进行检测离子交换后各峰收集的样品进行SDS-PAGE，结果如图4。分析表明，离子交换层析后蛋白主要分布在I峰、II峰、Ⅲ峰和Ⅳ峰中，其中I峰II峰的蛋白条带相同，Ⅲ峰和Ⅳ峰的蛋白条带相同。免疫印迹结果显示（图5），主要变应原组分在Ⅰ峰、Ⅱ峰和Ⅲ峰
。
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充分研磨，按1∶3的比例用丙酮4℃浸泡去脂至上
去丙酮，干燥后称重，以1∶20比例加入Coca’清澄清。
s液(氯化钠5g，碳酸氢钠2.75g，结晶酚4g，加蒸馏水至1000ml，pH8.2)，搅拌提取72h，10000r/min，离心10min，上清对蒸馏水透析[5]，以上均在4℃进行。1.4油菜花粉粗提液进行SDS-PAGE采用SDS-PAGE体系分离粗提液中蛋白质组分并测定相对分子质量。分离胶12%、浓缩胶5%，考马斯亮蓝R-250染色液染色，脱色后用凝胶成像及分析系统拍照并分析其相对分子质量。
1.5油菜花粉变应原的免疫学特性鉴定采用Westernblotting方法对油菜花粉变应原进行免疫学
①用BIO-RAD转移槽将特性鉴定，具体步骤如下：
凝胶中的蛋白条带转移至硝酸纤维膜上；②用TBS洗涤硝酸纤维膜2次，每次5min；③将膜用1％BSA封闭液封闭(4℃过夜)；④用含0.05％吐温-20的TBST洗膜3次，每次5min；⑤加过敏患者混合血清(用1％BSA-TBST进行1:9稀释)，37℃孵育2h；⑥同上洗膜3次后加入1∶1000倍稀释的二抗-生物素，室温孵育2h；⑦同上洗膜3次后加入1∶1000倍稀释的链酶亲和素-HRP，室温孵育2h；⑧同上洗膜5次，DAB（3,3'-二氨基联苯胺）显色，摄像后分析其相对分子质量。
1.6油菜花粉变应原的离子交换层析与鉴定油菜花粉粗提液对0.02mol/LTris-HCl(pH7.2)缓冲液透析24h后，进行DE-52离子交换层析。具体步骤用DE-52离子交换如下：在FPLC层析控制系统下，层析柱，以0.02mol/LpH7.2的Tris-HCl缓冲液充分平衡，透析后花粉粗提液经0.45μm滤膜过滤后上样，待穿透峰后的基线走平后，改用洗脱缓冲液（0.5mol/LNaCl，0.02mol/LTris-HCl）进行线性离子梯度洗脱，流速2ml/min，时间80min，自动收集器收集各峰液。对样品进行SDS-PAGE及Westernblot－ting分析，确定各峰收集液中蛋白的免疫活性部分。
1
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M）Markers;1）Oilseedrapepollenextract.
图1油菜花粉粗提液SDS-PAGE
Fig1SDS-PAGEanalysisofOilseedrapepollenextract
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[1**********]6
12
2结果
2.1油菜花粉粗浸液的SDS-PAGE油菜花粉粗提液进行SDS-PAGE，结果如图1所示，主要有10余条深浅不一的蛋白区带，其中10000区带蛋白含量最丰富。
2.2油菜花粉特异性变应原鉴定用油菜花粉过敏患者血清对油菜花粉粗浸液中的变应原进行免疫印迹（图2）,结果显示，油菜花粉提取液中可与过敏性病人血清IgE结合的蛋白质相对分子质量分别为
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11
M)Markers;1)IgEimmunoblotsofserapoolmixedby5Oilseedrapepollenallergicpatients;2)negativecontrol.
图2油菜花粉粗提液的免疫印迹图Fig2WesternblottingofOilseedrapepollenextract
免疫学杂志2011年3月第27卷第3期
—Manualrun1∶10_UV---Manualrun1∶10_Loglook
IMMUNOLOGICALJOURNALVol.27No.3Mar.2011
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3讨论
油菜花粉中最主要的致敏成分是蛋白质，其中
不仅含有引起花粉症的主要及次要变应原成分，还有大量无变应原作用的其它成分。因此分离纯化花粉主要变应原，确定其免疫学特性是极其重要的。Hemmer等[4]通过免疫印迹显示油菜花粉主要过敏原为6000～8000，12000～14000和33000、42000、51000、58000、61000和70000的蛋白质。其中一
Focke些蛋白可以和桦树花粉过敏原发生交叉反应。
等[6-7]证实6000～8000的过敏原能够有效地被钙结
[***********]0
160
180
200
220t/min
I-ⅡpeakⅢ-Ⅷ
peak
合蛋白抑制，14000的过敏原能和抗profilin特异性的单抗特异地结合，27000～69000为高相对分子质量的糖蛋白。通过亲和层析进一步纯化14500的过敏原，发现该过敏原和桦树Betv2、豚草、烟草profil－in有共同的IgE和IgG表位。因此油菜花粉过敏原可以和桦树和草花粉通过交叉反应而发生过敏反
经硫酸应。国内黄钦田等[8]用水溶液提取油菜花粉，
铵沉淀，凝胶过滤，发现主要变应原组份C是一碱性糖蛋白，相对分子质量为35000。有两种不同等电点区带，为pI7.7和pI7.1，与Focke等的研究一致。Welch等[9]通过放射性过敏原吸收试验（RAST）和RAST抑制实验，免疫印迹和疫印迹抑制实验来观察油菜花粉和草花粉过敏原之间的交叉反应。发现油菜花粉和草花粉过敏原尽管分子大小类似但是免疫学特性不同，没有证据表明它们之间有交叉反应。其他学者也仅发现14000过敏原可能为profilin而具有共同的反应原性。Chardin等[10-11]通过双向电泳和氨基酸微序列测定技术鉴定出3个高相对分子质量的过敏原70000，pI>8、40000，pI=10和80000，pI=5；以及采用基质辅助的激光解吸/电离飞行时间技术鉴定出43000的过敏原为多聚半乳糖醛酸酶，pI分别为6.5和8.5。
本实验采用改进的方法对油菜花粉的蛋白进行提取，利用SDS-PAGE和Westernblotting的方法对油菜花粉提取液进行分离和免疫学鉴定，进一步通过离子交换对主要过敏原进行纯化，也发现油菜花
15000的蛋白，其中15000粉主要过敏原为10000、
过敏原是否为profilin还需进一步进行鉴定。
【参考文献】
[1]
叶世泰,张金谈,乔秉善,等.中国气传和致敏花粉[M].科技出版社,1988:6-30.[2]
谢水祥,刘建新,刘志刚,等.南昌城区大气气传致敏花粉调查[J].环境与健康杂志,2004,21(6):381-383.
图3油菜花粉粗提液离子交换层析图
Fig3Elutiongraphofprimarilypurifiedpollenextractapplied
toDE-52
8
7
6
5
4
3
2
1
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M)Markers;1-8)fractionsfrompeakI-Ⅷ.
图4离子交换层析后各峰液进行SDS-PAGE
Fig4SDS-PAGEanalysisoftheproductsofion-exchange
chromatography(Coomassiebrilliantbluestain)
Mr/103M
[***********]1
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M)Markers;1-3)fractionsfrompeakⅠ,Ⅱ,andⅢ.
图5免疫印迹检测结果
Fig5Westernblotanalysisfortheproductsofion-exchange
chromatography
（下转第231页）
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[4]
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一定浓度下，用CD59-mAb作用于转染后的稳定细胞系，结果分析，Jurkat细胞随着CD59表达量的变
化增殖明显，说明CD59参与Jurkat细胞增殖信号的传导，且当主要激活信号维持一定时，信号的传导与刺激CD59引起的变化关系密切，因此我们认为CD59可作为一种辅助信号介导某些细胞活化事件，从而参与Jurkat细胞的信号转导。
总之，我们采用真核表达质粒构建了高表达CD59基因的重组载体，其表达稳定，并发现CD59与Jurkat细胞的增殖有关，为后续研究CD59此类GPI锚固蛋白通过何种机制启动了蛋白激酶的级联反应及其与T细胞信号转导的机制奠定基础。
【参考文献】
[1]
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（收搞日期：2010-11-12；修回日期：2010-12-21）
（编辑金晓琳刘邱）
!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!
（上接第227页）
[3][4]
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（收稿日期：2010－01－12；修回日期：2010－12－15）
（编辑侯瑞）
免疫学杂志2011年3月第27卷第3期IMMUNOLOGICALJOURNALVol.27No.3Mar.2011
·225·
·论著·
[文章编号]1000-8861（2011）03-0225-04
油菜花粉过敏原的分析、鉴定与纯化
陈小文*，尧荣凤，李建春，易金萍
[摘要]目的
对油菜花粉的变应原组分进行鉴定及初步的分离及纯化。方法
提取油菜花粉粗提液，然后通过十二烷基
油菜花粉粗提液对油菜花粉变应原
采用免疫印迹(Westernblotting)硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离油菜花粉的蛋白质组分并测定其相对分子质量，
法鉴定其变应原成分，并通过离子交换层析对油菜花粉变应原进行初步分离纯化，免疫印迹进行检测。结果15000和10000为主要变应原；离子交换层析结果显示主要过敏原成分主要分布在Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ峰中。结论进行了初步的分离、鉴定和纯化，为临床油菜花粉变态反应疾病的诊断和治疗奠定了基础。
[关键词]油菜花粉；变应原；离子交换层析[中图分类号]R392.8
[文献标识码]A
有10余条蛋白带，其中相对分子质量为30000、25000、15000和10000的蛋白可与油菜花粉过敏性病人血清IgE结合，其中
Analysis,characterizationandpurificationofallergeninoilseedrapepollen
CHENXiaowen,YAORongfeng,LIJianqing,YIJinping
DepartmentofClinicalLaboratory,FirstAffiliatedHospitalofNanchangUniversity,Nanchang330006,China[Abstract]Inthispaper,weaimedtocharacterizeandpurifytheallergeniccomponentsofoilseedrape
pollen.Firstly,rapepollencoarseextractionfluidwasextracted,andtheproteinsandtheirmolecularwereana－lyzedbySDS-PAGE.TheallergeniccomponentsofOilseedrapepollenextractwereseparatedbyion-exchangechromatographywithDE-52,andthenanalyzedbyWestern-blotting.Theextractofoilseedrapepollendisplayed10proteinbands,butonlyfourbands(relativemolecularweightare30000,25000,15000,and10000,re－spectively)couldreactwithIgEintheseraofpatientswithoilseedrapepollenallergy.Amongthefourbands,twoproteinswerethemajorallergen,whoserelativemolecularweightwas15000and10000,andfoundintheⅠ,Ⅱand,Ⅲpeaksofion-exchangechromatography.Ourstudyofpreliminaryisolation,identificationandpurificationoftheallergeniccomponentsinoilseedrapepollenwillbeusedasabasefordiagnosisandtherapyoilseedrapepollenrelatedallergy.
[Keywords]Oilseedrapepollen;Allergen;Ion-exchangechromatography
变态反应性疾病(过敏性疾病)是临床上的常见病、多发病[1]，世界各国变态反应性疾病的总发病率高达10%～30%。在众多的过敏原中，花粉是一种重要的过敏原，它可引起“花粉症”(枯草热)等疾病的发生及相应病症，如鼻粘膜、眼结膜和支气管炎症，甚至哮喘发作。
油菜具有种植面积广泛，花期长的特点，为春季主要花粉之一。我国南方种植的油菜是甘兰型油菜，90％属冬油菜，我国北部、西部和东北部，以及欧洲均以种植白菜型春油菜为主。国内谢水祥和曾继红等分别报道油菜花粉在全年花粉中分别占到了0.94%和1.8%[2-3]。Hemmer[4]等通过皮肤点刺实验和放射性过敏原吸收试验（RAST）进行为期1年的实
基金项目：南昌大学科技基金（医科类）（2009）
作者单位：330006，南昌大学第一附属医院检验科（陈小文，李建春，
验来评估对油菜花粉过敏的频率。发现对花粉过敏患者中有7.1%对油菜花粉过敏。国内未见甘兰型油
菜花粉过敏原的有关报道，因此我们对我国南方种植的甘兰型油菜花粉进行分离纯化，并同时对油菜花粉变应原免疫学特性进行鉴定。
1材料与方法
1.1研究对象
油菜花粉采自南昌市郊；患者血清由
南昌大学第一附属医院提供，其中混合血清来自于
5个对油菜花粉过敏的患者。
1.2主要仪器和试剂垂直电泳槽、转膜电泳槽、凝胶成像及分析系统；层析柱、快速蛋白液相层析系统(FPLC)。丙烯酰胺(Acr)(BBI)；十二烷基硫酸钠(SDS)(BIO-RAD)；预染蛋白Marker；生物素标记的IgE二抗、辣根过氧化物酶标记的亲和素(链霉亲和素)；硝酸纤维膜(NC膜)；DEAE-Cellulose（DE-52）。其余均为国产分析纯试剂。
易金萍）；330006，南昌大学医学院免疫学教研室（尧荣凤）*通信作者：陈小文，E-mail：[1**********]@139.com.
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免疫学杂志2011年3月第27卷第3期IMMUNOLOGICALJOURNALVol.27No.3Mar.2011
1.3油菜花粉粗提液的提取取油菜花粉于液氮中30000、25000、15000和10000，其中相对分子质量为15000和10000的为主要变应原。
2.3油菜花粉变应原的纯化
2.3.1油菜花粉变应原的离子交换层析用对DE-52离子交换层析缓冲液充分透析的油菜花粉粗浸液上柱。如图3结果显示，主要有8个蛋白峰。2.3.2SDS-PAGE和Westernblotting进行检测离子交换后各峰收集的样品进行SDS-PAGE，结果如图4。分析表明，离子交换层析后蛋白主要分布在I峰、II峰、Ⅲ峰和Ⅳ峰中，其中I峰II峰的蛋白条带相同，Ⅲ峰和Ⅳ峰的蛋白条带相同。免疫印迹结果显示（图5），主要变应原组分在Ⅰ峰、Ⅱ峰和Ⅲ峰
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充分研磨，按1∶3的比例用丙酮4℃浸泡去脂至上
去丙酮，干燥后称重，以1∶20比例加入Coca’清澄清。
s液(氯化钠5g，碳酸氢钠2.75g，结晶酚4g，加蒸馏水至1000ml，pH8.2)，搅拌提取72h，10000r/min，离心10min，上清对蒸馏水透析[5]，以上均在4℃进行。1.4油菜花粉粗提液进行SDS-PAGE采用SDS-PAGE体系分离粗提液中蛋白质组分并测定相对分子质量。分离胶12%、浓缩胶5%，考马斯亮蓝R-250染色液染色，脱色后用凝胶成像及分析系统拍照并分析其相对分子质量。
1.5油菜花粉变应原的免疫学特性鉴定采用Westernblotting方法对油菜花粉变应原进行免疫学
①用BIO-RAD转移槽将特性鉴定，具体步骤如下：
凝胶中的蛋白条带转移至硝酸纤维膜上；②用TBS洗涤硝酸纤维膜2次，每次5min；③将膜用1％BSA封闭液封闭(4℃过夜)；④用含0.05％吐温-20的TBST洗膜3次，每次5min；⑤加过敏患者混合血清(用1％BSA-TBST进行1:9稀释)，37℃孵育2h；⑥同上洗膜3次后加入1∶1000倍稀释的二抗-生物素，室温孵育2h；⑦同上洗膜3次后加入1∶1000倍稀释的链酶亲和素-HRP，室温孵育2h；⑧同上洗膜5次，DAB（3,3'-二氨基联苯胺）显色，摄像后分析其相对分子质量。
1.6油菜花粉变应原的离子交换层析与鉴定油菜花粉粗提液对0.02mol/LTris-HCl(pH7.2)缓冲液透析24h后，进行DE-52离子交换层析。具体步骤用DE-52离子交换如下：在FPLC层析控制系统下，层析柱，以0.02mol/LpH7.2的Tris-HCl缓冲液充分平衡，透析后花粉粗提液经0.45μm滤膜过滤后上样，待穿透峰后的基线走平后，改用洗脱缓冲液（0.5mol/LNaCl，0.02mol/LTris-HCl）进行线性离子梯度洗脱，流速2ml/min，时间80min，自动收集器收集各峰液。对样品进行SDS-PAGE及Westernblot－ting分析，确定各峰收集液中蛋白的免疫活性部分。
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M）Markers;1）Oilseedrapepollenextract.
图1油菜花粉粗提液SDS-PAGE
Fig1SDS-PAGEanalysisofOilseedrapepollenextract
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2结果
2.1油菜花粉粗浸液的SDS-PAGE油菜花粉粗提液进行SDS-PAGE，结果如图1所示，主要有10余条深浅不一的蛋白区带，其中10000区带蛋白含量最丰富。
2.2油菜花粉特异性变应原鉴定用油菜花粉过敏患者血清对油菜花粉粗浸液中的变应原进行免疫印迹（图2）,结果显示，油菜花粉提取液中可与过敏性病人血清IgE结合的蛋白质相对分子质量分别为
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M)Markers;1)IgEimmunoblotsofserapoolmixedby5Oilseedrapepollenallergicpatients;2)negativecontrol.
图2油菜花粉粗提液的免疫印迹图Fig2WesternblottingofOilseedrapepollenextract
免疫学杂志2011年3月第27卷第3期
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IMMUNOLOGICALJOURNALVol.27No.3Mar.2011
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3讨论
油菜花粉中最主要的致敏成分是蛋白质，其中
不仅含有引起花粉症的主要及次要变应原成分，还有大量无变应原作用的其它成分。因此分离纯化花粉主要变应原，确定其免疫学特性是极其重要的。Hemmer等[4]通过免疫印迹显示油菜花粉主要过敏原为6000～8000，12000～14000和33000、42000、51000、58000、61000和70000的蛋白质。其中一
Focke些蛋白可以和桦树花粉过敏原发生交叉反应。
等[6-7]证实6000～8000的过敏原能够有效地被钙结
[***********]0
160
180
200
220t/min
I-ⅡpeakⅢ-Ⅷ
peak
合蛋白抑制，14000的过敏原能和抗profilin特异性的单抗特异地结合，27000～69000为高相对分子质量的糖蛋白。通过亲和层析进一步纯化14500的过敏原，发现该过敏原和桦树Betv2、豚草、烟草profil－in有共同的IgE和IgG表位。因此油菜花粉过敏原可以和桦树和草花粉通过交叉反应而发生过敏反
经硫酸应。国内黄钦田等[8]用水溶液提取油菜花粉，
铵沉淀，凝胶过滤，发现主要变应原组份C是一碱性糖蛋白，相对分子质量为35000。有两种不同等电点区带，为pI7.7和pI7.1，与Focke等的研究一致。Welch等[9]通过放射性过敏原吸收试验（RAST）和RAST抑制实验，免疫印迹和疫印迹抑制实验来观察油菜花粉和草花粉过敏原之间的交叉反应。发现油菜花粉和草花粉过敏原尽管分子大小类似但是免疫学特性不同，没有证据表明它们之间有交叉反应。其他学者也仅发现14000过敏原可能为profilin而具有共同的反应原性。Chardin等[10-11]通过双向电泳和氨基酸微序列测定技术鉴定出3个高相对分子质量的过敏原70000，pI>8、40000，pI=10和80000，pI=5；以及采用基质辅助的激光解吸/电离飞行时间技术鉴定出43000的过敏原为多聚半乳糖醛酸酶，pI分别为6.5和8.5。
本实验采用改进的方法对油菜花粉的蛋白进行提取，利用SDS-PAGE和Westernblotting的方法对油菜花粉提取液进行分离和免疫学鉴定，进一步通过离子交换对主要过敏原进行纯化，也发现油菜花
15000的蛋白，其中15000粉主要过敏原为10000、
过敏原是否为profilin还需进一步进行鉴定。
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图3油菜花粉粗提液离子交换层析图
Fig3Elutiongraphofprimarilypurifiedpollenextractapplied
toDE-52
8
7
6
5
4
3
2
1
MMr/103
[**************]
17
11
M)Markers;1-8)fractionsfrompeakI-Ⅷ.
图4离子交换层析后各峰液进行SDS-PAGE
Fig4SDS-PAGEanalysisoftheproductsofion-exchange
chromatography(Coomassiebrilliantbluestain)
Mr/103M
[***********]1
123
M)Markers;1-3)fractionsfrompeakⅠ,Ⅱ,andⅢ.
图5免疫印迹检测结果
Fig5Westernblotanalysisfortheproductsofion-exchange
chromatography
（下转第231页）
免疫学杂志2011年3月第27卷第3期IMMUNOLOGICALJOURNALVol.27No.3Mar.2011
[4]
·231·
一定浓度下，用CD59-mAb作用于转染后的稳定细胞系，结果分析，Jurkat细胞随着CD59表达量的变
化增殖明显，说明CD59参与Jurkat细胞增殖信号的传导，且当主要激活信号维持一定时，信号的传导与刺激CD59引起的变化关系密切，因此我们认为CD59可作为一种辅助信号介导某些细胞活化事件，从而参与Jurkat细胞的信号转导。
总之，我们采用真核表达质粒构建了高表达CD59基因的重组载体，其表达稳定，并发现CD59与Jurkat细胞的增殖有关，为后续研究CD59此类GPI锚固蛋白通过何种机制启动了蛋白激酶的级联反应及其与T细胞信号转导的机制奠定基础。
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（收搞日期：2010-11-12；修回日期：2010-12-21）
（编辑金晓琳刘邱）
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（上接第227页）
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（收稿日期：2010－01－12；修回日期：2010－12－15）
（编辑侯瑞）