微生物诱变育种方法研究现状
摘要：诱变育种具有速度快、简单和收效大等优点，在生产和科研中被广泛应用。本文主要对3种诱变方法（物理诱变、化学诱变、复合诱变）的研究和应用现状进行了简要的综述。
关键词：诱变育种；微生物；研究现状
诱变育种是指利用物理或化学诱变剂处理均匀分散的微生物细胞群，促进其突变率大幅度提高，然后采用简便、快速和高效筛选方法，从中挑选少数符合育种目的的突变株，以供生产实践或科学研究用[1]。诱变育种能大幅度提高菌种诱变率，并且具有速度快、收效大、方法简便等优点；现在发酵行业和其他生产单位所使用的高产菌株，几乎都是通过诱变而提高性能的；足以可见诱变育种仍是当前育种方法的一个重要手段。但由于诱变育种的突变不定向性，因此越来越多的研究者在寻求新的诱变方法，例如复合诱变就是一种。微生物诱变育种的方法一直在不断地进展。
1、微生物诱变育种的作用
直接从自然界中分离得到的野生型菌株产量很低，根本不能满足工业化生产的需求；诱变育种就是为了达到我们所需要的高产、优质和低耗的菌种。
微生物发酵工业中, 诱变育种主要有以下作用: 提高有效产物的产量; 改善菌种特性, 提高产品质量; 简化工艺条件; 开发新品种, 产生新物质; 用于研究推测产物的生物合成途径; 与其他育种方法相结合[2] 。
2、物理诱变
物理诱变通常使用物理辐射中的各种射线,包括紫外线、X射线、γ射线、α射线、β射线、快中子、微波、超声波、电磁波、激光射线和宇宙射线等。近年来，离子注入法、超高压、离子辐射诱变育种也是诱变育种的新方法。
2.1、离子注入法
离子注入法是近几年新发展起来的物理诱变方法；更具有设备简单、使用方便，成本低廉、对人体和环境无害等优点[3]，在微生物的育种研究方面已广泛用于实践生产中。其诱变原理是微生物在核能离子注入后，受到不同程度的损伤，大到整个细胞形态、各种亚细胞结构的变化，小到组成细胞的生物大分子的变形，从而导致基因突变[4]。许安等[5]以生产VC的2一酮基一L一古龙酸高产菌系为出发菌株，进行离子注入育种，选育出了高产菌系：糖酸转化率提高15％一20％、4代传种平均转化率达95％，并进行了培养基优化和摇瓶发酵检测，为所选的IPPM-1028菌系的扩大生产提供了依据。同时，向砥等[6]利用离子注入选育高产壮观链霉菌，获得高产菌株，效价较出发菌株提高了102.3％。
2.2、超高压
高压导致细胞体积减小, 胞内物质浓缩, 使得先前互不接触的各种酶、蛋白质及核酸类物质接触, 这种接触必然会导致一些不可预测的反应发生。超高压可作为一种很有前景的新诱变方法，并且具有无污染、操作简单等优点。李文革等[7] 用220MPa 高压处理大肠杆菌TGl、DH5A和HB101, 得到了耐压的突变株TG1P、DH5AP 和HB101P。此外，王岁楼等[8]利用超高压技术对红酵母Rhodotorula glutinis NR06进行诱变处理,在300 M Pa处理10min时获得一突变株NR06-H39,其β-胡萝卜素产量达到9.64 mg/L,比出发菌株NR06的6.30 mg/L提高了53.02%,且遗传稳
定性良好。可见，超高压是一种很好的诱变育种方法。
2.3、离子辐射诱变
离子束具有高传能线性密度(Let),且在射程的末端还有尖锐的电离峰(Bragg峰)。这使重离子能在生物介质中产生高密度的电离和激发事件,同时产生的高活度自由基造成间接损伤,从而引起较强的生理生化作用,可引起染色体的重复、易位、倒位、缺失或使DNA分子取代、补充、断裂等。程备久[9]等利用30Kev的N+、Ar+离子辐照离体质粒DNA，分析了不同离子对DNA单双链断裂及转化活性的影响。试验表明N+，Ar+离子对质粒DNA损伤的差异可能主要是溅射作用的大小不同造成的。Ar+离子质量数大，因而可产生比N+离子更强的溅射作用，从而导DNA单双链断裂的频率高于N+离子。
3、化学诱变
化学诱变方法是指使用化学物质处理微生物使其性状发生改变的方法。化学诱变的作用机制与物理诱变剂有很大区别，其作用机制都是与 DNA起化学作用。化学诱变剂往往具有专一性，它们对基因的某部位发生作用,对其余部位则无影响。常用的化学诱变剂有：碱基的修饰剂、碱基类似物、DNA插入剂。
3.1、碱基的修饰剂
碱基的修饰剂并不是掺入到DNA中，而是通过直接地修饰碱基的化学结构，改变其性质而导致诱变。常用的碱基修饰剂有烷化剂、亚硝酸和羟胺等。 在以羟胺为诱变剂方面，高德喜等[10]，通过将化学诱变剂盐酸经胺加人培养基中对出,发菌株进行诱变育种, 筛选得到的高产菌株239#发酵单位明显高于出发菌株232#, 提高了11.11％。而在亚硝酸方面，赵静岩等[11]研究了NTG浓度、处理时间和不同缓冲液对卡那霉素链霉菌杀菌率和效价变异频率的影响，找到了最适诱变条件，筛选出了两株高产突变菌株K-102和K-41，在生产上分别取得了增产26％和43.68％的显著效果。
3.2、碱基类似物
碱基类似物是一类化学结构与DNA中正常碱基十分相似的化学制剂；它在DNA复制时，它们可以被错误地掺入DNA，引起诱变效应。这类诱变剂有5-溴尿嘧啶、5-氟尿嘧啶、8-氮鸟嘌呤等。近几年，在微生物育种方面取得很大进展，程世清等[12]用5-BU对产色素菌(分枝杆菌T17—2—39)细胞进行诱变，生物量平均提高22．5％。张建云等[13]在对野油菜黄单胞菌的α-淀粉酶基因进行的体外诱变中，采用基因体外定向进化策略中易错PCR技术,用碱基类似物5-溴脱氧尿苷三磷酸(5-BrdUTP)部分取代脱氧胸苷三磷酸(dTTP),对野油菜黄单胞菌的α-淀粉酶基因进行了体外诱变。通过鉴别培养基进行筛选,得到5个具有高酶活的诱变基因,通过出发基因序列进行比较,分析了突变位点和酶功能变化的相应关系。结果显示基因诱变后酶活的改变主要是由淀粉酶基因空间结构的改变而引起的,而不是由启动子的变化引起的。
3.3、DNA插入剂
DNA插入剂是通过插入到DNA双螺旋双链或单链的两个相邻的碱基之间，起到插入诱变的作用，碱基的缺失或增加，引起移码突变，导致遗传特性的改变。在这方面也研究出许多成果。顾真荣等[14]在对枯草芽孢杆菌G3抗真菌活性改良的研究中（顾真荣，2008），用诱变剂吖啶橙诱变得到20个突变株,其中5个突变株Ga1、Ga8、Ga12、Ga1和Ga19在肉汤和PDA平板上形成粘液状菌落,完全不同于出发菌株。PDA平板抑菌圈试验,突变株对番茄叶霉菌和黄瓜灰霉菌产生比野生株G3更大的透明抑菌圈。其中Ga1菌株对番茄叶霉菌和黄瓜灰霉菌的抑菌带
宽分别是G3的1.71和1.69倍。用番茄叶霉菌为指示菌的生物测定结果表明,突变株固体培养物或摇瓶培养物以最小抑菌浓度(MIC)和有效抑菌中浓度(EC50)表示的抗真菌活性皆高于G3菌株。突变株Ga1抗真菌活性最强。摇瓶培养时, Ga1菌株产生比G3更多的伊枯草菌素A。Ga1菌株增强了合成伊枯草菌素A的能力。
4、复合诱变
物理和化学诱变剂具有不同的诱变效应, 在诱变育种中常使用2种或2种以上的诱变剂复合处理来提高诱变效应。复合诱变包括: 2种或多种诱变剂的先后使用; 同一种诱变剂的重复作用; 2种或多种诱变剂的同时使用[15]。复合诱变处理,在微生物育种方面已经取得了很好的效果。例如：赵丽坤等[16]，通过紫外线- 氯化锂(LiCl) 和紫外线- 亚硝基胍(NTG) 对阿维链霉菌N2526 进行了复合诱变处理。发现，以1. 00 mol/ L 的LiCl 和60s 的紫外线照射时间以及以45 s 的UV 照射时间和0. 8 mg/ ml 的NTG浓度分别对出发菌株进行复合诱变处理,通过筛选得到13 株总效价比出发菌株提高了20 %以上的突变株,经HPLC 检测,其中7 株B 1a组分含量较高,均在45 %以上。菌株H02180 的B1a含量达到了51. 35 %,比出发菌株N2526 的B1a含量提高了65. 1 %;菌株H02108的B1a含量达到了51. 26 %,比出发菌株N2526 的含量提高了64. 8 %。李永泉等[17]，在微波诱变和激光诱变相结合选育金霉素链霉菌的研究中，采用激光和微波两种物理因子，对去甲基金霉素生产菌.金霉素链霉素进行诱变处理，选育到一株产量较高的生产菌HL11，发酵效价从2831u/ml提高到4683u/ml，提高了65.4％。所选育的菌株经多次传，遗传性状非常稳定。
5、结语
虽然随着基因工程的出现，各种各样新的微生物育种方法一直在不断地出现，如：原生质体融合育种、基因工程育种等方法，但是诱变育种仍在微生物育种占据着很重要的位置。虽然诱变育种操作简单，收率高、快速和正突变率高。但存在着很大的盲目性和随机性，诱变育种主要靠后期的筛选工作，这样工作量很大。在微生物育种的方法选用上，我们应该从这几个方面考虑：（1）收率高，稳定遗传性高；（2）能工业化大量生产；（3）生产设备费用低，操作简单；（4）菌种对环境没有污染。
诱变育种方法有很大的研究价值，前景很好。在以后的研究中，尽量能发生正向突变的育种方法。
参考文献：
[1]杨汝德.现代工业微生物学教程[M].北京：高等教育出版社，2006.1.
[2]施巧琴，吴松刚.工业微生物育种学[M].北京:科学出版社，2003.
[3]赵树欣，李春明．离子注入与紫外诱变筛选产高级醇低的果酒酵母．酿酒科技，2O06．No．1l(Vol．149)．
[4]陈立梅，汪旭.等.链霉菌诱变育种方法综述[J].吉林农业科学,2006,31(2):62-封三.
[5]许安，姚建铭，余增亮．离子注入维生素c二步发酵混合菌研究(I)2-酮基一L一古龙酸高产菌系IPPM一1028的选育[J]．工业微生物，1998，28(4）：21-23．
[6]向砥.等.离子注入选育高产壮观霉素的研究[J].激光生物学报，2002,11(4):276-279.
[7]李文革, 彭 玲, 刘宣承。产生菌黑曲霉Co9-6 的研究[J]. 激光生物学, 1994, 3 ( 3) : 509- 5121
[8]王岁楼，陈德经，邓百万. 红酵母超高压诱变及其β-胡萝卜素发酵条件的初步研究[J]. 食品科学. 2007(9): 409-414.
[9]程备久，朱苏文，李培金.等．不同离子辐照对离体质粒DNA损伤与转化活性的影响[J]．激光生物学报，2001，
10(1)：40—43．
[10]高德喜,白铁忠.青霉素产生菌的诱变育种[J].黑龙江医药，2004，NO.5
[11]赵静岩等.卡那霉素链霉菌亚硝基腿诱变育种[J].遗传，1980,2（3）：17-19
[12]程世清.产色素菌T17—2—39的诱变育种实验[J].江苏食品与发酵，2000，102(2)：9-12．
[14]顾真荣，陈伟，程洪斌等. 吖啶橙诱变提高枯草芽孢杆菌G3抗真菌活性[J]. 植物病理学报. 2008(2): 185-191.
[15]李荣杰.微生物诱变育种方法研究进展[J].河北农业科学.2009, 13 ( 10 ) : 73- 76, 78
[16]赵丽坤,张利平.等.阿维菌素高产菌的诱变育种研究[J].安徽农业科学.2008 ,36 (19) :8062 - 8064
[17]李永泉.等.微波诱变和激光诱变相结合选育金霉素链霉菌的研究[J].生物工程学报.1998,14(4)
陈贵翠
100603029
生工10级3班
微生物诱变育种方法研究现状
摘要：诱变育种具有速度快、简单和收效大等优点，在生产和科研中被广泛应用。本文主要对3种诱变方法（物理诱变、化学诱变、复合诱变）的研究和应用现状进行了简要的综述。
关键词：诱变育种；微生物；研究现状
诱变育种是指利用物理或化学诱变剂处理均匀分散的微生物细胞群，促进其突变率大幅度提高，然后采用简便、快速和高效筛选方法，从中挑选少数符合育种目的的突变株，以供生产实践或科学研究用[1]。诱变育种能大幅度提高菌种诱变率，并且具有速度快、收效大、方法简便等优点；现在发酵行业和其他生产单位所使用的高产菌株，几乎都是通过诱变而提高性能的；足以可见诱变育种仍是当前育种方法的一个重要手段。但由于诱变育种的突变不定向性，因此越来越多的研究者在寻求新的诱变方法，例如复合诱变就是一种。微生物诱变育种的方法一直在不断地进展。
1、微生物诱变育种的作用
直接从自然界中分离得到的野生型菌株产量很低，根本不能满足工业化生产的需求；诱变育种就是为了达到我们所需要的高产、优质和低耗的菌种。
微生物发酵工业中, 诱变育种主要有以下作用: 提高有效产物的产量; 改善菌种特性, 提高产品质量; 简化工艺条件; 开发新品种, 产生新物质; 用于研究推测产物的生物合成途径; 与其他育种方法相结合[2] 。
2、物理诱变
物理诱变通常使用物理辐射中的各种射线,包括紫外线、X射线、γ射线、α射线、β射线、快中子、微波、超声波、电磁波、激光射线和宇宙射线等。近年来，离子注入法、超高压、离子辐射诱变育种也是诱变育种的新方法。
2.1、离子注入法
离子注入法是近几年新发展起来的物理诱变方法；更具有设备简单、使用方便，成本低廉、对人体和环境无害等优点[3]，在微生物的育种研究方面已广泛用于实践生产中。其诱变原理是微生物在核能离子注入后，受到不同程度的损伤，大到整个细胞形态、各种亚细胞结构的变化，小到组成细胞的生物大分子的变形，从而导致基因突变[4]。许安等[5]以生产VC的2一酮基一L一古龙酸高产菌系为出发菌株，进行离子注入育种，选育出了高产菌系：糖酸转化率提高15％一20％、4代传种平均转化率达95％，并进行了培养基优化和摇瓶发酵检测，为所选的IPPM-1028菌系的扩大生产提供了依据。同时，向砥等[6]利用离子注入选育高产壮观链霉菌，获得高产菌株，效价较出发菌株提高了102.3％。
2.2、超高压
高压导致细胞体积减小, 胞内物质浓缩, 使得先前互不接触的各种酶、蛋白质及核酸类物质接触, 这种接触必然会导致一些不可预测的反应发生。超高压可作为一种很有前景的新诱变方法，并且具有无污染、操作简单等优点。李文革等[7] 用220MPa 高压处理大肠杆菌TGl、DH5A和HB101, 得到了耐压的突变株TG1P、DH5AP 和HB101P。此外，王岁楼等[8]利用超高压技术对红酵母Rhodotorula glutinis NR06进行诱变处理,在300 M Pa处理10min时获得一突变株NR06-H39,其β-胡萝卜素产量达到9.64 mg/L,比出发菌株NR06的6.30 mg/L提高了53.02%,且遗传稳
定性良好。可见，超高压是一种很好的诱变育种方法。
2.3、离子辐射诱变
离子束具有高传能线性密度(Let),且在射程的末端还有尖锐的电离峰(Bragg峰)。这使重离子能在生物介质中产生高密度的电离和激发事件,同时产生的高活度自由基造成间接损伤,从而引起较强的生理生化作用,可引起染色体的重复、易位、倒位、缺失或使DNA分子取代、补充、断裂等。程备久[9]等利用30Kev的N+、Ar+离子辐照离体质粒DNA，分析了不同离子对DNA单双链断裂及转化活性的影响。试验表明N+，Ar+离子对质粒DNA损伤的差异可能主要是溅射作用的大小不同造成的。Ar+离子质量数大，因而可产生比N+离子更强的溅射作用，从而导DNA单双链断裂的频率高于N+离子。
3、化学诱变
化学诱变方法是指使用化学物质处理微生物使其性状发生改变的方法。化学诱变的作用机制与物理诱变剂有很大区别，其作用机制都是与 DNA起化学作用。化学诱变剂往往具有专一性，它们对基因的某部位发生作用,对其余部位则无影响。常用的化学诱变剂有：碱基的修饰剂、碱基类似物、DNA插入剂。
3.1、碱基的修饰剂
碱基的修饰剂并不是掺入到DNA中，而是通过直接地修饰碱基的化学结构，改变其性质而导致诱变。常用的碱基修饰剂有烷化剂、亚硝酸和羟胺等。 在以羟胺为诱变剂方面，高德喜等[10]，通过将化学诱变剂盐酸经胺加人培养基中对出,发菌株进行诱变育种, 筛选得到的高产菌株239#发酵单位明显高于出发菌株232#, 提高了11.11％。而在亚硝酸方面，赵静岩等[11]研究了NTG浓度、处理时间和不同缓冲液对卡那霉素链霉菌杀菌率和效价变异频率的影响，找到了最适诱变条件，筛选出了两株高产突变菌株K-102和K-41，在生产上分别取得了增产26％和43.68％的显著效果。
3.2、碱基类似物
碱基类似物是一类化学结构与DNA中正常碱基十分相似的化学制剂；它在DNA复制时，它们可以被错误地掺入DNA，引起诱变效应。这类诱变剂有5-溴尿嘧啶、5-氟尿嘧啶、8-氮鸟嘌呤等。近几年，在微生物育种方面取得很大进展，程世清等[12]用5-BU对产色素菌(分枝杆菌T17—2—39)细胞进行诱变，生物量平均提高22．5％。张建云等[13]在对野油菜黄单胞菌的α-淀粉酶基因进行的体外诱变中，采用基因体外定向进化策略中易错PCR技术,用碱基类似物5-溴脱氧尿苷三磷酸(5-BrdUTP)部分取代脱氧胸苷三磷酸(dTTP),对野油菜黄单胞菌的α-淀粉酶基因进行了体外诱变。通过鉴别培养基进行筛选,得到5个具有高酶活的诱变基因,通过出发基因序列进行比较,分析了突变位点和酶功能变化的相应关系。结果显示基因诱变后酶活的改变主要是由淀粉酶基因空间结构的改变而引起的,而不是由启动子的变化引起的。
3.3、DNA插入剂
DNA插入剂是通过插入到DNA双螺旋双链或单链的两个相邻的碱基之间，起到插入诱变的作用，碱基的缺失或增加，引起移码突变，导致遗传特性的改变。在这方面也研究出许多成果。顾真荣等[14]在对枯草芽孢杆菌G3抗真菌活性改良的研究中（顾真荣，2008），用诱变剂吖啶橙诱变得到20个突变株,其中5个突变株Ga1、Ga8、Ga12、Ga1和Ga19在肉汤和PDA平板上形成粘液状菌落,完全不同于出发菌株。PDA平板抑菌圈试验,突变株对番茄叶霉菌和黄瓜灰霉菌产生比野生株G3更大的透明抑菌圈。其中Ga1菌株对番茄叶霉菌和黄瓜灰霉菌的抑菌带
宽分别是G3的1.71和1.69倍。用番茄叶霉菌为指示菌的生物测定结果表明,突变株固体培养物或摇瓶培养物以最小抑菌浓度(MIC)和有效抑菌中浓度(EC50)表示的抗真菌活性皆高于G3菌株。突变株Ga1抗真菌活性最强。摇瓶培养时, Ga1菌株产生比G3更多的伊枯草菌素A。Ga1菌株增强了合成伊枯草菌素A的能力。
4、复合诱变
物理和化学诱变剂具有不同的诱变效应, 在诱变育种中常使用2种或2种以上的诱变剂复合处理来提高诱变效应。复合诱变包括: 2种或多种诱变剂的先后使用; 同一种诱变剂的重复作用; 2种或多种诱变剂的同时使用[15]。复合诱变处理,在微生物育种方面已经取得了很好的效果。例如：赵丽坤等[16]，通过紫外线- 氯化锂(LiCl) 和紫外线- 亚硝基胍(NTG) 对阿维链霉菌N2526 进行了复合诱变处理。发现，以1. 00 mol/ L 的LiCl 和60s 的紫外线照射时间以及以45 s 的UV 照射时间和0. 8 mg/ ml 的NTG浓度分别对出发菌株进行复合诱变处理,通过筛选得到13 株总效价比出发菌株提高了20 %以上的突变株,经HPLC 检测,其中7 株B 1a组分含量较高,均在45 %以上。菌株H02180 的B1a含量达到了51. 35 %,比出发菌株N2526 的B1a含量提高了65. 1 %;菌株H02108的B1a含量达到了51. 26 %,比出发菌株N2526 的含量提高了64. 8 %。李永泉等[17]，在微波诱变和激光诱变相结合选育金霉素链霉菌的研究中，采用激光和微波两种物理因子，对去甲基金霉素生产菌.金霉素链霉素进行诱变处理，选育到一株产量较高的生产菌HL11，发酵效价从2831u/ml提高到4683u/ml，提高了65.4％。所选育的菌株经多次传，遗传性状非常稳定。
5、结语
虽然随着基因工程的出现，各种各样新的微生物育种方法一直在不断地出现，如：原生质体融合育种、基因工程育种等方法，但是诱变育种仍在微生物育种占据着很重要的位置。虽然诱变育种操作简单，收率高、快速和正突变率高。但存在着很大的盲目性和随机性，诱变育种主要靠后期的筛选工作，这样工作量很大。在微生物育种的方法选用上，我们应该从这几个方面考虑：（1）收率高，稳定遗传性高；（2）能工业化大量生产；（3）生产设备费用低，操作简单；（4）菌种对环境没有污染。
诱变育种方法有很大的研究价值，前景很好。在以后的研究中，尽量能发生正向突变的育种方法。
参考文献：
[1]杨汝德.现代工业微生物学教程[M].北京：高等教育出版社，2006.1.
[2]施巧琴，吴松刚.工业微生物育种学[M].北京:科学出版社，2003.
[3]赵树欣，李春明．离子注入与紫外诱变筛选产高级醇低的果酒酵母．酿酒科技，2O06．No．1l(Vol．149)．
[4]陈立梅，汪旭.等.链霉菌诱变育种方法综述[J].吉林农业科学,2006,31(2):62-封三.
[5]许安，姚建铭，余增亮．离子注入维生素c二步发酵混合菌研究(I)2-酮基一L一古龙酸高产菌系IPPM一1028的选育[J]．工业微生物，1998，28(4）：21-23．
[6]向砥.等.离子注入选育高产壮观霉素的研究[J].激光生物学报，2002,11(4):276-279.
[7]李文革, 彭 玲, 刘宣承。产生菌黑曲霉Co9-6 的研究[J]. 激光生物学, 1994, 3 ( 3) : 509- 5121
[8]王岁楼，陈德经，邓百万. 红酵母超高压诱变及其β-胡萝卜素发酵条件的初步研究[J]. 食品科学. 2007(9): 409-414.
[9]程备久，朱苏文，李培金.等．不同离子辐照对离体质粒DNA损伤与转化活性的影响[J]．激光生物学报，2001，
10(1)：40—43．
[10]高德喜,白铁忠.青霉素产生菌的诱变育种[J].黑龙江医药，2004，NO.5
[11]赵静岩等.卡那霉素链霉菌亚硝基腿诱变育种[J].遗传，1980,2（3）：17-19
[12]程世清.产色素菌T17—2—39的诱变育种实验[J].江苏食品与发酵，2000，102(2)：9-12．
[14]顾真荣，陈伟，程洪斌等. 吖啶橙诱变提高枯草芽孢杆菌G3抗真菌活性[J]. 植物病理学报. 2008(2): 185-191.
[15]李荣杰.微生物诱变育种方法研究进展[J].河北农业科学.2009, 13 ( 10 ) : 73- 76, 78
[16]赵丽坤,张利平.等.阿维菌素高产菌的诱变育种研究[J].安徽农业科学.2008 ,36 (19) :8062 - 8064
[17]李永泉.等.微波诱变和激光诱变相结合选育金霉素链霉菌的研究[J].生物工程学报.1998,14(4)
陈贵翠
100603029
生工10级3班