荧光分析技术是一种强大的分析手段，广泛地应用在临床检验、生物学研究、农业科学、食品和环境科学中，是多功能酶标仪的重要应用，如TECAN(M1000、M200等)，Thmeral(Varioskan Flash)，Bio-tek(Synergy 4等)，MD(M2、M5)都可以应用于荧光检测。
1.概述
室温下，大多数分子处于基态的最低振动能级，处于基态的分子吸收能量(光能、化学能、电能或热能)后跃迁至激发态，激发态不稳定，将很快衰变到基态，以光的形式放出能量，这种现象称为“发光现象”。分子发光包括荧光，磷光，化学发光，生物发光等。受到光照时发光，光照切断时发光立即消失的叫荧光，光照切断时，发光逐渐变弱以致消失的叫磷光，吸收化学反应的化学能量而发光叫化学发光，由生物能转变为光辐射的称作生物发光。
由于发光物质不同荧光有分子荧光和原子荧光之分，分子荧光为带光谱，原子荧光为线光谱，通常所说的荧光为分子荧光。通过测定所发射荧光的特性和强度，可以对物质进行定性、定量分析。
2.荧光检测技术
2.1荧光强度(FI)
荧光强度与荧光物质的浓度成正比，这是荧光分析法是量分析的依据。在生物学上的应用非常广泛，可以进行生物大分子定量，酶活性分析，荧光免疫分析，细胞学分析(细胞增殖，细胞毒理，细胞吸附等)和分子间相互作用。
2.1.1细胞凋亡检测
Caspase家族在介导细胞凋亡的过程中起着非常重要的作用，其中Caspase-3为关键的执行分子，它在凋亡信号传导的许多途径中发挥功能。Caspase-3正常以酶原(32KD)的形式存在于胞浆中，在凋亡的早期阶段，它被激活，活化的Caspase-3由两个大亚基(17KD)和两个小亚基(12KD)组成，裂解相应的胞浆胞核底物，最终导致细胞凋亡。但在细胞凋亡的晚期和死亡细胞，caspase-3的活性明显下降。
设计出荧光物质偶联的短肽Z-DEVD-AMC。在共价偶联时，AMC不能被激发荧光，短肽被水解后释放出AMC，自由的AMC才能被激发发射荧光(图1)。根据释放的AMC荧光强度的大小，可以测定 caspase-3的活性，从而反映Caspase-3被活化的程度。
Z-DEVD-AMC------AMC
Nonfluorescent Fluorescent
图1. Caspase-3水解Z-DEVD- AMC
2.1.2细胞毒性的检测
体外细胞毒性研究对于检测新的生物来源或人工合成的细胞毒素以及例行的临床相关的检测都有着重要的意义。细胞膜非渗透性的核染料 Propidium iodide能穿透损伤的细胞膜，荧光密度越高反映出其受损细胞越多。
2.1.3钙流检测
Fura-2、indo-1、Quin-2是Ca2+荧光指示
剂，可以灵敏地反映细胞内钙离子浓度的变化，当结合钙离子时，最大激发波长会发生改变，发射荧光的强度和结合的Ca2+浓度有着定量的关系。
2.2荧光偏振(FP)
1926年Perrin首先描述了荧光偏振理论，溶液中的荧光分子在受到偏振光照射时，可吸收并释放出相应的偏振荧光，如果在激发时荧光物质处于静止状态，发射光将保持原有激发光的偏振性，如果其处于运动状态，发射光电偏振偏振平面将不同于原有激发光的偏振特性，这就是荧光偏振现象，荧光分子与其它因子的相互作用，例如相互结合或排斥;其所处环境的性质，例如溶液的粘度、温度等，这些因素都有可能对这个荧光因子受激发后发出的发射光的发射平面产生影响。因此以荧光偏振为基础发展的技术可用来研究生命科学中分子之间的相互作用，如受体配体结合分析，DNA-蛋白质结合分析，SNP分析，酶活性分析。
荧光偏振分析所需的样品量少，灵敏度高，可达亚纳摩尔级范围，重复性好，操作简便，也更为安全可靠，不会在实验过程中生成有害的放射性废物，此外荧光偏振是真正均相的，允许实时检测(动力学检测)，对于浓度变化不敏感，是均相检测形式(中间不含洗涤步骤)的最佳解决方案。
目前市场上多款酶标仪都可以用来做荧光偏振检测，Invitrogene公司专门利用Predictor? hERG对多款酶标仪进行荧光偏振测试分析(表1)。
2.3时间分辨荧光(TRF)
在做荧光测定的时候，由于背景荧光信号干扰，使用传统的发色团进而进行荧光检测的灵敏度就会严重下降。大部分背景荧光信号是短时存在的，因此使用长衰减寿命的标记物就可以使瞬时荧光干扰减到最小化。
时间分辨荧光是用稀土元素作为标记物，稀土三价离子的电子云的结构会一定程度上限制了电子的迁移，导致这类元素发生的荧光的衰减周期通常是很长的，从而消除背景荧光的干扰 大大提高检测的灵敏度(表2)。应用稀土元素作标记物的另一个好处是激发光与发射光峰值Stoke 位移大。这就可消除激发光和散射光的干扰，同时, 被激发的荧光光带极窄, 荧光的发射峰非常尖锐, 可使仪器调整在极窄的波长范围内测定, 极大地降低了来自背景的各种干扰。
时间分辨荧光灵敏度高、特异性强、稳定性好、标记物制备简便、检测重复性好、操作流程短，适用于生物学、医学上的超微量分析，像激素检测，病毒性肝炎标志物检测，靶向细胞的标记检测以及药物筛选等方面。
2.4荧光共振能量传递(FRET)
荧光共振能量传递现象是Perrin在20世纪初首先发现的，1948年，Foster创立了理论原
理，指荧光能量供体与受体间通过偶极-偶极耦合作用转移能量的过程，这种能量的转移是非放射性的，产生FRET的条件主要有三个：(1)供体与受体间足够靠近(1～10 nm);(2)供体的发射光谱与受体的激发光谱有一定的重叠;(3)给体与受体的偶极具一定的空间取向，这是偶极-偶极耦合作用的条件。
荧光共振能量传递因为要考虑到供体和受体之间的距离，所以经常用来研究分子间的相互作用，像蛋白质的相互作用，抗原抗体结合，受体与配体的结合，另外在膜反应、离子通道等方面的研究也有相应应用。将FRET荧光探针标记的肽链，加入到固体表面的双层膜中，通过荧光漂白恢复(FRAP)成像技术检测，为研究跨膜螺旋二聚作用提供一个新的方法。用FRET标记细胞质，应用时间分辨技术，检测其对P2X离子通道的门控作用。
利用Eu等长效荧光物质作为供体，来进行荧光共振能量传递，在激发光熄灭后受体仍能较长的能量衰减时间，能量传递效率更高，可检测的相互作用距离更长，可达到100-200nm，时间延迟检测，降低了背景噪音，提高了灵敏度.
3.总结
荧光法灵敏、准确、兼容性强、可以利用荧光分子对目标物质进行特异性标记大大减少杂质的信号干扰，荧光特性参数多，动态线性范围宽、可以活细胞活活体检测，灵敏度比分光光度法高2～4个数量级，对微量和痕量药物进行灵敏准确的检测具有较大的优越性。总之荧光法作为一种高灵敏的分析手段，与其它技术相结合，有着更广阔的发展前景。
根据比尔定律，吸光度A与吸光物质的浓度c和吸收池光程长b的乘积成正比。当c的单位为g/L，b的单位为cm时，则 A = abc，比例系数a称为吸收系数，单位为L/g.cm；当c的单位为mol/L，b的单位为cm时，则 A = εbc，比例系数ε称为摩尔吸收系数，单位为L/mol.cm，数值上ε等于a与吸光物质的摩尔质量的乘积。它的物理意义是：当吸光物质的浓度为1 mol/L，吸收池厚为1cm，以一定波长的光通过时，所引起的吸光度值A。ε值取决于入射光的波长和吸光物质的吸光特性，亦受溶剂和温度的影响。显然，显色反应产物的ε值愈大，基于该显色反应的光度测定法的灵敏度就愈高。
分光光度计对核酸蛋白的定量与分析
分光光度计对核酸蛋白的定量与分析分光光度计已经成为现代分子生物实验室常规仪器。常用于核酸，蛋白定量以及细菌生长浓度的定量。分光光度计采用一个可以产生多个波长的光源，通过系列分光装置，从而产生特定波长的光源，光源透过测试的样品后，部分光源被吸收，计算样品的吸光值，从而转化成样品的浓度。样品的吸光值与样品的
浓度成正比。
核酸的定量
核酸的定量是分光光度计使用频率最高的功能。可以定量溶于缓冲液的寡核苷酸，单链、双链DNA，以及RNA。核酸的最高吸收峰的吸收波长260nm。每种核酸的分子构成不一，因此其换算系数不同。定量不同类型的核酸，事先要选择对应的系数。如：1 OD 的吸光值分别相当于50μg/ml的dsDNA，37μg/ml的ssDNA，40μg/ml的RNA，30μg/ml的Olig。测试后的吸光值经过上述系数的换算，从而得出相应的样品浓度。测试前，选择正确的程序，输入原液和稀释液的体积，尔后测试空白液和样品液。然而，实验并非一帆风顺。读数不稳定可能是实验者最头痛的问题。灵敏度越高的仪器，表现出的吸光值漂移越大。
蛋白质的直接定量(UV法)
这种方法是在280nm波长，直接测试蛋白。选择Warburg 公式，光度计可以直接显示出样品的浓度，或者是选择相应的换算方法，将吸光值转换为样品浓度。蛋白质测定过程非常简单，先测试空白液，然后直接测试蛋白质。由于缓冲液中存在一些杂质，一般要消除320nm 的“背景”信息，设定此功能“开”。与测试核酸类似，要求A280的吸光值至少大于0.1A，最佳的线性范围在1.0-1.5之间。实验中选择Warburg公式显示样品浓度时，发现读数“漂移”。这是一个正常的现象。事实上，只要观察A280的吸光值的变化范围不超过1%，表明结果非常稳定。漂移的原因是因为Warburg公式吸光值换算成浓度，乘以一定的系数，只要吸光值有少许改变，浓度就会被放大，从而显得结果很不稳定。蛋白质直接定量方法，适合测试较纯净、成分相对单一的蛋白质。紫外直接定量法相对于比色法来说，速度快，操作简单;但是容易受到平行物质的干扰，如DNA的干扰;另外敏感度低，要求蛋白的浓度较高。
比色法蛋白质定量
蛋白质通常是多种蛋白质的化合物，比色法测定的基础是蛋白质构成成分：氨基酸(如酪氨酸，丝氨酸)与外加的显色基团或者染料反应，产生有色物质。有色物质的浓度与蛋白质反应的氨基酸数目直接相关，从而反应蛋白质浓度。
比色方法一般有BCA，Bradford，Lowry等几种方法。
事实上，分光光度计的设计原理和工作原理，允许吸光值在一定范围内变化，即仪器有一定的准确度和精确度。如Eppendorf Biophotometer的准确度≤1.0%(1A)。这样多次测试的结果在均值1.0%左右之间变动，都是正常的。另外，还需考虑核酸本身物化性质和溶解核酸的缓冲液的pH值，离子浓度等：在测试时，离子浓度太高，也会导致读数漂移，因此建议使用pH值一定、离子浓度较低的缓冲液，如TE，可大大稳定读数。
样品的稀释浓度同样是不可忽视的因素：由于样品中不可避免存在一些细小的颗粒，尤其是核酸样品。这些小颗粒的存在干扰测试效果。为了最大程度减少颗粒对测试结果的影响，要求核酸吸光值至少大于0.1A，吸光值最好在0.1-1.5A。在此范围内，颗粒的干扰相对较小，结果稳定。从而意味着样品的浓度不能过低，或者过高(超过光度计的测试范围)。最后是操作因素，如混合要充分，否则吸光值太低，甚至出现负值;混合液不能存在气泡，空白液无悬浮物，否则读数漂移剧烈;必须使用相同的比色杯测试空白液和样品，否则浓度差异太大;换算系数和样品浓度单位选择一致;不能采用窗口磨损的比色杯;样品的体积必须达到比色杯要求的最小体积等多个操作事项。
除了核酸浓度，分光光度计同时显示几个非常重要的比值表示样品的纯度，如A260/A280的比值，用于评估样品的纯度，因为蛋白的吸收峰是280nm。纯净的样品，比值大于1.8(DNA)或者2.0(RNA)。如果比值低于1.8 或者2.0，表示存在蛋白质或者酚类物质的影响。A230表示样品中存在一些污染物，如碳水化合物，多肽，苯酚等，较纯净的核酸A260/A230的比值大于2.0。A320检测溶液的混浊度和其他干扰因子。纯样品，A320一般是0。
Caspase家族是一类半胱氨酸-天冬氨酸蛋白酶,主要存在于细胞质中,能特异性断裂蛋白的天冬氨酸位点,是细胞凋亡中的关键因子。尤其caspase-3作为凋亡的执行者,能够启动凋亡的信号并级联放大,从而引起细胞凋亡。细胞凋亡不仅仅是多细胞生物体的正常机能,而且还能够引发各种疾病:通过神经元细胞的凋亡可引起神经退行性疾病,如阿尔茨海默症、帕金森症等;由于心肌细胞的凋亡可引发一系列心血管疾病,常见的有动脉粥样硬化、心肌炎、心律不齐等等;还有报道细胞凋亡与Ι型糖尿病也相关。因此,开发以caspase-3为靶点的抑制剂对于治疗这些重大疾病具有广阔的前景。本论文首先从caspase-3重组质粒的构建开始,将大小亚基作为一整体进行低温诱导、促可溶的表达,尝试了几种载体和不同宿主内的表达,最终发现以pET-28b(+)为载体,在BLP宿主中可以相对的提高可溶形式的目的蛋白表达量。重组蛋白经金属鏊和层析分离纯化,利用酶标仪检测活性。并对重组caspase-3蛋白酶进行了酶学表征。然后以caspase-3为分子靶点,以我国丰富的中药资源为基础,利用已建立的中药文库,应用生物化学、酶学方法对中药文库进行初步的筛选和鉴定,以期筛选出具有理想效果的天然产物抑制剂,从而开发出以caspase-3为靶点的新药。实验结果表明,我们获得了高纯度和高活性的重组蛋白caspase-3,并通过酶学方法得到表征,利
用酶学手段,我们从部分中药中初步筛选出了对caspase-3有明显抑制作用的中药:莲须和鸡血藤。这些结果表明,我们成功表达的重组caspase-3蛋白,能够应用于中药文库caspase-3抑制剂的筛选,这为中药理论的研究提供了实验依据,对药物的开发和创新具有一定积极的影响
碘化丙锭(propidiumiodid,PI):目的探讨严重创伤后肝细胞凋亡及坏死在急性肝功能障碍发病机制中的作用.方法复制多发性骨折合并休克的大鼠创伤模型,采用Annexin-V-Flous、碘化丙锭(propidiumiodid,PI)双标法经流式细胞仪检测创伤后各时间点肝细胞凋亡与坏死的数量变化,结合光镜、电镜和电泳观察细胞凋亡与坏死,并与肝功能变化相比较.结果创伤后早期肝细胞即发生凋亡和坏死,坏死肝细胞的数量进行性升高,与肝功能变化显著呈正相关;凋亡肝细胞在创伤后3 h达高峰,部分凋亡肝细胞发生继发性坏死,其数量与肝功能变化显著正相关.结论肝细胞坏死与凋亡是严重创伤后肝功能损害的重要原因,坏死肝细胞是肝功能损害的直接因素,凋亡肝细胞通过发生继发性坏死加重肝功能损害.
激活黑色素浓集荷尔蒙(melanin concentrating hormone,MCH)受体可引起细胞内钙浓度的变化,通过检测钙浓度的变化可以反映受体的功能.
钙离子是机体的重要元素，同时作为细胞内第二信使通过与钙调蛋白（Calmodulin，CaM）结合激活多种蛋白激酶（如腺苷酸环化酶、磷酸二酯酶、钙调蛋白激酶等）及诸多蛋白水解酶和核酸酶，从而参与包括细胞代谢、细胞周期等多种细胞功能的调节，在细胞的许多生命活动中担当着重要的角色。因此，钙离子测定在医学实验研究中有着重要意义。
钙离子测定技术得益于两种近代实验技术，一是钙激活蛋白及荧光指示剂（或称荧光探针），二是荧光检测及成像分析，这些技术的日臻成熟使我们能够观察到许多与钙离子浓度变化有密切关系的亚细胞现象。近年来，数字CCD成像荧光显微镜、激光共聚焦扫描显微镜、多光子扫描显微镜、流式细胞仪等技术的发展，使我们不但能够精确地测定出钙离子浓度的变化，还可以得出准确的亚细胞水平空间定位。
对钙荧光指示剂的开发经历了以下过程：
第一代钙荧光指示剂，包括Quin 1、Quin 2、Quin 3，其中Quin 2的准确度较高，对钙的亲和力强，适于静态细胞钙的测定，在339nm激发后，与Ca2+结合后的发射荧光会增高5~6倍；当在365nm激发时，发射荧光降低，这样就可用它做双激发Ratio图。但有对温度敏感、激发波长较短、光稳定性差等缺点，且所需的Quin 2浓度较高，要达到0.5mmol/才能高出背景荧光，由于用UV激发会产生较强的细胞毒及自发荧光干扰。
第二代钙荧
光指示剂，包括Fura 1、Fura 2、Fura 3、Indo 1，其中Fura 2最好。Fura 2是典型的双激发荧光指示剂，与Ca2+结合后导致荧光光谱移动，当被Ca2+饱和后，340 nm处激发荧光强度上升3倍，而380 nm处激发荧光强度下降10倍，340nm/380nm的荧光强度比值能够更好的反映Ca2+浓度变化，故准确度较高。与Quin 2相比，Fura 2分子中的吠喃环和晤哇环提高了它的离子选择性和荧光强度。Indo 1也是典型的双发射荧光指示剂，具有Fura 2的优点，不同的是在350 nm激发后的发射峰由游离态时的485 nm移至饱和态时的410 nm ，410/480 nm的荧光比值与Ca2+浓度成正比。
第三代钙荧光指示剂，Fluo 3是典型的单波长指示剂，吸收和发射峰分别位于506 nm和526 nm，可以在远离340～380 nm波长范围内测得荧光。Fluo 3结合Ca2+后的荧光强度比游离态的高出35～40倍，从而避免了透镜吸收和细胞自身的荧光干扰。Fluo 3是一种长波指示剂，激发波长（488nm）位于可见光，光源易找到，价格便宜，对Ca2+反应灵敏，目前受到广泛的应用，可作为激光共聚焦成像以及与其它类型荧光指示剂结合作双标记研究当使用单光子或多光子激光激发时，由于激发波长是固定的，所以应该选择合适的指示剂使它在激光波长范围内能够产生最大的吸收，因此钙离子指示剂的发射波谱是最重要因素。在选择指示剂时需要考虑的另一个因素是它们的化学形式，现在商品化的钙离子指示剂有盐类（酸）、酯类和葡聚糖结合物，指示剂的化学构成形式不同，将其导入细胞时所采取的方法也不尽相同。选择指示剂时还需考虑的重要因素是钙离子结合的亲和性，反映在解离常数（Kd）上，当钙离子浓度在0.1×Kd~10×Kd范围变动时，指示剂的吸收和发射波谱或发射的荧光强度随之发生变化。
根据钙荧光指示剂的种类不同标记的方法也略有差异，常用的标记方法有酯标记方法、显微注射法、膜片鉗技术、利用缝隙连接分布、ATP诱导、刮除标记、脂转移标记、电击法、酸导人法等。在使用中潜在的问题主要有细胞内缓冲作用、细胞毒性作用、自发荧光、光漂白、隔室化和染料渗漏等，随着新型钙荧光指示剂的不断出现和标记技术的改进，这些问题逐渐在减少。
荧光分析技术是一种强大的分析手段，广泛地应用在临床检验、生物学研究、农业科学、食品和环境科学中，是多功能酶标仪的重要应用，如TECAN(M1000、M200等)，Thmeral(Varioskan Flash)，Bio-tek(Synergy 4等)，MD(M2、M5)都可以应用于荧光检测。
1.概述
室温下，大多数分子处于基态的最低振动能级，处于基态的分子吸收能量(光能、化学能、电能或热能)后跃迁至激发态，激发态不稳定，将很快衰变到基态，以光的形式放出能量，这种现象称为“发光现象”。分子发光包括荧光，磷光，化学发光，生物发光等。受到光照时发光，光照切断时发光立即消失的叫荧光，光照切断时，发光逐渐变弱以致消失的叫磷光，吸收化学反应的化学能量而发光叫化学发光，由生物能转变为光辐射的称作生物发光。
由于发光物质不同荧光有分子荧光和原子荧光之分，分子荧光为带光谱，原子荧光为线光谱，通常所说的荧光为分子荧光。通过测定所发射荧光的特性和强度，可以对物质进行定性、定量分析。
2.荧光检测技术
2.1荧光强度(FI)
荧光强度与荧光物质的浓度成正比，这是荧光分析法是量分析的依据。在生物学上的应用非常广泛，可以进行生物大分子定量，酶活性分析，荧光免疫分析，细胞学分析(细胞增殖，细胞毒理，细胞吸附等)和分子间相互作用。
2.1.1细胞凋亡检测
Caspase家族在介导细胞凋亡的过程中起着非常重要的作用，其中Caspase-3为关键的执行分子，它在凋亡信号传导的许多途径中发挥功能。Caspase-3正常以酶原(32KD)的形式存在于胞浆中，在凋亡的早期阶段，它被激活，活化的Caspase-3由两个大亚基(17KD)和两个小亚基(12KD)组成，裂解相应的胞浆胞核底物，最终导致细胞凋亡。但在细胞凋亡的晚期和死亡细胞，caspase-3的活性明显下降。
设计出荧光物质偶联的短肽Z-DEVD-AMC。在共价偶联时，AMC不能被激发荧光，短肽被水解后释放出AMC，自由的AMC才能被激发发射荧光(图1)。根据释放的AMC荧光强度的大小，可以测定 caspase-3的活性，从而反映Caspase-3被活化的程度。
Z-DEVD-AMC------AMC
Nonfluorescent Fluorescent
图1. Caspase-3水解Z-DEVD- AMC
2.1.2细胞毒性的检测
体外细胞毒性研究对于检测新的生物来源或人工合成的细胞毒素以及例行的临床相关的检测都有着重要的意义。细胞膜非渗透性的核染料 Propidium iodide能穿透损伤的细胞膜，荧光密度越高反映出其受损细胞越多。
2.1.3钙流检测
Fura-2、indo-1、Quin-2是Ca2+荧光指示
剂，可以灵敏地反映细胞内钙离子浓度的变化，当结合钙离子时，最大激发波长会发生改变，发射荧光的强度和结合的Ca2+浓度有着定量的关系。
2.2荧光偏振(FP)
1926年Perrin首先描述了荧光偏振理论，溶液中的荧光分子在受到偏振光照射时，可吸收并释放出相应的偏振荧光，如果在激发时荧光物质处于静止状态，发射光将保持原有激发光的偏振性，如果其处于运动状态，发射光电偏振偏振平面将不同于原有激发光的偏振特性，这就是荧光偏振现象，荧光分子与其它因子的相互作用，例如相互结合或排斥;其所处环境的性质，例如溶液的粘度、温度等，这些因素都有可能对这个荧光因子受激发后发出的发射光的发射平面产生影响。因此以荧光偏振为基础发展的技术可用来研究生命科学中分子之间的相互作用，如受体配体结合分析，DNA-蛋白质结合分析，SNP分析，酶活性分析。
荧光偏振分析所需的样品量少，灵敏度高，可达亚纳摩尔级范围，重复性好，操作简便，也更为安全可靠，不会在实验过程中生成有害的放射性废物，此外荧光偏振是真正均相的，允许实时检测(动力学检测)，对于浓度变化不敏感，是均相检测形式(中间不含洗涤步骤)的最佳解决方案。
目前市场上多款酶标仪都可以用来做荧光偏振检测，Invitrogene公司专门利用Predictor? hERG对多款酶标仪进行荧光偏振测试分析(表1)。
2.3时间分辨荧光(TRF)
在做荧光测定的时候，由于背景荧光信号干扰，使用传统的发色团进而进行荧光检测的灵敏度就会严重下降。大部分背景荧光信号是短时存在的，因此使用长衰减寿命的标记物就可以使瞬时荧光干扰减到最小化。
时间分辨荧光是用稀土元素作为标记物，稀土三价离子的电子云的结构会一定程度上限制了电子的迁移，导致这类元素发生的荧光的衰减周期通常是很长的，从而消除背景荧光的干扰 大大提高检测的灵敏度(表2)。应用稀土元素作标记物的另一个好处是激发光与发射光峰值Stoke 位移大。这就可消除激发光和散射光的干扰，同时, 被激发的荧光光带极窄, 荧光的发射峰非常尖锐, 可使仪器调整在极窄的波长范围内测定, 极大地降低了来自背景的各种干扰。
时间分辨荧光灵敏度高、特异性强、稳定性好、标记物制备简便、检测重复性好、操作流程短，适用于生物学、医学上的超微量分析，像激素检测，病毒性肝炎标志物检测，靶向细胞的标记检测以及药物筛选等方面。
2.4荧光共振能量传递(FRET)
荧光共振能量传递现象是Perrin在20世纪初首先发现的，1948年，Foster创立了理论原
理，指荧光能量供体与受体间通过偶极-偶极耦合作用转移能量的过程，这种能量的转移是非放射性的，产生FRET的条件主要有三个：(1)供体与受体间足够靠近(1～10 nm);(2)供体的发射光谱与受体的激发光谱有一定的重叠;(3)给体与受体的偶极具一定的空间取向，这是偶极-偶极耦合作用的条件。
荧光共振能量传递因为要考虑到供体和受体之间的距离，所以经常用来研究分子间的相互作用，像蛋白质的相互作用，抗原抗体结合，受体与配体的结合，另外在膜反应、离子通道等方面的研究也有相应应用。将FRET荧光探针标记的肽链，加入到固体表面的双层膜中，通过荧光漂白恢复(FRAP)成像技术检测，为研究跨膜螺旋二聚作用提供一个新的方法。用FRET标记细胞质，应用时间分辨技术，检测其对P2X离子通道的门控作用。
利用Eu等长效荧光物质作为供体，来进行荧光共振能量传递，在激发光熄灭后受体仍能较长的能量衰减时间，能量传递效率更高，可检测的相互作用距离更长，可达到100-200nm，时间延迟检测，降低了背景噪音，提高了灵敏度.
3.总结
荧光法灵敏、准确、兼容性强、可以利用荧光分子对目标物质进行特异性标记大大减少杂质的信号干扰，荧光特性参数多，动态线性范围宽、可以活细胞活活体检测，灵敏度比分光光度法高2～4个数量级，对微量和痕量药物进行灵敏准确的检测具有较大的优越性。总之荧光法作为一种高灵敏的分析手段，与其它技术相结合，有着更广阔的发展前景。
根据比尔定律，吸光度A与吸光物质的浓度c和吸收池光程长b的乘积成正比。当c的单位为g/L，b的单位为cm时，则 A = abc，比例系数a称为吸收系数，单位为L/g.cm；当c的单位为mol/L，b的单位为cm时，则 A = εbc，比例系数ε称为摩尔吸收系数，单位为L/mol.cm，数值上ε等于a与吸光物质的摩尔质量的乘积。它的物理意义是：当吸光物质的浓度为1 mol/L，吸收池厚为1cm，以一定波长的光通过时，所引起的吸光度值A。ε值取决于入射光的波长和吸光物质的吸光特性，亦受溶剂和温度的影响。显然，显色反应产物的ε值愈大，基于该显色反应的光度测定法的灵敏度就愈高。
分光光度计对核酸蛋白的定量与分析
分光光度计对核酸蛋白的定量与分析分光光度计已经成为现代分子生物实验室常规仪器。常用于核酸，蛋白定量以及细菌生长浓度的定量。分光光度计采用一个可以产生多个波长的光源，通过系列分光装置，从而产生特定波长的光源，光源透过测试的样品后，部分光源被吸收，计算样品的吸光值，从而转化成样品的浓度。样品的吸光值与样品的
浓度成正比。
核酸的定量
核酸的定量是分光光度计使用频率最高的功能。可以定量溶于缓冲液的寡核苷酸，单链、双链DNA，以及RNA。核酸的最高吸收峰的吸收波长260nm。每种核酸的分子构成不一，因此其换算系数不同。定量不同类型的核酸，事先要选择对应的系数。如：1 OD 的吸光值分别相当于50μg/ml的dsDNA，37μg/ml的ssDNA，40μg/ml的RNA，30μg/ml的Olig。测试后的吸光值经过上述系数的换算，从而得出相应的样品浓度。测试前，选择正确的程序，输入原液和稀释液的体积，尔后测试空白液和样品液。然而，实验并非一帆风顺。读数不稳定可能是实验者最头痛的问题。灵敏度越高的仪器，表现出的吸光值漂移越大。
蛋白质的直接定量(UV法)
这种方法是在280nm波长，直接测试蛋白。选择Warburg 公式，光度计可以直接显示出样品的浓度，或者是选择相应的换算方法，将吸光值转换为样品浓度。蛋白质测定过程非常简单，先测试空白液，然后直接测试蛋白质。由于缓冲液中存在一些杂质，一般要消除320nm 的“背景”信息，设定此功能“开”。与测试核酸类似，要求A280的吸光值至少大于0.1A，最佳的线性范围在1.0-1.5之间。实验中选择Warburg公式显示样品浓度时，发现读数“漂移”。这是一个正常的现象。事实上，只要观察A280的吸光值的变化范围不超过1%，表明结果非常稳定。漂移的原因是因为Warburg公式吸光值换算成浓度，乘以一定的系数，只要吸光值有少许改变，浓度就会被放大，从而显得结果很不稳定。蛋白质直接定量方法，适合测试较纯净、成分相对单一的蛋白质。紫外直接定量法相对于比色法来说，速度快，操作简单;但是容易受到平行物质的干扰，如DNA的干扰;另外敏感度低，要求蛋白的浓度较高。
比色法蛋白质定量
蛋白质通常是多种蛋白质的化合物，比色法测定的基础是蛋白质构成成分：氨基酸(如酪氨酸，丝氨酸)与外加的显色基团或者染料反应，产生有色物质。有色物质的浓度与蛋白质反应的氨基酸数目直接相关，从而反应蛋白质浓度。
比色方法一般有BCA，Bradford，Lowry等几种方法。
事实上，分光光度计的设计原理和工作原理，允许吸光值在一定范围内变化，即仪器有一定的准确度和精确度。如Eppendorf Biophotometer的准确度≤1.0%(1A)。这样多次测试的结果在均值1.0%左右之间变动，都是正常的。另外，还需考虑核酸本身物化性质和溶解核酸的缓冲液的pH值，离子浓度等：在测试时，离子浓度太高，也会导致读数漂移，因此建议使用pH值一定、离子浓度较低的缓冲液，如TE，可大大稳定读数。
样品的稀释浓度同样是不可忽视的因素：由于样品中不可避免存在一些细小的颗粒，尤其是核酸样品。这些小颗粒的存在干扰测试效果。为了最大程度减少颗粒对测试结果的影响，要求核酸吸光值至少大于0.1A，吸光值最好在0.1-1.5A。在此范围内，颗粒的干扰相对较小，结果稳定。从而意味着样品的浓度不能过低，或者过高(超过光度计的测试范围)。最后是操作因素，如混合要充分，否则吸光值太低，甚至出现负值;混合液不能存在气泡，空白液无悬浮物，否则读数漂移剧烈;必须使用相同的比色杯测试空白液和样品，否则浓度差异太大;换算系数和样品浓度单位选择一致;不能采用窗口磨损的比色杯;样品的体积必须达到比色杯要求的最小体积等多个操作事项。
除了核酸浓度，分光光度计同时显示几个非常重要的比值表示样品的纯度，如A260/A280的比值，用于评估样品的纯度，因为蛋白的吸收峰是280nm。纯净的样品，比值大于1.8(DNA)或者2.0(RNA)。如果比值低于1.8 或者2.0，表示存在蛋白质或者酚类物质的影响。A230表示样品中存在一些污染物，如碳水化合物，多肽，苯酚等，较纯净的核酸A260/A230的比值大于2.0。A320检测溶液的混浊度和其他干扰因子。纯样品，A320一般是0。
Caspase家族是一类半胱氨酸-天冬氨酸蛋白酶,主要存在于细胞质中,能特异性断裂蛋白的天冬氨酸位点,是细胞凋亡中的关键因子。尤其caspase-3作为凋亡的执行者,能够启动凋亡的信号并级联放大,从而引起细胞凋亡。细胞凋亡不仅仅是多细胞生物体的正常机能,而且还能够引发各种疾病:通过神经元细胞的凋亡可引起神经退行性疾病,如阿尔茨海默症、帕金森症等;由于心肌细胞的凋亡可引发一系列心血管疾病,常见的有动脉粥样硬化、心肌炎、心律不齐等等;还有报道细胞凋亡与Ι型糖尿病也相关。因此,开发以caspase-3为靶点的抑制剂对于治疗这些重大疾病具有广阔的前景。本论文首先从caspase-3重组质粒的构建开始,将大小亚基作为一整体进行低温诱导、促可溶的表达,尝试了几种载体和不同宿主内的表达,最终发现以pET-28b(+)为载体,在BLP宿主中可以相对的提高可溶形式的目的蛋白表达量。重组蛋白经金属鏊和层析分离纯化,利用酶标仪检测活性。并对重组caspase-3蛋白酶进行了酶学表征。然后以caspase-3为分子靶点,以我国丰富的中药资源为基础,利用已建立的中药文库,应用生物化学、酶学方法对中药文库进行初步的筛选和鉴定,以期筛选出具有理想效果的天然产物抑制剂,从而开发出以caspase-3为靶点的新药。实验结果表明,我们获得了高纯度和高活性的重组蛋白caspase-3,并通过酶学方法得到表征,利
用酶学手段,我们从部分中药中初步筛选出了对caspase-3有明显抑制作用的中药:莲须和鸡血藤。这些结果表明,我们成功表达的重组caspase-3蛋白,能够应用于中药文库caspase-3抑制剂的筛选,这为中药理论的研究提供了实验依据,对药物的开发和创新具有一定积极的影响
碘化丙锭(propidiumiodid,PI):目的探讨严重创伤后肝细胞凋亡及坏死在急性肝功能障碍发病机制中的作用.方法复制多发性骨折合并休克的大鼠创伤模型,采用Annexin-V-Flous、碘化丙锭(propidiumiodid,PI)双标法经流式细胞仪检测创伤后各时间点肝细胞凋亡与坏死的数量变化,结合光镜、电镜和电泳观察细胞凋亡与坏死,并与肝功能变化相比较.结果创伤后早期肝细胞即发生凋亡和坏死,坏死肝细胞的数量进行性升高,与肝功能变化显著呈正相关;凋亡肝细胞在创伤后3 h达高峰,部分凋亡肝细胞发生继发性坏死,其数量与肝功能变化显著正相关.结论肝细胞坏死与凋亡是严重创伤后肝功能损害的重要原因,坏死肝细胞是肝功能损害的直接因素,凋亡肝细胞通过发生继发性坏死加重肝功能损害.
激活黑色素浓集荷尔蒙(melanin concentrating hormone,MCH)受体可引起细胞内钙浓度的变化,通过检测钙浓度的变化可以反映受体的功能.
钙离子是机体的重要元素，同时作为细胞内第二信使通过与钙调蛋白（Calmodulin，CaM）结合激活多种蛋白激酶（如腺苷酸环化酶、磷酸二酯酶、钙调蛋白激酶等）及诸多蛋白水解酶和核酸酶，从而参与包括细胞代谢、细胞周期等多种细胞功能的调节，在细胞的许多生命活动中担当着重要的角色。因此，钙离子测定在医学实验研究中有着重要意义。
钙离子测定技术得益于两种近代实验技术，一是钙激活蛋白及荧光指示剂（或称荧光探针），二是荧光检测及成像分析，这些技术的日臻成熟使我们能够观察到许多与钙离子浓度变化有密切关系的亚细胞现象。近年来，数字CCD成像荧光显微镜、激光共聚焦扫描显微镜、多光子扫描显微镜、流式细胞仪等技术的发展，使我们不但能够精确地测定出钙离子浓度的变化，还可以得出准确的亚细胞水平空间定位。
对钙荧光指示剂的开发经历了以下过程：
第一代钙荧光指示剂，包括Quin 1、Quin 2、Quin 3，其中Quin 2的准确度较高，对钙的亲和力强，适于静态细胞钙的测定，在339nm激发后，与Ca2+结合后的发射荧光会增高5~6倍；当在365nm激发时，发射荧光降低，这样就可用它做双激发Ratio图。但有对温度敏感、激发波长较短、光稳定性差等缺点，且所需的Quin 2浓度较高，要达到0.5mmol/才能高出背景荧光，由于用UV激发会产生较强的细胞毒及自发荧光干扰。
第二代钙荧
光指示剂，包括Fura 1、Fura 2、Fura 3、Indo 1，其中Fura 2最好。Fura 2是典型的双激发荧光指示剂，与Ca2+结合后导致荧光光谱移动，当被Ca2+饱和后，340 nm处激发荧光强度上升3倍，而380 nm处激发荧光强度下降10倍，340nm/380nm的荧光强度比值能够更好的反映Ca2+浓度变化，故准确度较高。与Quin 2相比，Fura 2分子中的吠喃环和晤哇环提高了它的离子选择性和荧光强度。Indo 1也是典型的双发射荧光指示剂，具有Fura 2的优点，不同的是在350 nm激发后的发射峰由游离态时的485 nm移至饱和态时的410 nm ，410/480 nm的荧光比值与Ca2+浓度成正比。
第三代钙荧光指示剂，Fluo 3是典型的单波长指示剂，吸收和发射峰分别位于506 nm和526 nm，可以在远离340～380 nm波长范围内测得荧光。Fluo 3结合Ca2+后的荧光强度比游离态的高出35～40倍，从而避免了透镜吸收和细胞自身的荧光干扰。Fluo 3是一种长波指示剂，激发波长（488nm）位于可见光，光源易找到，价格便宜，对Ca2+反应灵敏，目前受到广泛的应用，可作为激光共聚焦成像以及与其它类型荧光指示剂结合作双标记研究当使用单光子或多光子激光激发时，由于激发波长是固定的，所以应该选择合适的指示剂使它在激光波长范围内能够产生最大的吸收，因此钙离子指示剂的发射波谱是最重要因素。在选择指示剂时需要考虑的另一个因素是它们的化学形式，现在商品化的钙离子指示剂有盐类（酸）、酯类和葡聚糖结合物，指示剂的化学构成形式不同，将其导入细胞时所采取的方法也不尽相同。选择指示剂时还需考虑的重要因素是钙离子结合的亲和性，反映在解离常数（Kd）上，当钙离子浓度在0.1×Kd~10×Kd范围变动时，指示剂的吸收和发射波谱或发射的荧光强度随之发生变化。
根据钙荧光指示剂的种类不同标记的方法也略有差异，常用的标记方法有酯标记方法、显微注射法、膜片鉗技术、利用缝隙连接分布、ATP诱导、刮除标记、脂转移标记、电击法、酸导人法等。在使用中潜在的问题主要有细胞内缓冲作用、细胞毒性作用、自发荧光、光漂白、隔室化和染料渗漏等，随着新型钙荧光指示剂的不断出现和标记技术的改进，这些问题逐渐在减少。