时珍国医国药2009年第20卷第2期LISHIZHENMEDICINEANDMATERIAMEDICARESEARCH2009VOL.20NO.2
(药理药化(
金线莲组培快繁技术研究
江建铭,俞旭平,沈晓霞,沈宇峰
(浙江省中药研究所,浙江杭州 310023)
培养基、激素、有机物和活性炭对不定摘要:目的建立金线莲快繁体系。方法以茎段为外植体,开展了茎段不同部位、
芽增殖、幼苗生长的影响研究,并进行了移栽试验。结果外植体以不含顶芽和长根的中间段茎节为好;不定芽增殖最佳
培养基配方为MS(或B5)+BA3.0mg/L+NAA0.5~1.0mg/L,两个月增殖倍数达5.0以上;壮苗最适培养基为1/2MS+NAA3.0mg/L+6-BA0.5mg/L+香蕉提取物20%(或椰子汁20%);试管苗移栽适宜的基质为菜园土1份+2~3mm粗砂2份(或1份)+木屑1份(或2份),3个月成活率均达100%,且生长良好。结论采用上述方法,能实现金线莲幼苗的快速繁殖。
关键词:金线莲; 快速繁殖; 增殖; 生长; 移栽
中图分类号:S567 文献标识码:B 文章编号:1008-0805(2009)02-0408-03
金线莲Anoectochilusroxburghii(wal.l)lindl为兰科开唇兰属多年生草本,别名金蚕、金线兰、金线虎头蕉等,是我国传统珍贵药材,素有/金草0/神药0/乌人参0等美称,在民间应用范围较广,广泛应用于风湿性关节炎、高血压病、糖尿病、肾病等疑难杂症的治疗和强身健体、病后体虚恢复等方面,在浙江、福建、台湾等省和东南亚地区被视为珍稀名贵药材,特别在台湾省更是备受青睐,被称为/药中之王0[1,2]。
金线莲种子微小,由未成熟的胚及数层种皮细胞构成,自然萌发率和繁殖率低,目前市场上货源主要来自于野生采挖,产品一直处于供不应求的状况。近年来,随着对其药效学和临床应用研究的深入,对金线莲药用价值的认识进一步提高,其市场货源紧缺的状况更为严峻,野生资源也不断遭到破坏性采挖,以致于处于濒临灭绝之地。本研究旨在采用组织培养技术,解决金线莲种苗来源,加快人工栽培,以保护金线莲野生资源、稳定市场供应。现将有关实验结果如下。1 材料与方法
1.1 材料无菌繁殖体系的建立为浙江金线莲野生种源,其它实验为继代培养的不定芽及无根幼苗茎段。1.2 无菌繁殖体系的建立取生长健壮、无病虫害的植株,去叶后放入低浓度的洗衣粉水中漂洗3~5min,然后用流水冲洗30min。在超静工作台前,用75%酒精湿润5~6s,放入0.1%的HgCl溶液灭菌12~13min,用无菌水冲洗5~6次。将消毒好的茎按上段(具茎尖)、中段和下段(匍匐茎段)切成长约1.5~2cm,带有1~2个节间的小段,分别接种于MS+6-BA4.0mg/L+NAA0.4mg/L培养基上,pH5.6,蔗糖2.5%,琼脂0.7%。培养条件为:温度(25?2)e,光照时间12h/d,光照强度1500~2000lx。
1.3 不定芽诱导1.3.1 基本培养基对不定芽诱导的影响采用单因素实验,培养基选用MS(Murashige-Skoog)[3],1/2MS(大量元素减半,其他成分不变),VW(Vacin&Went),B5(Gamborg#Miller&Ojima)和KC(KnudsonC)等5种,分别添加6-BA4.0mg/L,NAA1.0mg/L。
1.3.2 激素对不定芽诱导的影响以MS为基本培养基,添加不同种类及浓度的细胞分裂素和生长素。
上述实验选取无菌健壮植株,切取长约1~1.5cm,带有一个节间的茎中段,每处理接10个茎节,重复3次。培养期间定时
收稿日期:2007-12-17; 修订日期:2008-03-20作者简介:江建铭(1963-),男(汉族),浙江杭州人,现任浙江省中药研究所高级工程师,学士学位,主要从事中药材资源保护与中药规范化种植研究工作.
观察不定芽生长情况,培养60d后统计不定芽数。其它条件同实验/1.20项。1.4 壮苗培养
1.4.1 激素对幼苗生长和发根的影响以1/2MS为基本培养基,NAA设1~5mg/L5个处理,6-BA设0.5,1.0和1.5mg/L3个处理,共15个处理。
1.4.2 添加物对幼苗生长和发根的影响以1/2MS+NAA2.0mg/L+6-BA0.5mg/L为基本培养,考察马铃薯提取物、香蕉提取物、苹果提取物、椰子汁等4种天然有机物和活性炭对金线莲幼苗生长的影响。
上述每种培养基均接入经增殖培养高约3cm,具3~4节间、有1~2片的无根幼苗,每处理接种接无根幼苗10株,重复3次。培养后每隔15d观察生长情况1次,至3个月考察每株净增加的叶片数、重量及发根数,并进行数理统计分析。1.5 移栽选苗高约6~8cm,茎基直径约2mm,丛生根有2~3条的试管苗,炼苗4d后,洗净附着在植株上的培养基,并晾干洗涤水后移人直径为15cm,装有不同基质的土盆中,考察不同基质对金线莲试管苗成活率的影响。移栽前,实验基质均用45%多菌灵可湿性粉剂800倍溶液浇透消毒。实验条件为遮荫度80%的荫棚,保持空气相对湿度的80%~90%。如发现有病死植株,及时拔除。每处理5盆,每盆种5株,重复3次,移栽3个月后考察成活株数,并进行数理统计分析。2 结果
2.1 无菌繁殖体系的建立实验表明,外植体茎段的分化程度对诱导结果存在一定的影响。从表1可知,上、中段茎均能萌动生长。上段茎因有顶芽的存在,顶端优势表现较为强烈,因而以生长为主,不定芽发生较少,平均芽增殖数为0.6个;中段茎不定芽发生快、量大、长势好,平均芽增殖数为4.05个,并形成多枝丛生状。下段茎由于组织相对老化,虽有不定芽发生,但发生量与生长势均较弱。这和陈自力[4]报道的结果一致。
从实验中观察到,不定芽的产生以侧芽萌生为主。一般在培养15~20d后,茎节上潜伏的叶腋芽萌动膨大,芽丛在节的四周萌出,起初为白色略带黄色,随着培养时间加长,芽不断伸展,逐渐转为黄绿色,形成主芽。叶腋芽是单生的,极个别节上能对生两个腋芽,未发现茎部或切口处长出不定芽。培养30d左右,主芽基部的节再生侧芽(称一级侧芽),45d左右一级侧芽节上又可发生二级侧芽,随着芽的生长、出现叶片,节处毛并产生根,外被浓密的白色绒毛,从而形成完整小植株。培养3个月后每天观察,侧芽分生组织的增殖,一般只出现主芽和一二级侧芽或苗;培养5个月以上,主芽、侧芽较高,叶片较多、大,只有少数出现三级侧芽或苗。这种腋芽萌生的增殖形成了主轴分枝型的芽苗,随培
LISHIZHENMEDICINEANDMATERIAMEDICARESEARCH2009VOL.20NO.2时珍国医国药2009年第20卷第2期
养时间或继代繁殖代数的增加,或激素的作用,芽或苗因节间短,多数为形成似不定芽或丛生苗。培养过程中,未见愈伤组织,也没有发现有原球茎和类原球茎产生。
表1 金线莲茎段外植体不定芽诱导
外植体上段中段下段
接种数/萌动率段(%)77100.0168100.09585.3
不定芽数/平均芽增殖率/
芽体生长状况
个倍480.62生长势旺、芽数少6814.05芽数较多,发育良好1401.73芽数较少且生长缓慢
为4.0mg/L的不定芽增殖率比2.0,1.0mg/L分别提高22.1%
和47.6%。当6-BA添加量达到6.0mg/L时,其增殖率还出现下降趋势,表明本实验条件下6-BA添加的适宜量为4.0mg/L。
表3 激素对金线莲不定芽诱导的影响
处理激素平均芽增差异显著性(LSR)
-1号C/mg#L殖率/倍
16-BA1.02.73dD26-BA2.03.30cdCD36-BA4.04.03bcB46-BA6.03.23cdCD5KT2.02.26eD6KT4.02.60dD76-BA4.0+NAA0.55.37aA86-BA4.0+NAA1.04.60abAB96-BA4.0+NAA1.54.17bB
芽体生长状况色嫩绿、芽较弱
色嫩绿、芽较壮色嫩绿、芽较壮色较绿、芽较壮色黄白、芽弱短色黄白、芽弱短色浓绿、芽粗壮色浓绿、芽粗壮色浓绿、芽粗壮
综合
评定差良良良差差优优较优
2.2 不定芽诱导2.2.1 基本培养基对不定芽诱导的影响以金线莲的茎节段作为外植体,腋芽能快速萌发出不定芽体。经60d的培养,增殖倍数可达3.1~5.4倍。但基本培养基对不定芽的诱导具有明显的影响,MS,B5培养基不定芽增殖率分别为5.4倍与5.2倍,比其它培养基增加23.8%~74.2%。
生长素NAA对金线莲不定芽的诱导与生长具有明显的促进
作用。从表3可以看出,添加了NAA的培养基不定芽增殖量与
表2 基本培养基对金线莲不定芽诱导的影响生长明显较不添加的好,芽体粗壮、色浓绿,其中添加0.5mg/L芽平均增殖差异显著性(LSR)的表现最好,添加1.0mg/L的其次,但二者间差异未达到显著水培养基种类芽体生长状况综合评定率/倍0.05 0.01平;与其它不添加NAA的相比差异达极显著水平。表明在本试
KC3.3cC色黄白、芽细弱差
验条件下NAA适宜添加的量为0.5~1.0mg/L。VW3.1cC色黄白、芽细弱差
2.3 壮苗培养MS5.4aA色浓绿、芽粗壮优
1/2MS4.2bB色嫩绿、芽较壮良2.3.1 激素对幼苗生长的影响在金线莲壮苗培养中,NAA较B55.2aA色浓绿、芽粗壮优
6-BA对促进幼苗生长的影响更为明显。结果见表4。NAA浓
经LSR差异显著性测定,MS,B5培养基之间无明显差异,与度低于3mg/L时,对幼苗生长有促进作用,随浓度的增加,叶片1/2MS,KC和VW之间存在极显著差异,且MS,B5培养基上诱导净增量、发根数和鲜重净增量明显增加,当浓度达到4.0mg/L产生的不定芽色绿、粗壮(见表2),表明MS,B5培养基适合作为时,叶片净增量、发根数和鲜重净增量增加不明显。6-BA在0.5
[5]
金线莲茎段不定芽诱导的基本培养基。mg/L情况下,比不加的具有一定的促进作用,但未达显著水平;2.2.2 激素对不定芽诱导的影响激素种类、水平与配比对组在浓度为1.0mg/L,1.5mg/L情况下,叶片净增量、发根数和鲜织培养快速繁殖在效率存在明显的影响,6-BA、KT和NAA是3重净增量反而减少,但在幼苗基部观察到丛生状不定芽的产生,种常用生长调节剂,其添加量对金线莲不定芽增殖的影响很大。表明6-BA在浓度高于1.0mg/L情况下,有利于金线莲不定芽结果见表3。从表3可知,同为细胞分裂素的6-BA,KT在相同的生成,对幼苗生长不利。的添加量下对不定芽的增殖效果差异极显著,6-BA比KT的增从表4也可以看出,处理9、10号在发根数、鲜生净增量方面殖率提高46.0%和55.0%,表明6-BA比KT更适合金线莲茎较其它处理明显提高,达极显著差异;在叶片净增量方面,除与处节不定芽的诱导。理13、14号无明显差异外,与其它处理之间的差异达极显著水
6-BA的浓度也影响不定芽诱导效果。在添加量小于4.0平,表明在金线莲壮苗培养中,NAA适宜添加的量为3.0~4.0mg/L的情况下,随浓度的提高,不定芽增殖率明显上升,添加量mg/L,6-BA添加量为0.5mg/L或不加。
表4 激素对金线莲幼苗生长的影响
处理
号[***********]41516
激素/mg#L-1NAA1.01.01.01.02.02.02.02.03.03.03.03.04.04.04.04.0
6-BA-0.51.01.5-0.51.01.5-0.51.01.5
-0.51.01.5
平均1.331.761.271.103.173.162.131.604.234.333.273.003.833.672.632.30
净增叶/片差异显著性0.05 0.01jkhijjkkdefdefghiijkaabcdeefabcbcdfggh
HGHHHBCDBCDFGGHAABCDCDEAABCDEFEFG
平均2.072.232.201.402.972.572.831.673.703.673.032.233.173.332.632.43
发根数/条差异显著性
0.05 0.01hghghjcdfdeiaacdghbcbeffg
GFGFGHCDECDHAABCFGBCBDEEF
平均533.7539.3524.7448.3578.3588.3583.3466.3703.3701.7623.3524.7678.7663.3585.0536.0
鲜重净增/mg
差异显著性
0.05 0.01eeegdddfaacebbde
EEEFDDDFAACEBBDE
综合评定差差差差良良差差优优良差良良差差
2.3.2 活性炭与有机添加物对幼苗生长的影响结果见表5。重净增量均高于其它处理,二者间无明显差异;马铃薯对幼苗生从表5可知,不同的添加物对金线莲幼苗生长的影响表现不一,长不利,与其它处理相比均存在极显著差异水平。活性炭对金线香蕉、椰子汁对促进幼苗生长最为有利,叶片净增量、发根数和鲜莲幼苗生长具有一定的促进作用,在添加0.3%情况下,叶片净
#
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增量、发根数和鲜重净增量与对照相比均显著提高,差异达极显显著水平,鲜重净增量差异达极显著水平。同时观察到活性炭、
著水平;但与香蕉、椰子汁处理相比,其促进幼苗生长的作用不如香蕉和椰子汁新发根洁白、粗壮。试验结果表明添加20%香蕉前二者,除发根数无差异外,叶净增量与香蕉、椰子汁处理差异达和椰子汁最适宜金线莲幼苗的生长。
表5 添加物对金线莲幼苗生长的影响
处理
号123456
净增叶/片
添加物活性炭0.3%马铃薯20%香蕉20%苹果20%椰子汁20%CK(不加)
平均4.002.534.333.674.303.33
差异显著性
0.05 0.01beacad
ABDABCAC
平均3.201.333.373.003.332.37
发根数/条差异显著性
0.05 0.01acaaab
ACAAAB
平均540.3453.7757.3644.3763.3515.7
鲜重净增m/mg
差异显著性
0.05 0.01ceabad
CEABAD
综合
评定良差优良优差
2.4 移栽金线莲试管苗移栽3个月后的植株成活情况见表6。从表6中可以看出,处理7和处理9保持100%的成活率,处理3和处理8的植株成活率也在93%以上,处理1的成活率最低,仅为56%。经LSR差异显著性测定,处理3、7、8、9号之间无明显
处理
号123456789
移栽数/株
[***********]
差异,与处理5、6号差异达显著水平、与处理1、2、4号差异达极显著水平。表明在菜园土中加入粗砂、木屑能明显提高金线莲试管苗移栽的成活率,适宜添加的比例为1份菜园土中加入粗砂2份、木屑1份或粗砂1份、木屑2份,要求充分混匀。
平均成活
株数/株14.16.24.17.20.20.25.23.25.
073737030
平均成活率(%)56.066.897.270.881.282.8100.093.2100.0
表6 种植基质对金线莲试管苗移栽成活率的影响
种植基质
菜园土
菜园土1份+粗砂1份(2~3mm、下同)
菜园土1份+粗砂2份菜园土1份+木屑1份菜园土1份+木屑2份
菜园土1份+粗砂2份+木屑2份菜园土1份+粗砂2份+木屑1份菜园土1份+粗砂1份+木屑1份菜园土1份+粗砂1份+木屑2份
差异显著性0.05 0.01dcacbbaaa
DCDABCDBCABCAABA
3 小结
金线莲不同部位的茎间对不定芽的诱导结果存在明显的差异,以不含顶芽和长根的中间段茎节为好,不定芽增殖率达4倍以上。
采用金线莲中间茎节作外植体诱导不定芽萌发时,适宜的培养基为MS或B5+6-BA4.0mg/L+NAA0.5mg/L~1.0mg/L,蔗糖浓度为2.5%。
适宜的壮苗培养基为1/2MS+NAA3.0mg/L+6-BA0.5mg/L+香蕉提取物20%(或椰子汁20%),蔗糖浓度为3.0%。3.4试管苗在充分混匀的1份菜园土+2份粗砂(2~3mm)+1份木屑,或1份菜园土+粗砂1份+木屑2份的基质中生长良好,3个月后成活率达100%。
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(上接第407页)
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培养基、激素、有机物和活性炭对不定摘要:目的建立金线莲快繁体系。方法以茎段为外植体,开展了茎段不同部位、
芽增殖、幼苗生长的影响研究,并进行了移栽试验。结果外植体以不含顶芽和长根的中间段茎节为好;不定芽增殖最佳
培养基配方为MS(或B5)+BA3.0mg/L+NAA0.5~1.0mg/L,两个月增殖倍数达5.0以上;壮苗最适培养基为1/2MS+NAA3.0mg/L+6-BA0.5mg/L+香蕉提取物20%(或椰子汁20%);试管苗移栽适宜的基质为菜园土1份+2~3mm粗砂2份(或1份)+木屑1份(或2份),3个月成活率均达100%,且生长良好。结论采用上述方法,能实现金线莲幼苗的快速繁殖。
关键词:金线莲; 快速繁殖; 增殖; 生长; 移栽
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金线莲种子微小,由未成熟的胚及数层种皮细胞构成,自然萌发率和繁殖率低,目前市场上货源主要来自于野生采挖,产品一直处于供不应求的状况。近年来,随着对其药效学和临床应用研究的深入,对金线莲药用价值的认识进一步提高,其市场货源紧缺的状况更为严峻,野生资源也不断遭到破坏性采挖,以致于处于濒临灭绝之地。本研究旨在采用组织培养技术,解决金线莲种苗来源,加快人工栽培,以保护金线莲野生资源、稳定市场供应。现将有关实验结果如下。1 材料与方法
1.1 材料无菌繁殖体系的建立为浙江金线莲野生种源,其它实验为继代培养的不定芽及无根幼苗茎段。1.2 无菌繁殖体系的建立取生长健壮、无病虫害的植株,去叶后放入低浓度的洗衣粉水中漂洗3~5min,然后用流水冲洗30min。在超静工作台前,用75%酒精湿润5~6s,放入0.1%的HgCl溶液灭菌12~13min,用无菌水冲洗5~6次。将消毒好的茎按上段(具茎尖)、中段和下段(匍匐茎段)切成长约1.5~2cm,带有1~2个节间的小段,分别接种于MS+6-BA4.0mg/L+NAA0.4mg/L培养基上,pH5.6,蔗糖2.5%,琼脂0.7%。培养条件为:温度(25?2)e,光照时间12h/d,光照强度1500~2000lx。
1.3 不定芽诱导1.3.1 基本培养基对不定芽诱导的影响采用单因素实验,培养基选用MS(Murashige-Skoog)[3],1/2MS(大量元素减半,其他成分不变),VW(Vacin&Went),B5(Gamborg#Miller&Ojima)和KC(KnudsonC)等5种,分别添加6-BA4.0mg/L,NAA1.0mg/L。
1.3.2 激素对不定芽诱导的影响以MS为基本培养基,添加不同种类及浓度的细胞分裂素和生长素。
上述实验选取无菌健壮植株,切取长约1~1.5cm,带有一个节间的茎中段,每处理接10个茎节,重复3次。培养期间定时
收稿日期:2007-12-17; 修订日期:2008-03-20作者简介:江建铭(1963-),男(汉族),浙江杭州人,现任浙江省中药研究所高级工程师,学士学位,主要从事中药材资源保护与中药规范化种植研究工作.
观察不定芽生长情况,培养60d后统计不定芽数。其它条件同实验/1.20项。1.4 壮苗培养
1.4.1 激素对幼苗生长和发根的影响以1/2MS为基本培养基,NAA设1~5mg/L5个处理,6-BA设0.5,1.0和1.5mg/L3个处理,共15个处理。
1.4.2 添加物对幼苗生长和发根的影响以1/2MS+NAA2.0mg/L+6-BA0.5mg/L为基本培养,考察马铃薯提取物、香蕉提取物、苹果提取物、椰子汁等4种天然有机物和活性炭对金线莲幼苗生长的影响。
上述每种培养基均接入经增殖培养高约3cm,具3~4节间、有1~2片的无根幼苗,每处理接种接无根幼苗10株,重复3次。培养后每隔15d观察生长情况1次,至3个月考察每株净增加的叶片数、重量及发根数,并进行数理统计分析。1.5 移栽选苗高约6~8cm,茎基直径约2mm,丛生根有2~3条的试管苗,炼苗4d后,洗净附着在植株上的培养基,并晾干洗涤水后移人直径为15cm,装有不同基质的土盆中,考察不同基质对金线莲试管苗成活率的影响。移栽前,实验基质均用45%多菌灵可湿性粉剂800倍溶液浇透消毒。实验条件为遮荫度80%的荫棚,保持空气相对湿度的80%~90%。如发现有病死植株,及时拔除。每处理5盆,每盆种5株,重复3次,移栽3个月后考察成活株数,并进行数理统计分析。2 结果
2.1 无菌繁殖体系的建立实验表明,外植体茎段的分化程度对诱导结果存在一定的影响。从表1可知,上、中段茎均能萌动生长。上段茎因有顶芽的存在,顶端优势表现较为强烈,因而以生长为主,不定芽发生较少,平均芽增殖数为0.6个;中段茎不定芽发生快、量大、长势好,平均芽增殖数为4.05个,并形成多枝丛生状。下段茎由于组织相对老化,虽有不定芽发生,但发生量与生长势均较弱。这和陈自力[4]报道的结果一致。
从实验中观察到,不定芽的产生以侧芽萌生为主。一般在培养15~20d后,茎节上潜伏的叶腋芽萌动膨大,芽丛在节的四周萌出,起初为白色略带黄色,随着培养时间加长,芽不断伸展,逐渐转为黄绿色,形成主芽。叶腋芽是单生的,极个别节上能对生两个腋芽,未发现茎部或切口处长出不定芽。培养30d左右,主芽基部的节再生侧芽(称一级侧芽),45d左右一级侧芽节上又可发生二级侧芽,随着芽的生长、出现叶片,节处毛并产生根,外被浓密的白色绒毛,从而形成完整小植株。培养3个月后每天观察,侧芽分生组织的增殖,一般只出现主芽和一二级侧芽或苗;培养5个月以上,主芽、侧芽较高,叶片较多、大,只有少数出现三级侧芽或苗。这种腋芽萌生的增殖形成了主轴分枝型的芽苗,随培
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养时间或继代繁殖代数的增加,或激素的作用,芽或苗因节间短,多数为形成似不定芽或丛生苗。培养过程中,未见愈伤组织,也没有发现有原球茎和类原球茎产生。
表1 金线莲茎段外植体不定芽诱导
外植体上段中段下段
接种数/萌动率段(%)77100.0168100.09585.3
不定芽数/平均芽增殖率/
芽体生长状况
个倍480.62生长势旺、芽数少6814.05芽数较多,发育良好1401.73芽数较少且生长缓慢
为4.0mg/L的不定芽增殖率比2.0,1.0mg/L分别提高22.1%
和47.6%。当6-BA添加量达到6.0mg/L时,其增殖率还出现下降趋势,表明本实验条件下6-BA添加的适宜量为4.0mg/L。
表3 激素对金线莲不定芽诱导的影响
处理激素平均芽增差异显著性(LSR)
-1号C/mg#L殖率/倍
16-BA1.02.73dD26-BA2.03.30cdCD36-BA4.04.03bcB46-BA6.03.23cdCD5KT2.02.26eD6KT4.02.60dD76-BA4.0+NAA0.55.37aA86-BA4.0+NAA1.04.60abAB96-BA4.0+NAA1.54.17bB
芽体生长状况色嫩绿、芽较弱
色嫩绿、芽较壮色嫩绿、芽较壮色较绿、芽较壮色黄白、芽弱短色黄白、芽弱短色浓绿、芽粗壮色浓绿、芽粗壮色浓绿、芽粗壮
综合
评定差良良良差差优优较优
2.2 不定芽诱导2.2.1 基本培养基对不定芽诱导的影响以金线莲的茎节段作为外植体,腋芽能快速萌发出不定芽体。经60d的培养,增殖倍数可达3.1~5.4倍。但基本培养基对不定芽的诱导具有明显的影响,MS,B5培养基不定芽增殖率分别为5.4倍与5.2倍,比其它培养基增加23.8%~74.2%。
生长素NAA对金线莲不定芽的诱导与生长具有明显的促进
作用。从表3可以看出,添加了NAA的培养基不定芽增殖量与
表2 基本培养基对金线莲不定芽诱导的影响生长明显较不添加的好,芽体粗壮、色浓绿,其中添加0.5mg/L芽平均增殖差异显著性(LSR)的表现最好,添加1.0mg/L的其次,但二者间差异未达到显著水培养基种类芽体生长状况综合评定率/倍0.05 0.01平;与其它不添加NAA的相比差异达极显著水平。表明在本试
KC3.3cC色黄白、芽细弱差
验条件下NAA适宜添加的量为0.5~1.0mg/L。VW3.1cC色黄白、芽细弱差
2.3 壮苗培养MS5.4aA色浓绿、芽粗壮优
1/2MS4.2bB色嫩绿、芽较壮良2.3.1 激素对幼苗生长的影响在金线莲壮苗培养中,NAA较B55.2aA色浓绿、芽粗壮优
6-BA对促进幼苗生长的影响更为明显。结果见表4。NAA浓
经LSR差异显著性测定,MS,B5培养基之间无明显差异,与度低于3mg/L时,对幼苗生长有促进作用,随浓度的增加,叶片1/2MS,KC和VW之间存在极显著差异,且MS,B5培养基上诱导净增量、发根数和鲜重净增量明显增加,当浓度达到4.0mg/L产生的不定芽色绿、粗壮(见表2),表明MS,B5培养基适合作为时,叶片净增量、发根数和鲜重净增量增加不明显。6-BA在0.5
[5]
金线莲茎段不定芽诱导的基本培养基。mg/L情况下,比不加的具有一定的促进作用,但未达显著水平;2.2.2 激素对不定芽诱导的影响激素种类、水平与配比对组在浓度为1.0mg/L,1.5mg/L情况下,叶片净增量、发根数和鲜织培养快速繁殖在效率存在明显的影响,6-BA、KT和NAA是3重净增量反而减少,但在幼苗基部观察到丛生状不定芽的产生,种常用生长调节剂,其添加量对金线莲不定芽增殖的影响很大。表明6-BA在浓度高于1.0mg/L情况下,有利于金线莲不定芽结果见表3。从表3可知,同为细胞分裂素的6-BA,KT在相同的生成,对幼苗生长不利。的添加量下对不定芽的增殖效果差异极显著,6-BA比KT的增从表4也可以看出,处理9、10号在发根数、鲜生净增量方面殖率提高46.0%和55.0%,表明6-BA比KT更适合金线莲茎较其它处理明显提高,达极显著差异;在叶片净增量方面,除与处节不定芽的诱导。理13、14号无明显差异外,与其它处理之间的差异达极显著水
6-BA的浓度也影响不定芽诱导效果。在添加量小于4.0平,表明在金线莲壮苗培养中,NAA适宜添加的量为3.0~4.0mg/L的情况下,随浓度的提高,不定芽增殖率明显上升,添加量mg/L,6-BA添加量为0.5mg/L或不加。
表4 激素对金线莲幼苗生长的影响
处理
号[***********]41516
激素/mg#L-1NAA1.01.01.01.02.02.02.02.03.03.03.03.04.04.04.04.0
6-BA-0.51.01.5-0.51.01.5-0.51.01.5
-0.51.01.5
平均1.331.761.271.103.173.162.131.604.234.333.273.003.833.672.632.30
净增叶/片差异显著性0.05 0.01jkhijjkkdefdefghiijkaabcdeefabcbcdfggh
HGHHHBCDBCDFGGHAABCDCDEAABCDEFEFG
平均2.072.232.201.402.972.572.831.673.703.673.032.233.173.332.632.43
发根数/条差异显著性
0.05 0.01hghghjcdfdeiaacdghbcbeffg
GFGFGHCDECDHAABCFGBCBDEEF
平均533.7539.3524.7448.3578.3588.3583.3466.3703.3701.7623.3524.7678.7663.3585.0536.0
鲜重净增/mg
差异显著性
0.05 0.01eeegdddfaacebbde
EEEFDDDFAACEBBDE
综合评定差差差差良良差差优优良差良良差差
2.3.2 活性炭与有机添加物对幼苗生长的影响结果见表5。重净增量均高于其它处理,二者间无明显差异;马铃薯对幼苗生从表5可知,不同的添加物对金线莲幼苗生长的影响表现不一,长不利,与其它处理相比均存在极显著差异水平。活性炭对金线香蕉、椰子汁对促进幼苗生长最为有利,叶片净增量、发根数和鲜莲幼苗生长具有一定的促进作用,在添加0.3%情况下,叶片净
#
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增量、发根数和鲜重净增量与对照相比均显著提高,差异达极显显著水平,鲜重净增量差异达极显著水平。同时观察到活性炭、
著水平;但与香蕉、椰子汁处理相比,其促进幼苗生长的作用不如香蕉和椰子汁新发根洁白、粗壮。试验结果表明添加20%香蕉前二者,除发根数无差异外,叶净增量与香蕉、椰子汁处理差异达和椰子汁最适宜金线莲幼苗的生长。
表5 添加物对金线莲幼苗生长的影响
处理
号123456
净增叶/片
添加物活性炭0.3%马铃薯20%香蕉20%苹果20%椰子汁20%CK(不加)
平均4.002.534.333.674.303.33
差异显著性
0.05 0.01beacad
ABDABCAC
平均3.201.333.373.003.332.37
发根数/条差异显著性
0.05 0.01acaaab
ACAAAB
平均540.3453.7757.3644.3763.3515.7
鲜重净增m/mg
差异显著性
0.05 0.01ceabad
CEABAD
综合
评定良差优良优差
2.4 移栽金线莲试管苗移栽3个月后的植株成活情况见表6。从表6中可以看出,处理7和处理9保持100%的成活率,处理3和处理8的植株成活率也在93%以上,处理1的成活率最低,仅为56%。经LSR差异显著性测定,处理3、7、8、9号之间无明显
处理
号123456789
移栽数/株
[***********]
差异,与处理5、6号差异达显著水平、与处理1、2、4号差异达极显著水平。表明在菜园土中加入粗砂、木屑能明显提高金线莲试管苗移栽的成活率,适宜添加的比例为1份菜园土中加入粗砂2份、木屑1份或粗砂1份、木屑2份,要求充分混匀。
平均成活
株数/株14.16.24.17.20.20.25.23.25.
073737030
平均成活率(%)56.066.897.270.881.282.8100.093.2100.0
表6 种植基质对金线莲试管苗移栽成活率的影响
种植基质
菜园土
菜园土1份+粗砂1份(2~3mm、下同)
菜园土1份+粗砂2份菜园土1份+木屑1份菜园土1份+木屑2份
菜园土1份+粗砂2份+木屑2份菜园土1份+粗砂2份+木屑1份菜园土1份+粗砂1份+木屑1份菜园土1份+粗砂1份+木屑2份
差异显著性0.05 0.01dcacbbaaa
DCDABCDBCABCAABA
3 小结
金线莲不同部位的茎间对不定芽的诱导结果存在明显的差异,以不含顶芽和长根的中间段茎节为好,不定芽增殖率达4倍以上。
采用金线莲中间茎节作外植体诱导不定芽萌发时,适宜的培养基为MS或B5+6-BA4.0mg/L+NAA0.5mg/L~1.0mg/L,蔗糖浓度为2.5%。
适宜的壮苗培养基为1/2MS+NAA3.0mg/L+6-BA0.5mg/L+香蕉提取物20%(或椰子汁20%),蔗糖浓度为3.0%。3.4试管苗在充分混匀的1份菜园土+2份粗砂(2~3mm)+1份木屑,或1份菜园土+粗砂1份+木屑2份的基质中生长良好,3个月后成活率达100%。
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