实验十 离子交换层析分离混合氨基酸
一、目的要求
了解离子交换树脂层析的工作原理及操作技术；学会用离子交换树脂层析法分离混合氨基酸。
二、实验原理
在离子交换层析中，蛋白质依据其总(净电荷) 而分离。如果蛋白质在pH7时有净负电荷，那么它将结合到具有正电荷载体的柱上，而不带电荷或带有净正电荷的蛋白质则不结合。对于分离生物大分子物质来说离子交换树脂是不合适的，因为它们不能扩散到树脂的链状结构中。因此，可选用以多糖聚合物如纤维素、葡聚糖为载体的离子交换剂。带正电的二乙基氨基乙基(DEAE)(如DEAE-纤维素或DEAE-葡聚糖) 柱，可用于带负电荷蛋白质(负离子蛋白) 的分离，称为阴离子交换层析。带负电荷的羧甲基(CM)(如CM-纤维素或CM-葡聚糖) 柱，可用于带正电荷蛋白质(阳离子蛋白) 的分离，称为阳离子交换层析。离子交换树脂是一种合成的高聚物，不溶于水，能吸水膨胀。其分离小分子物质如氨基酸、腺苷、腺苷酸等是比较理想的。其高聚物分子由能电离的极性基团及非极性的树脂组成。极性基团上的离子能与溶液中的离子起交换作用，而非极性的树脂本身物理性质不变。通常离子交换树脂按所带的基团分为强酸(—R —SO 3H) 、弱酸(—COOH) 、强碱(—N +≡R 3) 和弱碱(—NH 2) 型。
本实验用磺酸阳离子交换树脂分离酸性氨基酸(天冬氨酸) 、中性氨基酸(组氨酸) 和碱性氨基酸(赖氨酸) 的混合液。在特定的pH 条件下，它们解离程度不同，通过改变洗脱液的pH 或离子强度可将其分别洗脱分离。
三、材料、器材和试剂
1〉材料：
2mg/mL标准氨基酸溶液、混合氨基酸溶液
2〉器材：
20cm ×1cm 层析柱、试管、吸管、洗耳球、恒压洗脱瓶、部分收集器、滴管、电炉、分光光度计、水浴锅。
3〉试剂：
(1) 苯乙烯磺酸钠型树脂
(2)2mol/L盐酸溶液
(3)2mol/L氢氧化钠溶液
(4)柠檬酸-氢氧化钠-盐酸缓冲液（pH5.8，钠离子浓度0.45mol/L）
(5)显色剂
(6)50%乙醇溶液。
四、实验步骤
(1)装柱：取直径1cm 、长度为16~18cm的层析柱，底部垫玻璃棉或海绵圆垫，自顶部注入经处理的上述树脂悬浮液，关闭层析柱出口，待树脂沉降后，放出过量的溶液，再加入一些树脂，至树脂沉积至14~16cm高度即可。于柱子顶部继续加入pH5.8的柠檬酸缓冲液洗涤，使流出液pH 为5.8为止，关闭柱子出口，保持液面高出树脂表面1cm 左右。
(2)加样、洗脱及洗脱液收集：打开出口使缓冲液流出，待液面几乎与树脂表面平齐时关闭出口（不可使树脂表面干掉）。在加样前，树脂顶部放一圆形滤纸片，然后直接将0.5mL 氨基酸混合液仔细加到树脂顶部，打开出口使其缓慢流入柱内，同时开始收集流出液。当样品液面靠近树脂顶端时，即刻加入0.5mL 柠檬酸缓冲液冲洗加样品处。待缓冲液液面靠近树脂顶端时再加入0.5mL 缓冲液。如此重复两次，然后用滴管小心注入柠檬酸缓冲液（切勿搅动床面），并将柱与洗脱收集液瓶和部分收集器相连。开始用试管收集洗脱液，每管收
集1mL ，共收集80管。
(3)氨基酸的鉴定：向各管收集液中加1mL 水合茚三酮显色剂并混匀，在沸水浴中准确加热15min 后冷却至室温，再加1.5mL 的50%乙醇溶液。放置10min 。以蒸馏水为空白，测定570波长的光吸收值。
五、结果处理
(1)以洗脱液各管光吸收值为纵坐标，以洗脱液管号为横坐标绘制洗脱液曲线。
(2)以已知3种氨基酸的标准溶液为样品，按上述方法和条件分别操作，便可得到同样的洗脱曲线。
(3)将混合氨基酸的洗脱曲线与标准氨基酸的洗脱曲线相对照，确定3个峰的位置，及各峰为何种氨基酸。
实验结果：
(1) 洗脱液曲线：
(3)3个吸收峰：2.221、2.443、1.638，对应的氨基酸为：天冬氨酸、组氨酸、赖氨酸。
实验十 离子交换层析分离混合氨基酸
一、目的要求
了解离子交换树脂层析的工作原理及操作技术；学会用离子交换树脂层析法分离混合氨基酸。
二、实验原理
在离子交换层析中，蛋白质依据其总(净电荷) 而分离。如果蛋白质在pH7时有净负电荷，那么它将结合到具有正电荷载体的柱上，而不带电荷或带有净正电荷的蛋白质则不结合。对于分离生物大分子物质来说离子交换树脂是不合适的，因为它们不能扩散到树脂的链状结构中。因此，可选用以多糖聚合物如纤维素、葡聚糖为载体的离子交换剂。带正电的二乙基氨基乙基(DEAE)(如DEAE-纤维素或DEAE-葡聚糖) 柱，可用于带负电荷蛋白质(负离子蛋白) 的分离，称为阴离子交换层析。带负电荷的羧甲基(CM)(如CM-纤维素或CM-葡聚糖) 柱，可用于带正电荷蛋白质(阳离子蛋白) 的分离，称为阳离子交换层析。离子交换树脂是一种合成的高聚物，不溶于水，能吸水膨胀。其分离小分子物质如氨基酸、腺苷、腺苷酸等是比较理想的。其高聚物分子由能电离的极性基团及非极性的树脂组成。极性基团上的离子能与溶液中的离子起交换作用，而非极性的树脂本身物理性质不变。通常离子交换树脂按所带的基团分为强酸(—R —SO 3H) 、弱酸(—COOH) 、强碱(—N +≡R 3) 和弱碱(—NH 2) 型。
本实验用磺酸阳离子交换树脂分离酸性氨基酸(天冬氨酸) 、中性氨基酸(组氨酸) 和碱性氨基酸(赖氨酸) 的混合液。在特定的pH 条件下，它们解离程度不同，通过改变洗脱液的pH 或离子强度可将其分别洗脱分离。
三、材料、器材和试剂
1〉材料：
2mg/mL标准氨基酸溶液、混合氨基酸溶液
2〉器材：
20cm ×1cm 层析柱、试管、吸管、洗耳球、恒压洗脱瓶、部分收集器、滴管、电炉、分光光度计、水浴锅。
3〉试剂：
(1) 苯乙烯磺酸钠型树脂
(2)2mol/L盐酸溶液
(3)2mol/L氢氧化钠溶液
(4)柠檬酸-氢氧化钠-盐酸缓冲液（pH5.8，钠离子浓度0.45mol/L）
(5)显色剂
(6)50%乙醇溶液。
四、实验步骤
(1)装柱：取直径1cm 、长度为16~18cm的层析柱，底部垫玻璃棉或海绵圆垫，自顶部注入经处理的上述树脂悬浮液，关闭层析柱出口，待树脂沉降后，放出过量的溶液，再加入一些树脂，至树脂沉积至14~16cm高度即可。于柱子顶部继续加入pH5.8的柠檬酸缓冲液洗涤，使流出液pH 为5.8为止，关闭柱子出口，保持液面高出树脂表面1cm 左右。
(2)加样、洗脱及洗脱液收集：打开出口使缓冲液流出，待液面几乎与树脂表面平齐时关闭出口（不可使树脂表面干掉）。在加样前，树脂顶部放一圆形滤纸片，然后直接将0.5mL 氨基酸混合液仔细加到树脂顶部，打开出口使其缓慢流入柱内，同时开始收集流出液。当样品液面靠近树脂顶端时，即刻加入0.5mL 柠檬酸缓冲液冲洗加样品处。待缓冲液液面靠近树脂顶端时再加入0.5mL 缓冲液。如此重复两次，然后用滴管小心注入柠檬酸缓冲液（切勿搅动床面），并将柱与洗脱收集液瓶和部分收集器相连。开始用试管收集洗脱液，每管收
集1mL ，共收集80管。
(3)氨基酸的鉴定：向各管收集液中加1mL 水合茚三酮显色剂并混匀，在沸水浴中准确加热15min 后冷却至室温，再加1.5mL 的50%乙醇溶液。放置10min 。以蒸馏水为空白，测定570波长的光吸收值。
五、结果处理
(1)以洗脱液各管光吸收值为纵坐标，以洗脱液管号为横坐标绘制洗脱液曲线。
(2)以已知3种氨基酸的标准溶液为样品，按上述方法和条件分别操作，便可得到同样的洗脱曲线。
(3)将混合氨基酸的洗脱曲线与标准氨基酸的洗脱曲线相对照，确定3个峰的位置，及各峰为何种氨基酸。
实验结果：
(1) 洗脱液曲线：
(3)3个吸收峰：2.221、2.443、1.638，对应的氨基酸为：天冬氨酸、组氨酸、赖氨酸。