第56卷第3期 2010年6月武汉大学学报(理学版) J. W uhan U niv. (N at. Sci. Ed. ) V o l. 56N o. 3 June 2010, 289~292
文章编号:1671 8836(2010) 03 0289 04
三明治 法制备牛血红蛋白分子印迹膜
王 晖, 方桂杰, 丁安子, 谢卫红
(湖北工业大学生物工程学院/发酵工程教育部重点实验室, 湖北武汉430068)
摘 要:以牛血红蛋白为模板蛋白、丙烯酰胺为功能单体、N , N ! 亚甲基双丙烯酰胺为交联单体、过硫酸铵为引发剂, 采用 三明治 法制备了牛血红蛋白分子印迹膜. 确定了最佳的实验条件, 功能单体与交联剂的摩尔配比为40∀1, 洗脱剂为1%SDS 10%H A c, 其对模板蛋白的洗脱率为47%.结果表明, 所制备的蛋白质印迹膜在3. 5h 和2. 9 mol/L 重结合蛋白浓度时, 对模板蛋白的吸附量达到最大. 该分子印迹膜对模板蛋白的吸附量(0. 22nmo l/cm 2) 明显高于非印迹膜对模板蛋白的吸附量(0. 10nmol/cm 2) , 对血红蛋白、肌红蛋白、溶菌酶和牛血清白蛋白的印迹因子值分别为2. 5, 1. 7, 1. 3和1. 2, 说明它对模板蛋白具有一定选择性.
关 键 词:分子印迹; 血红蛋白; 丙烯酰胺; 分子识别中图分类号:O 658 文献标识码:A
0 引 言
分子印迹技术是一种合成人工抗体的方法[1~3]. 采用分子印迹技术制备对目标蛋白质分子具有优异识别能力的分子印迹膜, 制成可替代抗体的分子识别元件, 是近年来生物芯片和生物传感器领域的一个新的研究方向.
Shi 等将蛋白质吸附于云母表面, 以二糖分子为功能单体, 通过氢键与蛋白质络合, 再将一个平坦的含氟聚合物薄膜通过发光放电等离子体与糖分子交联沉积, 得到具有与蛋白质形状匹配的纳米空穴的分子印迹膜. 姚守拙课题组通过溶胶 凝胶和化学沉积的方法, 在压电石英晶体 金电极表面制备了可识别人血清白蛋白的分子印迹膜, 其传感器的信号可随着被测蛋白浓度的增加而增加. T ai 等采用多肽印迹法制备了检测登革热病毒的人工抗体膜. Chou 课题组[8~10]在两块玻璃片之间制得了可识别核糖核酸酶与肌红蛋白的分子印迹膜.
与文献报道方法不同, 本文采用蛋白质电泳常用的制胶原料丙烯酰胺作为功能单体, 采用 三明治 法制备蛋白质分子印迹膜. 丙烯酰胺是水溶性功能单体, 与蛋白质具有很好的相容性, 聚合过程中不易造成蛋白质变性. 此外, 丙烯酰胺的交联聚合条件
[5]
[6, 7]
[4]
温和, 也适合生物大分子的分子印迹.
1 实验部分
1. 1 实验材料
牛血红蛋白、肌红蛋白、溶菌酶、牛血清白蛋白均为电泳纯试剂; 丙烯酰胺均为分析纯试剂. 1. 2 牛血红蛋白分子印迹膜的制备
用磷酸盐缓冲液(PBS, 0. 01mo l/L pH 6. 4) 配制0. 168 mo l/L 的牛血红蛋白溶液, 称取一定量丙烯酰胺加到装有1mL 上述蛋白溶液的离心管中, 摇匀, 于冰箱中4#放置过夜. 再加入N, N ! 亚甲基双丙烯酰胺, 超声脱气5m in, 通氮气5min, 依次加入引发剂过硫酸铵10 L 和催化剂四甲基二乙胺1 L, 混匀. 用移液枪吸取混合好的聚合液缓缓滴加在载玻片上, 盖上盖玻片, 使液滴完全被盖住, 尽量保证无气泡, 聚合2~3h, 成膜后轻轻揭开盖玻片, 得到与盖玻片面积相等的聚合物膜. 非印迹膜的制备过程与印迹膜的基本相同, 只是聚合过程中不加模板分子牛血红蛋白. 1. 3 模板分子的洗脱
将分子印迹膜(M IPM ) 放入小烧杯中, 每次吸取2mL 洗脱液加入其中, 摇动3~4h 后测其紫外
收稿日期:2009 10 25 通信联系人 E mail:w eih ong. xie@yahoo. com. cn
基金项目:国家自然科学基金资助项目(20875024) ; 湖北省教育厅重大研究项目(Z20081402) 作者简介:王 晖, 男, 硕士生, 现从事蛋白质分子印迹研究. E mail w hu i_1028@yahoo. com. cn
290武汉大学学报(理学版) 第56卷
可见吸光度值, 直至检测不到吸收峰为止, 最后用去离子水冲洗掉残留的洗脱剂. 通过测定洗脱液中蛋白的含量, 来判断洗脱液的洗脱效率. 所选洗脱液为1m ol/L NaCl, 0. 1mol/L PBS, 1%SDS 10%H A c. 对非印迹膜(NIPM ) 进行同样的洗脱液处理. 1. 4 模板蛋白的重结合实验
将经过洗脱过程的MIPM 和NIPM 分别放入加有重结合模板蛋白溶液的6孔板中, 每隔一定时间利用紫外 可见分光光度计测量6孔板中重结合模板蛋白溶液的吸光度值, 根据吸附量公式计算MIPM 和NIPM 对蛋白的吸附量. 吸附量:
Q 吸=(c 0-c 余) ∃V/S
其中Q 吸(mo l/cm 2) 为M IPM 或NIPM 吸附模板蛋白的吸附量; c 0(m ol/L) 为重结合模板蛋白溶液的浓度; c 余(m ol/L) 为结合一段时间后6孔板中重结合模板蛋白溶液的浓度; V (L) 为重结合模板蛋白溶液的体积; S (cm ) 为膜面积.
1. 5 分子印迹膜的选择性吸附实验
将MIPM 和NIPM 分别放入盛有不同种类蛋白(溶菌酶、牛血清蛋白、肌红蛋白、牛血红蛋白) 溶液的6孔板中, 静置4h 后, 利用紫外 可见分光光度计测量不同种类重结合蛋白溶液的浓度, 计算吸
m 功能单体/g 0. 1200. 0900. 0600. 045
m 交联单体/g 0. 00320. 00320. 00320. 0032
V 缓冲液/mL n 功能单体∀n 交联单体
1. 01. 01. 01. 0
80∀160∀140∀130∀1
2
附量. 通过印迹因子(imprinting facto r, ) 的值来评价印迹膜对模板蛋白的识别性能:
=Q M IPM 吸/Q NIPM 吸
式中:Q MIPM 吸和Q N IPM 吸分别为印迹膜和非印迹膜对某种蛋白质溶液的吸附量.
2 结果与分析
2. 1 制备印迹膜实验条件的确定
2. 1. 1 功能单体与交联剂之间的配比
在制胶过程中, 凝胶度T (%) 即功能单体和交联单体在总凝胶溶液中所占的百分比决定着凝胶的物理性状. 而单体浓度过高时凝胶硬而脆, 容易破碎; 单体浓度太小, 凝胶稀软.
本实验通过固定交联单体的量, 改变功能单体丙烯酰胺的量来调节凝胶度, 寻找适合血红蛋白分子印迹膜成膜的最佳凝胶浓度和功能单体与交联剂之间最佳配比. 配制了一定比例的功能单体和交联单体的聚合液, 按实验方法制备聚合物膜, 实验结果如表1所示. 结果表明, 功能单体与交联单体比例为40∀1, 凝胶度为6. 3%时, 所制成的膜物理性状最好.
T /%12. 39. 36. 34. 8
成膜状态
不成膜, 机械强度较高, 成硬块状, 不能揭开玻片载体
能成膜, 膜的颜色为无色透明, 但膜较为粘稠, 不易移取
能成膜, 膜的颜色为无色透明, 柔软度较好, 易于移取
能成膜, 膜为乳白色, 揭膜时, 膜易碎
表1 不同凝胶度时的成膜状态
2. 1. 2 洗脱条件
模板的洗脱效率决定着蛋白质分子印迹膜的吸附容量, 所以在洗脱过程中要尽可能多地将模板蛋白分子从聚合膜上洗脱下来以得到更多数量的印迹位点. 本实验用1%SDS 10%H Ac 溶液时, 洗脱量最大(2. 9nmol) , 洗脱效率为47%; 0. 1mo l/L PBS 溶液次之, 洗脱量为1. 4nm ol, 洗脱效率为17%; 而0. 1mo l/L NaCl 溶液洗脱量最小(0. 9nm ol) , 洗脱效率为11%.
2. 2 牛血红蛋白的吸附量与吸附时间的关系
图1显示, 在2. 5h 内, 印迹膜对牛血红蛋白的吸附量随着时间的增加而明显增大. 这段时间内印迹膜存在着大量空的印迹空穴, 因此印迹膜的吸附速率高, 曲线的增长斜率较大. 再延长吸附时间, 吸附量无明显的增加, 基本达到平衡. 印迹膜达到静态
吸附平衡时对模板蛋白的吸附量为0. 21~0. 22nmol/cm . 非印迹膜对牛血红蛋白也有一定吸附量, 随着时间的增加也有一定程度的增加, 但吸附量和增加幅度明显低于印迹膜.
这是由于非印迹膜没
2
图1 M IPM 和N IPM 对牛血红蛋白的吸附量
与吸附时间的关系曲线
第3期王 晖等: 三明治 法制备牛血红蛋白分子印迹膜291
有印迹空穴, 对模板蛋白的吸附主要是依靠凝胶膜上功能单体对蛋白的非特异性吸附造成的. 非印迹膜对牛血红蛋白的吸附量为0. 09~0. 1nm ol/cm 2. 2. 3 饱和吸附曲线
将印迹膜分别浸泡在不同浓度(0. 3~3. 9 mol/L) 的牛血红蛋白溶液中4h, 根据测得的蛋白溶液的吸光度值计算被印迹膜吸附的蛋白的量, 结果如图2所示. 起初, 印迹膜的吸附量随模板蛋白溶液浓度的增加而增加, 当重结合蛋白的浓度达到2. 2 mol/L 时, 吸附曲线逐渐趋向饱和, 表明印迹膜达到了最大吸附量. 而非印迹膜的吸附容量明显较小
.
模板蛋白的吸附量高于微接触法制备印迹膜的蛋白吸附量, 且可采用蛋白质染色的方法进行定量分析
.
图3 牛血红蛋白分子印迹膜对不同蛋白的吸附情况
3 结 论
本工作采用丙烯酰胺为功能单体, 利用 三明治 法成功制备了对牛血红蛋白具有选择性吸附的分子印迹膜. 结果表明丙烯酰胺是一种较好的制备蛋白质印迹膜的功能单体. 在制膜过程中, 丙烯酰胺与交联单体的配比很重要, 在一定的凝胶浓度下才
图2 牛血红蛋白分子印迹膜的饱和吸附曲线
2. 4 吸附的选择性
以印迹膜和非印迹膜对不同种类蛋白进行吸附, 结果如图3所示. 可以看出, 印迹膜对相同浓度的牛血清蛋白、溶菌酶、肌红蛋白和牛血红蛋白的吸附量依次为0. 08, 0. 10, 0. 14, 0. 21nmo l/cm . 在3个非模板蛋白中, 印迹膜对肌红蛋白的吸附量较高, 其原因是由于肌红蛋白与血红蛋白具有相似的结构, 但印迹膜对模板蛋白 牛血红蛋白的吸附量仍是最高的. 印迹膜对牛血清蛋白、溶菌酶、肌红蛋白和牛血红蛋白的 值分别为1. 2, 1. 3, 1. 7和2. 5, 说明印迹膜对牛血红蛋白具有一定的选择性. 非印迹膜对蛋白溶液的吸附量差别不大, 均在0. 07~0. 08nm ol/cm 2之间, 表明非印迹膜对蛋白没有选择性. 利用化学沉积法在石英晶体 金电极上制备的蛋白分子印迹膜对模板蛋白的响应信号比非模板蛋白高2~5倍
[4]
2
能得到柔韧性好的膜. 模板蛋白的洗脱也是影响分子印迹膜吸附量的原因之一. 本工作采用的SDS H Ac 洗脱液洗脱效率仍不够理想, 后续工作将进一步优化洗脱条件或采用表面印迹的方法, 希望使产生的印迹孔穴大部分暴露出来, 从而提高分子印迹膜的吸附量. 本文方法制备的分子印迹膜与前文几种方法制备的分子印迹膜的选择性相当, 制备的印迹膜每cm 吸附蛋白的量高于已报道的印迹膜, 且可以采用染色的方法进行分析. 总之, 该方法是一种简便、经济的制备生物大分子印迹膜的方法. 随着制备条件的不断优化, 分子印迹膜的识别性能将不断提高, 该方法制备的蛋白质分子印迹膜可望发展成检测蛋白质的芯片.
2
参考文献:
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M olecular ly imprinted po lymer s (M IPs ) :Sensing , an
, 本文方法制备的印迹膜对模板蛋白的响
应信号比非模板蛋白高1~3倍. 利用微接触法制备
的分子印迹膜对模板蛋白肌红蛋白和非模板蛋白血红蛋白、抗兔抗体和人血清白蛋白的 值分别为5. 83, 1. 70, 2. 20和1. 19, 略高于本文报道的 值. 但微接触法制备的印迹膜吸附模板蛋白的量很低, 只能依靠化学发光和荧光的方法进行检测, 对仪器和试剂要求较高. 本文报道方法制备的印迹膜对
[9]
292武汉大学学报(理学版)
ex plosiv e new oppo rtunity [J]. Or g Biol Chem , 2007, 5:3233 3244.
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sero log ic tests for the early diagnosis o f deng ue v ir us
Sandwich Prepare of a Bovine Hemoglobin Molecularly
Imprinted Polymer Membrane
WANG Hui, FANG Guijie, DING Anzi, XIE Weihong
(Inst itute of Bioengineering , H ubei U niversity of T echnolog y/Key Labor ator y o f Fermentation Eng ineer ing,
M inistr y of Education of China, Wuhan 430068, Hubei, China)
Abstract:A hemo globin molecularly im pr inted polym er membrane (M IPM ) w as prepared o n a g lass chip by using w ater so luble acrylamide as a functional mo nom er and N , N ! methy lenebisacry lam ide as a cro sslinker. T he optimal ratio of functional mo nom er to crosslinker monom er to form a g ood membrane is 40∀1. 1%SDS 10%H Ac w as the most effectiv e w ashing solutio n w hich can remove 47%o f the tem plate. The absorptio n reached a m ax imal value at 3. 5h and at 2. 9 m ol/L rebinding concentr ation. The M IPM show ed hig her abso rb capacity (0. 22nmo l/cm 2) to the template protein than that (0. 10nm ol/cm 2) of the no n im printed polym er membrane (NIPM ). The selectivity exper im ent car ried out in differ ent protein so lutions show ed that M IPM absor bed m ore template protein than tho se that had not been imprinted. The im pr inting factor for hem og lobin, my oglo bin, lysozy me and BSA were 2. 5, 1. 7, 1. 3and 1. 2respectively.
Key words:mo lecular ly im printing; hemog lobin; acry lam ide; m olecular recognition
第56卷第3期 2010年6月武汉大学学报(理学版) J. W uhan U niv. (N at. Sci. Ed. ) V o l. 56N o. 3 June 2010, 289~292
文章编号:1671 8836(2010) 03 0289 04
三明治 法制备牛血红蛋白分子印迹膜
王 晖, 方桂杰, 丁安子, 谢卫红
(湖北工业大学生物工程学院/发酵工程教育部重点实验室, 湖北武汉430068)
摘 要:以牛血红蛋白为模板蛋白、丙烯酰胺为功能单体、N , N ! 亚甲基双丙烯酰胺为交联单体、过硫酸铵为引发剂, 采用 三明治 法制备了牛血红蛋白分子印迹膜. 确定了最佳的实验条件, 功能单体与交联剂的摩尔配比为40∀1, 洗脱剂为1%SDS 10%H A c, 其对模板蛋白的洗脱率为47%.结果表明, 所制备的蛋白质印迹膜在3. 5h 和2. 9 mol/L 重结合蛋白浓度时, 对模板蛋白的吸附量达到最大. 该分子印迹膜对模板蛋白的吸附量(0. 22nmo l/cm 2) 明显高于非印迹膜对模板蛋白的吸附量(0. 10nmol/cm 2) , 对血红蛋白、肌红蛋白、溶菌酶和牛血清白蛋白的印迹因子值分别为2. 5, 1. 7, 1. 3和1. 2, 说明它对模板蛋白具有一定选择性.
关 键 词:分子印迹; 血红蛋白; 丙烯酰胺; 分子识别中图分类号:O 658 文献标识码:A
0 引 言
分子印迹技术是一种合成人工抗体的方法[1~3]. 采用分子印迹技术制备对目标蛋白质分子具有优异识别能力的分子印迹膜, 制成可替代抗体的分子识别元件, 是近年来生物芯片和生物传感器领域的一个新的研究方向.
Shi 等将蛋白质吸附于云母表面, 以二糖分子为功能单体, 通过氢键与蛋白质络合, 再将一个平坦的含氟聚合物薄膜通过发光放电等离子体与糖分子交联沉积, 得到具有与蛋白质形状匹配的纳米空穴的分子印迹膜. 姚守拙课题组通过溶胶 凝胶和化学沉积的方法, 在压电石英晶体 金电极表面制备了可识别人血清白蛋白的分子印迹膜, 其传感器的信号可随着被测蛋白浓度的增加而增加. T ai 等采用多肽印迹法制备了检测登革热病毒的人工抗体膜. Chou 课题组[8~10]在两块玻璃片之间制得了可识别核糖核酸酶与肌红蛋白的分子印迹膜.
与文献报道方法不同, 本文采用蛋白质电泳常用的制胶原料丙烯酰胺作为功能单体, 采用 三明治 法制备蛋白质分子印迹膜. 丙烯酰胺是水溶性功能单体, 与蛋白质具有很好的相容性, 聚合过程中不易造成蛋白质变性. 此外, 丙烯酰胺的交联聚合条件
[5]
[6, 7]
[4]
温和, 也适合生物大分子的分子印迹.
1 实验部分
1. 1 实验材料
牛血红蛋白、肌红蛋白、溶菌酶、牛血清白蛋白均为电泳纯试剂; 丙烯酰胺均为分析纯试剂. 1. 2 牛血红蛋白分子印迹膜的制备
用磷酸盐缓冲液(PBS, 0. 01mo l/L pH 6. 4) 配制0. 168 mo l/L 的牛血红蛋白溶液, 称取一定量丙烯酰胺加到装有1mL 上述蛋白溶液的离心管中, 摇匀, 于冰箱中4#放置过夜. 再加入N, N ! 亚甲基双丙烯酰胺, 超声脱气5m in, 通氮气5min, 依次加入引发剂过硫酸铵10 L 和催化剂四甲基二乙胺1 L, 混匀. 用移液枪吸取混合好的聚合液缓缓滴加在载玻片上, 盖上盖玻片, 使液滴完全被盖住, 尽量保证无气泡, 聚合2~3h, 成膜后轻轻揭开盖玻片, 得到与盖玻片面积相等的聚合物膜. 非印迹膜的制备过程与印迹膜的基本相同, 只是聚合过程中不加模板分子牛血红蛋白. 1. 3 模板分子的洗脱
将分子印迹膜(M IPM ) 放入小烧杯中, 每次吸取2mL 洗脱液加入其中, 摇动3~4h 后测其紫外
收稿日期:2009 10 25 通信联系人 E mail:w eih ong. xie@yahoo. com. cn
基金项目:国家自然科学基金资助项目(20875024) ; 湖北省教育厅重大研究项目(Z20081402) 作者简介:王 晖, 男, 硕士生, 现从事蛋白质分子印迹研究. E mail w hu i_1028@yahoo. com. cn
290武汉大学学报(理学版) 第56卷
可见吸光度值, 直至检测不到吸收峰为止, 最后用去离子水冲洗掉残留的洗脱剂. 通过测定洗脱液中蛋白的含量, 来判断洗脱液的洗脱效率. 所选洗脱液为1m ol/L NaCl, 0. 1mol/L PBS, 1%SDS 10%H A c. 对非印迹膜(NIPM ) 进行同样的洗脱液处理. 1. 4 模板蛋白的重结合实验
将经过洗脱过程的MIPM 和NIPM 分别放入加有重结合模板蛋白溶液的6孔板中, 每隔一定时间利用紫外 可见分光光度计测量6孔板中重结合模板蛋白溶液的吸光度值, 根据吸附量公式计算MIPM 和NIPM 对蛋白的吸附量. 吸附量:
Q 吸=(c 0-c 余) ∃V/S
其中Q 吸(mo l/cm 2) 为M IPM 或NIPM 吸附模板蛋白的吸附量; c 0(m ol/L) 为重结合模板蛋白溶液的浓度; c 余(m ol/L) 为结合一段时间后6孔板中重结合模板蛋白溶液的浓度; V (L) 为重结合模板蛋白溶液的体积; S (cm ) 为膜面积.
1. 5 分子印迹膜的选择性吸附实验
将MIPM 和NIPM 分别放入盛有不同种类蛋白(溶菌酶、牛血清蛋白、肌红蛋白、牛血红蛋白) 溶液的6孔板中, 静置4h 后, 利用紫外 可见分光光度计测量不同种类重结合蛋白溶液的浓度, 计算吸
m 功能单体/g 0. 1200. 0900. 0600. 045
m 交联单体/g 0. 00320. 00320. 00320. 0032
V 缓冲液/mL n 功能单体∀n 交联单体
1. 01. 01. 01. 0
80∀160∀140∀130∀1
2
附量. 通过印迹因子(imprinting facto r, ) 的值来评价印迹膜对模板蛋白的识别性能:
=Q M IPM 吸/Q NIPM 吸
式中:Q MIPM 吸和Q N IPM 吸分别为印迹膜和非印迹膜对某种蛋白质溶液的吸附量.
2 结果与分析
2. 1 制备印迹膜实验条件的确定
2. 1. 1 功能单体与交联剂之间的配比
在制胶过程中, 凝胶度T (%) 即功能单体和交联单体在总凝胶溶液中所占的百分比决定着凝胶的物理性状. 而单体浓度过高时凝胶硬而脆, 容易破碎; 单体浓度太小, 凝胶稀软.
本实验通过固定交联单体的量, 改变功能单体丙烯酰胺的量来调节凝胶度, 寻找适合血红蛋白分子印迹膜成膜的最佳凝胶浓度和功能单体与交联剂之间最佳配比. 配制了一定比例的功能单体和交联单体的聚合液, 按实验方法制备聚合物膜, 实验结果如表1所示. 结果表明, 功能单体与交联单体比例为40∀1, 凝胶度为6. 3%时, 所制成的膜物理性状最好.
T /%12. 39. 36. 34. 8
成膜状态
不成膜, 机械强度较高, 成硬块状, 不能揭开玻片载体
能成膜, 膜的颜色为无色透明, 但膜较为粘稠, 不易移取
能成膜, 膜的颜色为无色透明, 柔软度较好, 易于移取
能成膜, 膜为乳白色, 揭膜时, 膜易碎
表1 不同凝胶度时的成膜状态
2. 1. 2 洗脱条件
模板的洗脱效率决定着蛋白质分子印迹膜的吸附容量, 所以在洗脱过程中要尽可能多地将模板蛋白分子从聚合膜上洗脱下来以得到更多数量的印迹位点. 本实验用1%SDS 10%H Ac 溶液时, 洗脱量最大(2. 9nmol) , 洗脱效率为47%; 0. 1mo l/L PBS 溶液次之, 洗脱量为1. 4nm ol, 洗脱效率为17%; 而0. 1mo l/L NaCl 溶液洗脱量最小(0. 9nm ol) , 洗脱效率为11%.
2. 2 牛血红蛋白的吸附量与吸附时间的关系
图1显示, 在2. 5h 内, 印迹膜对牛血红蛋白的吸附量随着时间的增加而明显增大. 这段时间内印迹膜存在着大量空的印迹空穴, 因此印迹膜的吸附速率高, 曲线的增长斜率较大. 再延长吸附时间, 吸附量无明显的增加, 基本达到平衡. 印迹膜达到静态
吸附平衡时对模板蛋白的吸附量为0. 21~0. 22nmol/cm . 非印迹膜对牛血红蛋白也有一定吸附量, 随着时间的增加也有一定程度的增加, 但吸附量和增加幅度明显低于印迹膜.
这是由于非印迹膜没
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图1 M IPM 和N IPM 对牛血红蛋白的吸附量
与吸附时间的关系曲线
第3期王 晖等: 三明治 法制备牛血红蛋白分子印迹膜291
有印迹空穴, 对模板蛋白的吸附主要是依靠凝胶膜上功能单体对蛋白的非特异性吸附造成的. 非印迹膜对牛血红蛋白的吸附量为0. 09~0. 1nm ol/cm 2. 2. 3 饱和吸附曲线
将印迹膜分别浸泡在不同浓度(0. 3~3. 9 mol/L) 的牛血红蛋白溶液中4h, 根据测得的蛋白溶液的吸光度值计算被印迹膜吸附的蛋白的量, 结果如图2所示. 起初, 印迹膜的吸附量随模板蛋白溶液浓度的增加而增加, 当重结合蛋白的浓度达到2. 2 mol/L 时, 吸附曲线逐渐趋向饱和, 表明印迹膜达到了最大吸附量. 而非印迹膜的吸附容量明显较小
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模板蛋白的吸附量高于微接触法制备印迹膜的蛋白吸附量, 且可采用蛋白质染色的方法进行定量分析
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图3 牛血红蛋白分子印迹膜对不同蛋白的吸附情况
3 结 论
本工作采用丙烯酰胺为功能单体, 利用 三明治 法成功制备了对牛血红蛋白具有选择性吸附的分子印迹膜. 结果表明丙烯酰胺是一种较好的制备蛋白质印迹膜的功能单体. 在制膜过程中, 丙烯酰胺与交联单体的配比很重要, 在一定的凝胶浓度下才
图2 牛血红蛋白分子印迹膜的饱和吸附曲线
2. 4 吸附的选择性
以印迹膜和非印迹膜对不同种类蛋白进行吸附, 结果如图3所示. 可以看出, 印迹膜对相同浓度的牛血清蛋白、溶菌酶、肌红蛋白和牛血红蛋白的吸附量依次为0. 08, 0. 10, 0. 14, 0. 21nmo l/cm . 在3个非模板蛋白中, 印迹膜对肌红蛋白的吸附量较高, 其原因是由于肌红蛋白与血红蛋白具有相似的结构, 但印迹膜对模板蛋白 牛血红蛋白的吸附量仍是最高的. 印迹膜对牛血清蛋白、溶菌酶、肌红蛋白和牛血红蛋白的 值分别为1. 2, 1. 3, 1. 7和2. 5, 说明印迹膜对牛血红蛋白具有一定的选择性. 非印迹膜对蛋白溶液的吸附量差别不大, 均在0. 07~0. 08nm ol/cm 2之间, 表明非印迹膜对蛋白没有选择性. 利用化学沉积法在石英晶体 金电极上制备的蛋白分子印迹膜对模板蛋白的响应信号比非模板蛋白高2~5倍
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能得到柔韧性好的膜. 模板蛋白的洗脱也是影响分子印迹膜吸附量的原因之一. 本工作采用的SDS H Ac 洗脱液洗脱效率仍不够理想, 后续工作将进一步优化洗脱条件或采用表面印迹的方法, 希望使产生的印迹孔穴大部分暴露出来, 从而提高分子印迹膜的吸附量. 本文方法制备的分子印迹膜与前文几种方法制备的分子印迹膜的选择性相当, 制备的印迹膜每cm 吸附蛋白的量高于已报道的印迹膜, 且可以采用染色的方法进行分析. 总之, 该方法是一种简便、经济的制备生物大分子印迹膜的方法. 随着制备条件的不断优化, 分子印迹膜的识别性能将不断提高, 该方法制备的蛋白质分子印迹膜可望发展成检测蛋白质的芯片.
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M olecular ly imprinted po lymer s (M IPs ) :Sensing , an
, 本文方法制备的印迹膜对模板蛋白的响
应信号比非模板蛋白高1~3倍. 利用微接触法制备
的分子印迹膜对模板蛋白肌红蛋白和非模板蛋白血红蛋白、抗兔抗体和人血清白蛋白的 值分别为5. 83, 1. 70, 2. 20和1. 19, 略高于本文报道的 值. 但微接触法制备的印迹膜吸附模板蛋白的量很低, 只能依靠化学发光和荧光的方法进行检测, 对仪器和试剂要求较高. 本文报道方法制备的印迹膜对
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Sandwich Prepare of a Bovine Hemoglobin Molecularly
Imprinted Polymer Membrane
WANG Hui, FANG Guijie, DING Anzi, XIE Weihong
(Inst itute of Bioengineering , H ubei U niversity of T echnolog y/Key Labor ator y o f Fermentation Eng ineer ing,
M inistr y of Education of China, Wuhan 430068, Hubei, China)
Abstract:A hemo globin molecularly im pr inted polym er membrane (M IPM ) w as prepared o n a g lass chip by using w ater so luble acrylamide as a functional mo nom er and N , N ! methy lenebisacry lam ide as a cro sslinker. T he optimal ratio of functional mo nom er to crosslinker monom er to form a g ood membrane is 40∀1. 1%SDS 10%H Ac w as the most effectiv e w ashing solutio n w hich can remove 47%o f the tem plate. The absorptio n reached a m ax imal value at 3. 5h and at 2. 9 m ol/L rebinding concentr ation. The M IPM show ed hig her abso rb capacity (0. 22nmo l/cm 2) to the template protein than that (0. 10nm ol/cm 2) of the no n im printed polym er membrane (NIPM ). The selectivity exper im ent car ried out in differ ent protein so lutions show ed that M IPM absor bed m ore template protein than tho se that had not been imprinted. The im pr inting factor for hem og lobin, my oglo bin, lysozy me and BSA were 2. 5, 1. 7, 1. 3and 1. 2respectively.
Key words:mo lecular ly im printing; hemog lobin; acry lam ide; m olecular recognition