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ＪＤｉａｇＰａｔｈｏｌ，Ｊｕｎｅ２０１０，Ｖ０１．１７，Ｎｏ．３
ｄｏｉ：１０．３９６９／ｊ．ｉｓｓ．１００７－８０９６．２０１０．０３．０２２
・综述・
激光捕获显微切割技术新进展母
王文勇１，黄晓峰２，闫庆国１，王伯法１
（第四军医大学基础部１．病理学与病理生理学教研室，２．中心实验室，西安７１００３２）［摘要］
激光捕获显微切割是一种先进的分离特定同质细胞群进行进一步研究的技术，尤其是在需要研究的细胞
占样本细胞数很少时，以及需研究的细胞呈散在分布时，激光捕获显微切割的重要性尤为明显。与免疫组织化学、原位杂交技术、高通量基因分析、蛋白分析技术结合，显微切割技术显示出良好的发展前景。本文简述激光捕获显微切割的基本原理、应用以及可能的发展趋势。
［关键词］激光捕获显微切割；基因芯片；免疫组化；细胞分离［中图分类号】Ｒ３６１
［文献标识码】Ａ［文章编号］１００７—８０９６（２０１０）０３—０２２６—０３
肿瘤组织包括实质细胞和各种间质细胞，而且这两类细若切割组织比较大，则在切割完成后要再加１次激光脉冲将胞的基因表达谱明显不同，因此肿瘤组织细胞纯化对于表达样品弹入装有裂解液的管中。
谱研究而言是必需的。目前肿瘤芯片研究中多直接采用组２ＬＣＭ的应用¨．２．４“】
织匀浆提取核酸，由于间质细胞干扰，使基因芯片结果不能２．１
ＬＣＭ在肿瘤研究中的应用
目前ＬＣＭ已经广泛应用
准确反映肿瘤细胞的转录情况。如何取得纯净的目的细胞于各种肿瘤研究。主要应用包括：①单细胞分析：采用ＬＣＭ进行研究是多年来制约肿瘤研究的瓶颈。目前主要有３种从组织切片中获得单个目的细胞进行相应蛋白组学分析。方法可得到纯净的目的细胞：体外细胞系培养、免疫磁珠分应用ＬＣＭ所获得的单个细胞作为模板可以进行完整的基因选和显微切割。由于显微切割技术是基于病理形态进行细组扩增，并能根据ｃＤＮＡ序列制成相应的探针。②蛋白质大胞纯化，可较好地反映体内细胞的基因表达，因此较前２种分子分析：运用现代免疫组化特异性免疫荧光抗体标记的方技术有其明显的优点。目前，显微切割技术在缩短操作时法，可以了解某一特定蛋白质大分子或细胞因子在肿瘤细胞间、提高纯化目的细胞准确性以及保护核酸和蛋白质分子不中的分布，并且可以根据其阳性或阴性表达的比率对某种病受破坏等方面已得到了明显的改善，激光捕获显微切割变的信息做定性了解。传统上比较可靠的定量研究方法是（ＬＣＭ）是目前最先进的组织纯化病理技术¨。１。
组织匀浆后流式细胞仪检测。但匀浆后细胞破坏较多且不显微切割技术能对组织病理学上确定的细胞群、一个特能保证检验细胞的单一性，应用ＬＣＭ则可以在短时间内提定的细胞、特定的细胞器、特定的染色体进行分子病理学研供较多的比较纯净的细胞，以保证精确的定量分析。③究，从而达到了高度敏感性和高度特异性的统一。尤其是在ＤＮＡ分析：应用ＬＣＭ技术从新鲜、固定组织中或特定方法准需要研究的细胞只占样本中细胞的少数时，以及需研究的细备的细胞中获取的较为纯净的细胞可以在ＤＮＡ水平上进行胞呈散在分布时，显微切割的重要性尤为明显。与免疫组织多种研究，如侵袭性肿瘤杂合性丢失（ＬＯＨ）的检测以及比较化学、原位杂交技术、高通量基因分析、蛋白分析技术结合，基因组杂交（ＣＧＨ）等。周全等通过显微切割方法提取了人显微切割技术显示出良好的发展前景。本文简述了激光捕卵巢浆液性及黏液性交界性肿瘤细胞的ＤＮＡ，分别进行了获显微切割的原理、应用以及可能的发展趋势。
ＰＣＲ，结果发现Ｋ－ｒａｓ基因突变可能在卵巢黏液性交界瘤的１ＬＣＭ的分类和原理¨。１
发病中有一定作用坤Ｊ。④ｍＲＮＡ及ｃＤＮＡ分析：在基因表达１．１
ＬＣＭ的基本原理通过一低能红外激光脉冲激活热塑
相关分析的研究中，组织的异质性对于以往由组织总ＲＮＡ膜一乙烯乙酸乙烯酯（ＥＶＡ）膜（其最大吸收峰接近红外激光开始的ｍＲＮＡ水平的分析有很大干扰。与ＤＮＡ相比，ｍＲＮＡ波长），在直视下选择性地将目标细胞或组织碎片粘到该很容易被ＲＮＡ酶降解，因此在样本的处理中需要一个严格膜上。
的无ＲＮＡ酶的环境。ＬＣＭ减少了准备中的许多环节，可以
１．２
激光显微切割及压力弹射（ＬＭＰＣ）原理ＰＡＬＭ快速、高效的提供纯净细胞，为获取高质量的ｍＲＮＡ打下基Ｍｉｃｒｏｂｅａｍ系统的原理是利用氮激光来切割感兴趣的区域，础。研究表明，无论是新鲜组织标本或石蜡包埋组织标本，然后用激光光压将分离的样品弹入装有裂解液的管盖中，具无论是苏木精一伊红染色或是免疫组化染色的样本均可以体分３种情况：当组织细胞间是相互分离的时候，可以直接用来获得进行ｍＲＮＡ研究的细胞。
用光压弹射；若用激光切割的组织较小的时候，在切割完成２．２在其他领域研究中的应用ＬＣＭ还成功应用于其他一时，样品在切割激光作用力下直接飞入装有裂解液的管中；
些疾病的研究中，如Ｃｒｏｈｎ病、肌萎缩性侧索硬化症、子宫内
‘基金项目：陕西省自然科学基金（ＳＪ０８一ＺＴｌ０）；通讯作者：黄晓峰。Ｅ－ｍａｉｌ：ｈｕａｎｇｘｆ＠ｆｍｍｕ．ｅｄｕ．∞
万方数据
诊断病理学杂志２０１０年６月第１７卷第３期
膜异位症、获得性免疫缺陷综合征、结核病、丙型肝炎等。ＬＣＭ可用于组织的分子表达谱分析、特定细胞群的细胞分子标记物的相互作用研究以及组织微环境内的元素比较。其他应用包括实时ＰＣＲ、蛋白质组和染色体组表达谱分析、混合细胞及毛囊的法医鉴定、发育生物学和胚胎学研究、动物模型及异种移植、传染病生物学、植物细胞生物学等领域的研究。３主要进展
３．１样品制备的标准化样品制备过程包括同定、包埋、切片等步骤，激光显微切割对样品准备有特殊的要求，既要保持其细胞学形态，又要保证其中的ＲＮＡ等生物分子的完整度。样品准备一度曾是阻碍激光显微切割在生命科学研究中推广应用的瓶颈。通过各实验室的技术改良与经验总结，以丙酮或乙醇：乙酸（３：１）混合液等沉淀型同定剂的石蜡包埋、切片技术已经成为标准化方法，普遍适用于各类植物、各种组织，尤其是成熟组织细胞的制片。丙酮固定材料能在一定程度上保持荧光蛋白的荧光活力，为辨别切割目标提供了便利。由于石蜡切片的技术含量要求比冷冻切片低，而且切片机器也比较廉价，同时石蜡切片对细胞组织形态的保存度较高、便于识别，所以用石蜡制片进行激光显微切割的样品准备已成为一项常规操作。
３．２
ＲＮＡ提取和扩增技术的改进归。
对于用激光显微切
割所得的少量细胞，能够进行芯片分析得益于微量ＲＮＡ抽提和高保真ＲＮＡ扩增两项技术。目前最常用的ＰｉｃｏＰｕｒｅ试剂盒抽提激光显微切割所得微量细胞的ＲＮＡ效果较好，而Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ的ＲＮＡ线性扩增试剂盒能够将低于１ｎｇ的总ＲＮＡ作为起始材料，特异性扩增１００万倍，足以进行芯片分析，而且其保真度达到约８０％。对于用交联型固定剂（如福尔马林等）准备的样品，以往由于其在保持ＲＮＡ完整度方面表现极差而无法用于ＲＮＡ分析。Ａｒｃｔｕｒｕｓ公司新推出的Ｐａｒａｄｉｓｅｌ”ＲＮＡ抽提试剂盒可以显著提高从该类样品中抽提出的ＲＮＡ的完整度，在生命科学研究中已有成功应用。用冷冻切片染色试剂盒进行冷冻切片制备，从少量捕获的细胞中成功提取出了ＲＮＡ，通过电泳检测ｒＲＮＡ以及ＲＴ－－ＰＣＲ检测不同丰度基因的水平，结果均表明此种方法提取的ＲＮＡ保持了其完整性。而且，该途径获得的ＲＮＡ可以直接用来合成探针，从而可以实现应用ｃＤＮＡ微阵列对ＬＣＭ获取细胞的上千种基因同时进行检测。范松青等人的研究表明，ＲＮＡ稳定剂为真实可靠的基因表达分析提供了极大便利¨引。对组织的不同种细胞进行基因表达分析，有时需要免疫组化方法引导进行显微切割。但是，免疫组化长时间的染色过程往往导致ｍＲＮＡ的降解。应用一种新的快速免疫过氧化酶技术进行组织切片的免疫组化染色，采用ＬＣＭ分别成功捕获了前列腺基质细胞和分泌细胞。提取其各自的ＲＮＡ，接着应用实时定量ＲＴ．ＰＣＲ技术，比较了前列腺基质细胞和分泌细胞中ｐ２７ｍＲＮＡ表达的差异。在整个操作中，免疫组化染色用２２ｍｉｎ，从每例标本中捕获４０个细胞并进行ＲＮＡ抽提约
万方数据
・２２７・
用４０ｍｉｎ。在对异质性组织的不同种细胞进行基因表达研究中，这一技术可能被广泛应用。大鼠脑组织新鲜冷冻切片采用免疫组化技术，标记出了一氧化氮合酶阳性神经元，用ＬＣＭ成功将此类细胞捕获，并对其进行了ｍＲＮＡ分析。
３．３
ＬＣＭ与其他技术的结合
３．３．１免疫ＬｃＭ【１１
尽管ＬＣＭ应用广泛，但对于常规染
色、固定不加盖玻片的组织切片，其视觉分辨率受到很大限制。而对于那些本身缺乏一定结构特点的复杂组织（如淋巴组织、广泛浸润的腺癌等），要准确分离出某一类细胞几乎是不可能的。有时肿瘤的血管细胞、浸润的造血细胞和周围正常细胞可能会污染显微切割细胞裂解物，对实验结果造成影响。通过采用特殊染色，尤其是免疫组化方法，使目标细胞或想要去除的细胞变得更加醒目，从而解决了上述难题。ＬＣＭ可与免疫组化结合形成免疫ＬＣＭ，通过免疫ＬＣＭ，可使我们很容易区分形态学相似而免疫表型不同的细胞，如Ｂ细胞和Ｔ细胞。根据分泌蛋白和增殖受体抗体的免疫组化染色可进行细胞的功能分类，根据细胞的功能表型选择细胞可研究特定细胞群的遗传变异。通过对动物模型注射荧光金标记物从而在体内预先标记细胞已经开始应用，这可以避免免疫组化染色过程中的ＲＮＡ降解。免疫ＬＣＭ的局限性在于由于抗体与目标蛋白质之间的结合而无法进行蛋白质表
达研究。凝集素探针是免疫标记的一种替代物，它已经显示出除了作为脑微血管标记物的可能性外，还可引导ＬＣＭ进行下游ＲＮＡ研究。凝集索探针的缺点是低亲和力及非特异性结合。可通过使用高亲和力、高浓度抗体和缩短总染色时间来优化免疫ＬＣＭ过程，从而减少ＲＮＡ降解。
３．３．２
ＬＣＭ与定量ＲＴ－ＰＣＲ相结合有研究者采用该技术
发现了一种可以抑制前列腺癌细胞生长的新基因——
ＤＥＲＰＣ（ｄｅｃｒｅａｓｅｄ
ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｉｎｒｅｎａｌａｎｄｐｒｏｓｔａｔｅ
ｃｓｘＩｃｅｒ），在
前列腺癌和肾癌组织中其表达水平显著下降¨“。类似的手段还应用于肺癌发生、体外血管形成、空肠环状平滑肌等的研究，及应用ＬＣＭ对恒河猴子宫内膜的不同种类或不同区域的细胞进行基因表达差异分析，从子宫内膜的功能层和基底层分别分离出腺上皮细胞和基质细胞。ｃＤＮＡ扩增用来增大核酸苣以做进一步的分析，通过一步扩增即可用于检测样本的看家基因（甘油醛一３一磷酸脱氢酶和１８ＳｒＲＮＡ）。紧接着采用差异显示ＲＴ—ＰＣＲ（ＤＤＲＴ—ＰＣＲ），结合细胞类型及所在组织区域，选择６个条带的差异片段进行克隆和序列分析，结果表明，ＬＣＭ捕获细胞产生的ｃＤＮＡ结合ＤＤＲＴ—ＰＣＲ的方法，可以对细胞类型特异性或组织区域特异性的基因表达进行分析，进而能够明确新的基因片段。
３．３．３与蛋白组学结合基因组学产生大量的基因信息，蛋白质组学则补充与完善了基因组对病理生理学、基因功能、分子诊断和抗癌药物发现等方面的诠释。随着人们提出的建立肿瘤发病分子谱的癌基因组解剖计划的逐步实施和组织蛋白质组学计划纳入正常轨道，ＬＣＭ作为其主要支撑技术之一，与建立在基因组提供的大量信息基础之上的ｃＤＮＡ
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ＪＤｉａｇＰａｔｈｏｌ，Ｊｕｎｅ２０１０，Ｖ０１．１７，Ｎｏ．３
微阵列技术和作为组织蛋白质组学计划的高通量的二维凝胶电泳及质谱主要支撑技术融合，将成为或正在成为现实或必然的发展趋势。可以预测，ＬＣＭ耦联蛋白质芯片或高密度蛋白质微阵列、抗体微阵列和小分子微阵列的研究模式，可能对蛋白质组学人类肿瘤表达概貌产生巨大的影响¨“。３．４未来发展ＬＣＭ成功解决了组织异质性问题，且具有迅速、准确等诸多优点，已被广泛应用于肿瘤等疾病基因水平的研究中，并显示出良好的应用前景。但今后可能还需要进行几个主要方面的发展和完善：①理论上，除上述组织及细胞外，ＬＣＭ还可应用于其他所有组织细胞（如脾巨噬细胞、肝Ｋｕｆｆｅｒ细胞等）的分离，但其各自的切片制备、染色等技术方法尚需进行探索；②开发相应的应用程序，仅需输入目标细胞或组织的特异性参数即可实现计算机自动控制ＬＣＭ，从而大大缩减所需的人力和时间；③提高捕获单个细胞的精确度，以减少非目标组织的沾染；④进一步优化快速免疫组化染色的步骤，改进ＤＮＡ和ＲＮＡ抽提技术，实现从少量捕获细胞或组织中获得高质量的核酸。未来技术的发展如触摸屏、细胞自动显微切割和细胞识别软件将带来显微切割新的功能。总之，显微切割技术以其可分离高纯度、微
ｒＬｒＬｒＬｒＬｒＬ
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ｉｎ
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ｇｅｎｅｉｔｓ
ＤＥＲＰＣ
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ｏｎ
小样本的独特优势，并与高通量基因分析和高通量蛋白表达分析技术结合，成为本世纪分子生物学不可缺少的技术。参考文献：
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［２］
王振宁，张学，徐惠绵．激光捕获显微切割技术的原理及应用
・国外期刊文摘・
脊髓乳头状肿瘤２例报告（英）
Ｍｏｂｌｅｙ一１１９７．
Ｂ…／／Ｐａｐｉｌｌａｒｙ
ｔｕｍｏｒｏｆｔｈｅ
ｓｐｉｎａｌｃｏｒｄ．Ｒｅｐｏｒｔｏｆ２ｃａｓｅｓ．ＡｍＪＳｕｒｇＰａｔｈｏｌ，２００９，３３（８）：１１９１
脊髓髓内肿瘤占中枢神经系统肿瘤不足１０％，大多是室管膜瘤和星形细胞瘤。本文报告２例形态学和免疫组化表型比较特殊的脊髓髓内乳头状肿瘤。例１，７岁。胸段脊髓髓内肿瘤。外科切除后３年复发，先后在腰段脊髓、小脑、颞叶和颈静脉孔部位发现转移。初次手术病理诊断：乳头型室管膜瘤。颞叶肿瘤出现后再手术，组织学诊断与胸段脊髓髓内肿瘤相似。８年病程中曾多次放疗和化疗。例２，１７岁。颈段脊髓髓内肿瘤。术后病理诊断：伴有乳头状结构的不典型胶质肿瘤，符合室管膜瘤的特殊亚型。８年中多次复发，行放、化疗，局部复发肿瘤再手术，在没有对比原手术病理切片的情况下诊断为横纹肌样和乳头状脑膜瘤。以后几年中又２次复发，再手术或放、化疗。
这２例肿瘤组织学均显示单一细胞形态的柱状上皮样细胞，围血管排列呈乳头状结构，这样的生长方式至少占肿瘤的一半；其余的瘤组织结构比较致密，血管间细胞片状分布，仍保留上皮样细胞的形态特点。核分裂数不多，可是复发标本中核分
裂多见且有坏死。免疫组化：ＥＭＡ、ＡＥＩ／ＡＥ３和Ｅ—ｃａｄｈｅｒｉｎ均弥漫（＋）。例１，ＧＦＡＰ和－ｒＩ＇Ｒ局灶（＋）。例２，ＧＦＡＰ和ｍ均
（一）。２例ＩＮＩＩ（＋），突触素（一），Ｋｉ－６７增殖指数分别为１０％和２０％。电镜观察有紧密连结、纤毛和微绒毛，符合室管膜瘤的特征。
这２例肿瘤在临床上均多次复发、蛛网膜下腔内播散转移及其共同的病理特征，令人联想到松果体区的乳头状肿瘤、室管膜瘤和脉络从乳头瘤。作者认为这２例脊髓内肿瘤不是一般的室管膜瘤，而是最近介绍的具有室管膜特征的中枢神经系统肿
瘤谱中一个新的独立——脊髓髓内乳头状肿瘤。
（首都医科大学附属宣武医院病理科徐庆中译）
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ｄｏｉ：１０．３９６９／ｊ．ｉｓｓ．１００７－８０９６．２０１０．０３．０２２
・综述・
激光捕获显微切割技术新进展母
王文勇１，黄晓峰２，闫庆国１，王伯法１
（第四军医大学基础部１．病理学与病理生理学教研室，２．中心实验室，西安７１００３２）［摘要］
激光捕获显微切割是一种先进的分离特定同质细胞群进行进一步研究的技术，尤其是在需要研究的细胞
占样本细胞数很少时，以及需研究的细胞呈散在分布时，激光捕获显微切割的重要性尤为明显。与免疫组织化学、原位杂交技术、高通量基因分析、蛋白分析技术结合，显微切割技术显示出良好的发展前景。本文简述激光捕获显微切割的基本原理、应用以及可能的发展趋势。
［关键词］激光捕获显微切割；基因芯片；免疫组化；细胞分离［中图分类号】Ｒ３６１
［文献标识码】Ａ［文章编号］１００７—８０９６（２０１０）０３—０２２６—０３
肿瘤组织包括实质细胞和各种间质细胞，而且这两类细若切割组织比较大，则在切割完成后要再加１次激光脉冲将胞的基因表达谱明显不同，因此肿瘤组织细胞纯化对于表达样品弹入装有裂解液的管中。
谱研究而言是必需的。目前肿瘤芯片研究中多直接采用组２ＬＣＭ的应用¨．２．４“】
织匀浆提取核酸，由于间质细胞干扰，使基因芯片结果不能２．１
ＬＣＭ在肿瘤研究中的应用
目前ＬＣＭ已经广泛应用
准确反映肿瘤细胞的转录情况。如何取得纯净的目的细胞于各种肿瘤研究。主要应用包括：①单细胞分析：采用ＬＣＭ进行研究是多年来制约肿瘤研究的瓶颈。目前主要有３种从组织切片中获得单个目的细胞进行相应蛋白组学分析。方法可得到纯净的目的细胞：体外细胞系培养、免疫磁珠分应用ＬＣＭ所获得的单个细胞作为模板可以进行完整的基因选和显微切割。由于显微切割技术是基于病理形态进行细组扩增，并能根据ｃＤＮＡ序列制成相应的探针。②蛋白质大胞纯化，可较好地反映体内细胞的基因表达，因此较前２种分子分析：运用现代免疫组化特异性免疫荧光抗体标记的方技术有其明显的优点。目前，显微切割技术在缩短操作时法，可以了解某一特定蛋白质大分子或细胞因子在肿瘤细胞间、提高纯化目的细胞准确性以及保护核酸和蛋白质分子不中的分布，并且可以根据其阳性或阴性表达的比率对某种病受破坏等方面已得到了明显的改善，激光捕获显微切割变的信息做定性了解。传统上比较可靠的定量研究方法是（ＬＣＭ）是目前最先进的组织纯化病理技术¨。１。
组织匀浆后流式细胞仪检测。但匀浆后细胞破坏较多且不显微切割技术能对组织病理学上确定的细胞群、一个特能保证检验细胞的单一性，应用ＬＣＭ则可以在短时间内提定的细胞、特定的细胞器、特定的染色体进行分子病理学研供较多的比较纯净的细胞，以保证精确的定量分析。③究，从而达到了高度敏感性和高度特异性的统一。尤其是在ＤＮＡ分析：应用ＬＣＭ技术从新鲜、固定组织中或特定方法准需要研究的细胞只占样本中细胞的少数时，以及需研究的细备的细胞中获取的较为纯净的细胞可以在ＤＮＡ水平上进行胞呈散在分布时，显微切割的重要性尤为明显。与免疫组织多种研究，如侵袭性肿瘤杂合性丢失（ＬＯＨ）的检测以及比较化学、原位杂交技术、高通量基因分析、蛋白分析技术结合，基因组杂交（ＣＧＨ）等。周全等通过显微切割方法提取了人显微切割技术显示出良好的发展前景。本文简述了激光捕卵巢浆液性及黏液性交界性肿瘤细胞的ＤＮＡ，分别进行了获显微切割的原理、应用以及可能的发展趋势。
ＰＣＲ，结果发现Ｋ－ｒａｓ基因突变可能在卵巢黏液性交界瘤的１ＬＣＭ的分类和原理¨。１
发病中有一定作用坤Ｊ。④ｍＲＮＡ及ｃＤＮＡ分析：在基因表达１．１
ＬＣＭ的基本原理通过一低能红外激光脉冲激活热塑
相关分析的研究中，组织的异质性对于以往由组织总ＲＮＡ膜一乙烯乙酸乙烯酯（ＥＶＡ）膜（其最大吸收峰接近红外激光开始的ｍＲＮＡ水平的分析有很大干扰。与ＤＮＡ相比，ｍＲＮＡ波长），在直视下选择性地将目标细胞或组织碎片粘到该很容易被ＲＮＡ酶降解，因此在样本的处理中需要一个严格膜上。
的无ＲＮＡ酶的环境。ＬＣＭ减少了准备中的许多环节，可以
１．２
激光显微切割及压力弹射（ＬＭＰＣ）原理ＰＡＬＭ快速、高效的提供纯净细胞，为获取高质量的ｍＲＮＡ打下基Ｍｉｃｒｏｂｅａｍ系统的原理是利用氮激光来切割感兴趣的区域，础。研究表明，无论是新鲜组织标本或石蜡包埋组织标本，然后用激光光压将分离的样品弹入装有裂解液的管盖中，具无论是苏木精一伊红染色或是免疫组化染色的样本均可以体分３种情况：当组织细胞间是相互分离的时候，可以直接用来获得进行ｍＲＮＡ研究的细胞。
用光压弹射；若用激光切割的组织较小的时候，在切割完成２．２在其他领域研究中的应用ＬＣＭ还成功应用于其他一时，样品在切割激光作用力下直接飞入装有裂解液的管中；
些疾病的研究中，如Ｃｒｏｈｎ病、肌萎缩性侧索硬化症、子宫内
‘基金项目：陕西省自然科学基金（ＳＪ０８一ＺＴｌ０）；通讯作者：黄晓峰。Ｅ－ｍａｉｌ：ｈｕａｎｇｘｆ＠ｆｍｍｕ．ｅｄｕ．∞
万方数据
诊断病理学杂志２０１０年６月第１７卷第３期
膜异位症、获得性免疫缺陷综合征、结核病、丙型肝炎等。ＬＣＭ可用于组织的分子表达谱分析、特定细胞群的细胞分子标记物的相互作用研究以及组织微环境内的元素比较。其他应用包括实时ＰＣＲ、蛋白质组和染色体组表达谱分析、混合细胞及毛囊的法医鉴定、发育生物学和胚胎学研究、动物模型及异种移植、传染病生物学、植物细胞生物学等领域的研究。３主要进展
３．１样品制备的标准化样品制备过程包括同定、包埋、切片等步骤，激光显微切割对样品准备有特殊的要求，既要保持其细胞学形态，又要保证其中的ＲＮＡ等生物分子的完整度。样品准备一度曾是阻碍激光显微切割在生命科学研究中推广应用的瓶颈。通过各实验室的技术改良与经验总结，以丙酮或乙醇：乙酸（３：１）混合液等沉淀型同定剂的石蜡包埋、切片技术已经成为标准化方法，普遍适用于各类植物、各种组织，尤其是成熟组织细胞的制片。丙酮固定材料能在一定程度上保持荧光蛋白的荧光活力，为辨别切割目标提供了便利。由于石蜡切片的技术含量要求比冷冻切片低，而且切片机器也比较廉价，同时石蜡切片对细胞组织形态的保存度较高、便于识别，所以用石蜡制片进行激光显微切割的样品准备已成为一项常规操作。
３．２
ＲＮＡ提取和扩增技术的改进归。
对于用激光显微切
割所得的少量细胞，能够进行芯片分析得益于微量ＲＮＡ抽提和高保真ＲＮＡ扩增两项技术。目前最常用的ＰｉｃｏＰｕｒｅ试剂盒抽提激光显微切割所得微量细胞的ＲＮＡ效果较好，而Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ的ＲＮＡ线性扩增试剂盒能够将低于１ｎｇ的总ＲＮＡ作为起始材料，特异性扩增１００万倍，足以进行芯片分析，而且其保真度达到约８０％。对于用交联型固定剂（如福尔马林等）准备的样品，以往由于其在保持ＲＮＡ完整度方面表现极差而无法用于ＲＮＡ分析。Ａｒｃｔｕｒｕｓ公司新推出的Ｐａｒａｄｉｓｅｌ”ＲＮＡ抽提试剂盒可以显著提高从该类样品中抽提出的ＲＮＡ的完整度，在生命科学研究中已有成功应用。用冷冻切片染色试剂盒进行冷冻切片制备，从少量捕获的细胞中成功提取出了ＲＮＡ，通过电泳检测ｒＲＮＡ以及ＲＴ－－ＰＣＲ检测不同丰度基因的水平，结果均表明此种方法提取的ＲＮＡ保持了其完整性。而且，该途径获得的ＲＮＡ可以直接用来合成探针，从而可以实现应用ｃＤＮＡ微阵列对ＬＣＭ获取细胞的上千种基因同时进行检测。范松青等人的研究表明，ＲＮＡ稳定剂为真实可靠的基因表达分析提供了极大便利¨引。对组织的不同种细胞进行基因表达分析，有时需要免疫组化方法引导进行显微切割。但是，免疫组化长时间的染色过程往往导致ｍＲＮＡ的降解。应用一种新的快速免疫过氧化酶技术进行组织切片的免疫组化染色，采用ＬＣＭ分别成功捕获了前列腺基质细胞和分泌细胞。提取其各自的ＲＮＡ，接着应用实时定量ＲＴ．ＰＣＲ技术，比较了前列腺基质细胞和分泌细胞中ｐ２７ｍＲＮＡ表达的差异。在整个操作中，免疫组化染色用２２ｍｉｎ，从每例标本中捕获４０个细胞并进行ＲＮＡ抽提约
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用４０ｍｉｎ。在对异质性组织的不同种细胞进行基因表达研究中，这一技术可能被广泛应用。大鼠脑组织新鲜冷冻切片采用免疫组化技术，标记出了一氧化氮合酶阳性神经元，用ＬＣＭ成功将此类细胞捕获，并对其进行了ｍＲＮＡ分析。
３．３
ＬＣＭ与其他技术的结合
３．３．１免疫ＬｃＭ【１１
尽管ＬＣＭ应用广泛，但对于常规染
色、固定不加盖玻片的组织切片，其视觉分辨率受到很大限制。而对于那些本身缺乏一定结构特点的复杂组织（如淋巴组织、广泛浸润的腺癌等），要准确分离出某一类细胞几乎是不可能的。有时肿瘤的血管细胞、浸润的造血细胞和周围正常细胞可能会污染显微切割细胞裂解物，对实验结果造成影响。通过采用特殊染色，尤其是免疫组化方法，使目标细胞或想要去除的细胞变得更加醒目，从而解决了上述难题。ＬＣＭ可与免疫组化结合形成免疫ＬＣＭ，通过免疫ＬＣＭ，可使我们很容易区分形态学相似而免疫表型不同的细胞，如Ｂ细胞和Ｔ细胞。根据分泌蛋白和增殖受体抗体的免疫组化染色可进行细胞的功能分类，根据细胞的功能表型选择细胞可研究特定细胞群的遗传变异。通过对动物模型注射荧光金标记物从而在体内预先标记细胞已经开始应用，这可以避免免疫组化染色过程中的ＲＮＡ降解。免疫ＬＣＭ的局限性在于由于抗体与目标蛋白质之间的结合而无法进行蛋白质表
达研究。凝集素探针是免疫标记的一种替代物，它已经显示出除了作为脑微血管标记物的可能性外，还可引导ＬＣＭ进行下游ＲＮＡ研究。凝集索探针的缺点是低亲和力及非特异性结合。可通过使用高亲和力、高浓度抗体和缩短总染色时间来优化免疫ＬＣＭ过程，从而减少ＲＮＡ降解。
３．３．２
ＬＣＭ与定量ＲＴ－ＰＣＲ相结合有研究者采用该技术
发现了一种可以抑制前列腺癌细胞生长的新基因——
ＤＥＲＰＣ（ｄｅｃｒｅａｓｅｄ
ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｉｎｒｅｎａｌａｎｄｐｒｏｓｔａｔｅ
ｃｓｘＩｃｅｒ），在
前列腺癌和肾癌组织中其表达水平显著下降¨“。类似的手段还应用于肺癌发生、体外血管形成、空肠环状平滑肌等的研究，及应用ＬＣＭ对恒河猴子宫内膜的不同种类或不同区域的细胞进行基因表达差异分析，从子宫内膜的功能层和基底层分别分离出腺上皮细胞和基质细胞。ｃＤＮＡ扩增用来增大核酸苣以做进一步的分析，通过一步扩增即可用于检测样本的看家基因（甘油醛一３一磷酸脱氢酶和１８ＳｒＲＮＡ）。紧接着采用差异显示ＲＴ—ＰＣＲ（ＤＤＲＴ—ＰＣＲ），结合细胞类型及所在组织区域，选择６个条带的差异片段进行克隆和序列分析，结果表明，ＬＣＭ捕获细胞产生的ｃＤＮＡ结合ＤＤＲＴ—ＰＣＲ的方法，可以对细胞类型特异性或组织区域特异性的基因表达进行分析，进而能够明确新的基因片段。
３．３．３与蛋白组学结合基因组学产生大量的基因信息，蛋白质组学则补充与完善了基因组对病理生理学、基因功能、分子诊断和抗癌药物发现等方面的诠释。随着人们提出的建立肿瘤发病分子谱的癌基因组解剖计划的逐步实施和组织蛋白质组学计划纳入正常轨道，ＬＣＭ作为其主要支撑技术之一，与建立在基因组提供的大量信息基础之上的ｃＤＮＡ
・２２８・
ＪＤｉａｇＰａｔｈｏｌ，Ｊｕｎｅ２０１０，Ｖ０１．１７，Ｎｏ．３
微阵列技术和作为组织蛋白质组学计划的高通量的二维凝胶电泳及质谱主要支撑技术融合，将成为或正在成为现实或必然的发展趋势。可以预测，ＬＣＭ耦联蛋白质芯片或高密度蛋白质微阵列、抗体微阵列和小分子微阵列的研究模式，可能对蛋白质组学人类肿瘤表达概貌产生巨大的影响¨“。３．４未来发展ＬＣＭ成功解决了组织异质性问题，且具有迅速、准确等诸多优点，已被广泛应用于肿瘤等疾病基因水平的研究中，并显示出良好的应用前景。但今后可能还需要进行几个主要方面的发展和完善：①理论上，除上述组织及细胞外，ＬＣＭ还可应用于其他所有组织细胞（如脾巨噬细胞、肝Ｋｕｆｆｅｒ细胞等）的分离，但其各自的切片制备、染色等技术方法尚需进行探索；②开发相应的应用程序，仅需输入目标细胞或组织的特异性参数即可实现计算机自动控制ＬＣＭ，从而大大缩减所需的人力和时间；③提高捕获单个细胞的精确度，以减少非目标组织的沾染；④进一步优化快速免疫组化染色的步骤，改进ＤＮＡ和ＲＮＡ抽提技术，实现从少量捕获细胞或组织中获得高质量的核酸。未来技术的发展如触摸屏、细胞自动显微切割和细胞识别软件将带来显微切割新的功能。总之，显微切割技术以其可分离高纯度、微
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脊髓髓内肿瘤占中枢神经系统肿瘤不足１０％，大多是室管膜瘤和星形细胞瘤。本文报告２例形态学和免疫组化表型比较特殊的脊髓髓内乳头状肿瘤。例１，７岁。胸段脊髓髓内肿瘤。外科切除后３年复发，先后在腰段脊髓、小脑、颞叶和颈静脉孔部位发现转移。初次手术病理诊断：乳头型室管膜瘤。颞叶肿瘤出现后再手术，组织学诊断与胸段脊髓髓内肿瘤相似。８年病程中曾多次放疗和化疗。例２，１７岁。颈段脊髓髓内肿瘤。术后病理诊断：伴有乳头状结构的不典型胶质肿瘤，符合室管膜瘤的特殊亚型。８年中多次复发，行放、化疗，局部复发肿瘤再手术，在没有对比原手术病理切片的情况下诊断为横纹肌样和乳头状脑膜瘤。以后几年中又２次复发，再手术或放、化疗。
这２例肿瘤组织学均显示单一细胞形态的柱状上皮样细胞，围血管排列呈乳头状结构，这样的生长方式至少占肿瘤的一半；其余的瘤组织结构比较致密，血管间细胞片状分布，仍保留上皮样细胞的形态特点。核分裂数不多，可是复发标本中核分
裂多见且有坏死。免疫组化：ＥＭＡ、ＡＥＩ／ＡＥ３和Ｅ—ｃａｄｈｅｒｉｎ均弥漫（＋）。例１，ＧＦＡＰ和－ｒＩ＇Ｒ局灶（＋）。例２，ＧＦＡＰ和ｍ均
（一）。２例ＩＮＩＩ（＋），突触素（一），Ｋｉ－６７增殖指数分别为１０％和２０％。电镜观察有紧密连结、纤毛和微绒毛，符合室管膜瘤的特征。
这２例肿瘤在临床上均多次复发、蛛网膜下腔内播散转移及其共同的病理特征，令人联想到松果体区的乳头状肿瘤、室管膜瘤和脉络从乳头瘤。作者认为这２例脊髓内肿瘤不是一般的室管膜瘤，而是最近介绍的具有室管膜特征的中枢神经系统肿
瘤谱中一个新的独立——脊髓髓内乳头状肿瘤。
（首都医科大学附属宣武医院病理科徐庆中译）
万方数据