安徽农业科学, Journal of Anhui Agri . Sci . 2008, 36(35) :15294-15296责任编辑 张杨林 责任校对 吴晓燕
比色法测定β2苯丙氨酸含量的研究
韩秋敏 (江苏食品职业技术学院生物工程系, 江苏淮安223003)
摘要 [目的]建立快速、准确的β2苯丙氨酸含量定量方法。[方法]依据α2氨基酸与茚三酮显色反应的原理, 对比色法定量检测β2苯
ββμ丙氨酸进行研究, 探讨2苯丙氨酸浓度、pH 值、反应温度和时间对显色反应的影响。[结果]当2苯丙氨酸浓度在480～620g/ml 时,
显色反应颜色变化明显且显色较稳定, 吸光值控制在0. 05～1. 00; 当pH 值在6～10时, 显色反应颜色变化明显; 当温度为90℃时, 加热
α20m in 左右即有明显的颜色变化。2氨基酸与茚三酮显色反应最适的反应条件为pH 值6. 0、温度90℃、反应时间25m in 。在480～620
μg/ml 范围内, β2苯丙氨酸含量与吸光值呈良好的线性相关关系。[结论]该方法具有操作简便、快速等特点, 适用于一般实验室的样品分析及β2苯丙氨酸转化过程中的产品检测。
β2关键词 苯丙氨酸; 茚三酮; 比色法
+
中图分类号 Q 946. 819 文献标识码 A 文章编号 0517-6611(2008) 35-15294-03Study on the D eterm i n a tion of β2phenyl a l an i ne w ith Color im etr ic M ethod HAN Q iu 2m i n (Depart ment of B ioengineering, J iangsu Food Science College, Huaian, J iangsu 223003) Abstract [Objective]The rap id and accurate testing method of β2phenylalanine was researched . ]on the p rinci p le of color reacti on bet w een am ino acid and ninhydrin, many fact ors, such as β2phenylalanine and reaction ti m e, in the method of colori m etry deter m inati on of β2phenylalanine was studied . β2phenylalanine concen 2tration was the 480-620μg/ml, there was the obvious change in color and the abs or p tion value was contr olled among 0. 05t o 1. 00. W hen the pH value was in the change in color reacti on . W hen the temper 2ature was 90℃for 20m in heating, the col or change clear . The op of color reaction of α2am ino acid and ninhydrin was the pH value of 6. 0, the temperature of 90℃ti me . n range of 480-620μg/ml, β2phenylalanine concentration and absorp tion value was a good method was si m p le and convenient and could be app lied for the analysis of samp les in general and of 2phenylalanine during the p r ocess of p r oduct transfor mati on .
β2Key words N Colori metry
β2 氨基酸主要是作为自然界中特殊天然产物的组分存
[1]
在, 如肽、环肽、糖肽、寡肽、类碱和萜类等。这些含β2氨基酸结构的化合物对表现强的生物学和生理学特性是至关重要的, 因此, 含β2氨基酸结构的化合物是新药开发的母体结β2。苯丙氨酸(32phenylalanine ) 即32氨基232苯基-丙氨酸(32a m ino 232phenyl -alanine ) 是β2氨基酸中一种重要的氨
[3-6]
基酸, 具有重要的生物和医学用途。但是β2氨基酸在自构
然界中的丰度远小于α2氨基酸, 种类有限, 而且分离提取困难, 难以满足研究需要, 因此, 人工合成β2苯丙氨酸就逐渐成为研究热点, 主要有化学法和生物法。但由于化学法合成的反应步骤多、收率低、拆分效果差等原因, 所以用生物催化方
[4]
法制备光学纯的β2苯丙氨酸及其衍生物的研究备受青睐。在拆分制备光学纯β2苯丙氨酸过程中, 需建立快速、准确的
β2定量方法。苯丙氨酸本身不具颜色, 但通过茚三酮显色反应, 可以方便地对该物质进行定量测定。笔者对其影响因素等进行研究, 旨在为一般实验室的样品分析及拆分制备光学
纯β2苯丙氨酸过程中的产品检测提供参考。
1 材料与方法1. 1 材料
1. 1. 1 试验仪器。BS224S 电子天平(北京塞多利斯仪器系
[2]
1. 2 方法
1. 2. 1 溶液配制。缓冲溶液的制备:配制pH 值6. 0的Na 2HP O 4-NaH 2P O 4缓冲溶液
[7]
。β2苯丙氨酸标准液的配
制:用天平准确称取1. 0000g β2苯丙氨酸标准品, 溶于1L 缓冲溶液中。再采用逐级稀释法配得浓度为480、500、520、
570、620μg/ml 的β2苯丙氨酸标准液。茚三酮试剂的制备:称取0. 5g 茚三酮溶于100m l 水中得到浓度5g/L的茚三酮水溶液(由于茚三酮不稳定, 现配现用) 。
1. 2. 2 最佳波长的测定。固定pH 值、反应温度和时间、茚
三酮用量, 以540μg/ml 的β2苯丙氨酸标准液进行显色反应, 用分光光度计在370～580n m 范围内测其吸光度, 取吸光值最大且显色稳定的波长为显色波长。
1. 2. 3 标准曲线的绘制。分别吸取浓度480～620μg/ml
β2苯丙氨酸标准液5m l 于10m l 的比色管中, 各加入1m l 的茚三酮试剂, 加上塞充分摇匀。将其置于90℃下水浴25
m in, 冷却至室温, 用722型分光光度计在570n m 下测得其光
密度值。以标准液的光密度值和浓度作一标准曲线。
1. 2. 4 样品的测定。配制一定浓度的样品, 稀释样品浓度
于480～620μg/ml, 调pH 值为6. 0。按相同的反应条件进行反应和比色。由以上所得标准曲线对应查得待测稀释液的浓度即为β2苯丙氨酸待测液的浓度。为检验方法的准确性, 向每1m l 被测样品中分别加入20、40μg 的β2苯丙氨酸纯品检测β2苯丙氨酸的含量。
1. 2. 5 茚三酮显色反应的影响因素分析。①以不同浓度的
统有限公司) ; 722S 可见分光光度计(上海精密科学仪器有限公司) ; pHS 23C 精密pH 计(上海热电仪器有限公司) ;
CS5012SP 型超级数显恒温器(重庆慧达试验仪器有限公司)
β21. 1. 2 试剂。苯丙氨酸(国药集团化学试剂有限公司) ; 茚三酮(上海试剂三厂) ; Na 2HP O 4、NaH 2P O 4、氢氧化钠, 盐酸等试剂均为市售分析纯。
作者简介 韩秋敏(1976-) , 女, 山东高唐人, 硕士, 讲师, 从事生物化
学与分子生物学研究。
收稿日期 2008210213
β2苯丙氨酸在相同的条件下进行显色反应, 分析β2苯丙氨酸
浓度的影响。②以540μg/ml 的β2苯丙氨酸标准液在不同
pH 值下进行显色反应, 分析pH 值的影响。③以540μg/ml
的β2苯丙氨酸标准液在不同的温度及反应时间下进行显色反应, 分析温度及反应时间的影响。
36卷35期 韩秋敏 比色法测定β2苯丙氨酸含量的研究15295
2 结果与分析
2. 1 茚三酮显色反应结果
2. 1. 1 波长的选择结果。一定物质在一定波长下, 其消光
系数是一个定值。同一物质在不同波长下测得的消光系数不同, 消光系数值越大, 表示该物质对该波长的光吸收能力越强, 测定分析的灵敏度也越高
[8]
, 因此, 试验过程中要选取
消光系数值最大处的波长。由图1可知, 波峰处为570n m, 所以取570n m
为最佳吸收波长。
β2图2 苯丙氨酸的标准曲线
F i g . 2 St andard curve of β2phenyl al an i n e
表2 2of s ample
βon of
OD 570
μg/ml ∥
Concentrati on detected
519
540560
β2图1 苯
F i g . 1 Absorpti on map of d al an i n e
and n i n ⅠⅢ
0. 3240. 4570. 576
注:Ⅰ为β2苯丙氨酸待测稀释液; Ⅱ、Ⅲ为每1m l 分别加入了20、40μg
β2苯丙氨酸纯品的稀释液。
Note:Ⅰ. D iluent sa mp le of β2phenylalanine; Ⅱand Ⅲmean adding 20and
40μg diluent of pure β2phenylalanine in 1m l sa mp le .
2. 1. 2 根据茚三酮比色法测得的一
组数据(表1) 绘制标准曲线(图2) 。由结果可知, β2苯丙氨酸浓度在480～620μg/ml 范围内与茚三酮反应, 表现出由浅紫到紫色的颜色递增的变化, 此时底物浓度与吸光值具有良好的线性关系, 回归曲线方程为y =0. 0054x -2. 4185(x 表
2
示浓度; y 表示吸光度) , R =0. 9972。因此选定β2苯丙氨酸的反应浓度线性范围为480～620μg/ml 。
表1 不同β2苯丙氨酸标准液的光密度值
Table 1 O pti ca l den sity of di fferent st andard li qu i ds of β2phenyl 2
al an i n e
2. 2 茚三酮显色反应的影响因素分析结果
β22. 2. 1 苯丙氨酸浓度的影响。由表3可知, β2苯丙氨酸在浓度为480μg/ml 才可以和茚三酮的水溶液进行显色反应。
随β2苯丙氨酸浓度的变大, 显色逐渐变深。当浓度大于800μg/ml 时, 所显颜色过深且其光密度值超出量程。当β2苯丙氨酸浓度在480～620μg/ml 时, 颜色变化明显, 且显色较稳定, 吸光值控制在0. 05～1. 00范围内, 因此选定该浓度范围为测定范围。
β2表3 苯丙氨酸浓度对显色反应的影响
Table 3 Effects of β2phenyl a l an i n e concentrati on on color reacti on
β2μg/ml 苯丙氨酸浓度∥β2phenylalanine concentrati on
[***********]600620
颜色变化
Col or change
浅紫L ight pur ple
吸光值
Abs or p ti on value
0. 161
0. 2950. 3650. 4700. 5880. 6870. 8120. 927
浅紫浅紫浅紫紫色紫色紫色紫色
L ight pur ple L ight pur ple L ight pur ple Pur p le Pur p le Pur p le Pur p le
β2μg/ml 苯丙氨酸浓度∥β2phenylalanine concentrati on
[***********]800
颜色变化
基本无色Basicly col orless
OD 570
0. 0540. 1610. 4700. 9271. 7741. 9161. 997
注:90℃下水浴25m in, β2苯丙氨酸标准液5ml, 茚三酮水溶液1m l,
pH 值6. 0。表3～4同。
略带浅紫L ittle light pur ple
浅紫L ight pur ple 紫色Pur p le
蓝紫B luish vi olet 蓝紫B luish vi olet 蓝紫B luish vi olet
Note:Waterbath is conducted f or 25m in under 90℃, standard liquid of
β2phenylalanine is 5ml with ninhydrin 1m l and 6. 0pH. The sa me
as Table 3and 4.
2. 2. 2 pH 值的影响。由表4可知, 显色反应随pH 值的不
同, 颜色有明显的变化。pH 值过高、过低都不发生显色, 而
pH 值在6～10时, 颜色变化明显。溶液pH 值过高, 如pH 值
2. 1. 3 样品测定结果。将被测样品稀释后, 由该法检测浓
度为519μg/ml 。由表1可知, 当向每1m l 样品中多加入20、
40μg 的β2苯丙氨酸纯品时, 所测得的结果即落入相应的浓
在14以上, 即使加热也不显色, 主要原因是茚三酮在强碱性下极不稳定, 容易被强碱所分解, 且茚三酮的水溶液在碱性条件下溶液本身带有明显的淡黄色。在强酸性介质中, 虽然能增强茚三酮或1, 32茚三酮羟基的反应能力, 却大大降低了参与缩合反应的氨基、羟基等新核基团的活性, 使有色的缩合产物形成困难。因此pH 值选定在6左右较好, 此时基本
度区间。这说明该方法的准确度较高, 适于β2苯丙氨酸的定量检测。
15296 安徽农业科学 2008年
无颜色干扰且显色稳定。
表4 pH 值对显色反应的影响
Table 4 Effects of pH value on the color reacti on
pH 值
法拆分的乙酰化反应中, 无其他氨基酸, 故该影响因素可忽略不计。
3 讨论
OD 570
颜色变化
2无色Col orless 46
0. 0338紫色Pur p le 0. 196100. 47014
OD 570
pH 值颜色变化
(1) 由于该类反应尚未发现有文字记载, 其反应机理还
0. 535
需论定。笔者在参阅了一些文献资料的基础上, 对其反应机
理和过程进行分析。借鉴α2氨基酸与茚三酮反应。茚三酮溶液与氨基酸共热生成氨; 氨与茚三酮和还原性茚三酮反应, 生成蓝紫色化合物。该化合物颜色的深浅与氨基酸的含量成正比, 可通过测定570n m 处的光密度, 测定氨基酸的含[7]
量。茚三酮不仅与α2氨基酸作用, 也与某些β2氨基酸和伯、仲脂肪胺等作用, 生成相似的有色物质
。 (2) 颜色产物是通过缩合形成的, 推理β2苯丙氨酸与茚
[7]
无色Col orless
浅紫L ight pur ple 蓝紫B luish vi olet 0. 659无色Col orless -
注:β2苯丙氨酸浓度均为540μg/ml 。
Note:The concentrati on of β2phenylalanine is 540μg/ml .
2. 2. 3 温度及反应时间的影响。由表5可知, 温度和反应
时间对该显色反应的影响也很大。以浓度540μg/ml 的β2苯丙氨酸标准液在70℃进行显色发应时, 发现即使加热35
m in 也基本无颜色变化; 当温度为80℃时, 加热30m in 以上
三酮反应机理与α2氨但是这些机理并不包括反应的全过程, 各种, , 各种结构的有色物质参考文献
[1]VON NUSS BAU M F, SPI TE LLER P . β2a mino acids in nature in highlights
in bi oorganic che mistry:Methodsand applicati ons[M].W iley 2VCH,Wein 2hei m , 2004:63-89.
[2]SPI TE LLER P . β2a mino acids in natural pr oducts[C]//JUAR I STI E, S O 2
LOS HONOKV A . 2nd ed . Ne w Y ork:Enanti oselective synthesis of β2a mino acids . Ne w Y ork:John W iley, 2005:19-91. [3]NAG ANO Y, I KE DO K, F UJ I S H I M A A, et al . Novel anti 2Helicobacter pylori
antibi otics pr oduced by B acillus s p. [J].J Antibi ot, 2001, 54:934-947. [4]程菲. 外消旋苯丙氨酸及其衍生物的合成与手性拆分[D].上海:华东
师范大学, 2006:1-59. [5]KI N GST ON D G I . Tax ol, a molecular f or all seas on [J ].Che m Co mmun,
2001, 20:867-880. [6]ANDEREGG R J, B I E MANN K,MAN MADE A, et al . Mass s pectr o metric
peptide sequencing:Cycl ochl or otine [J ].Bi ol ogical Mass S pectr o metry, 2005, 6:129-134.
[7]王秀奇, 秦淑缘, 高天慧, 等. 基础生物化学实验[M].北京:高等教育出
版社, 1999:127-129, 278.
[8]陈钧辉, 陶力. 生物化学实验[M].北京:科学出版社, 2003:234-235. [9]王昂, 王丽丽, 仪宏, 等. 茚三酮比色法测定谷氨酸含量的研究[J ].中
国调味品, 2005(8) :50-52. [10]张振华. α2氨基酸与茚三酮显色反应影响因素的探讨[J ].邵阳高等
专科学校学报, 2000, 13(1) :42-44.
[11]唐明远. 关于茚三酮与氨基酸显色反应的探讨[J ].湖南农学院学报,
1981(2) :39-43. [12]G AO S Y . Deter minati on of the trace ele ment contents in plants using a 2
t o mic abs or pti on s pectr ophot o meter[J].Agricultural Science &Technol o 2gy, 2008, 9(2) :6-9.
[13]项雷文, 郑建兵. 双波长紫外吸收法测定L -苯丙氨酸含量[J ].氨
基酸和生物资源, 2002, 24(3) :69-71.
[11]
[10]
才有颜色变化; 而当温度为90℃时, 加热20m in 左右即有明显的颜色变化, 沸水加热时颜色变化也很明显。但考虑到蒸发的影响, 所以试验选用90℃作为最佳反应温度。在显色反应中, 说, 当β2苯丙氨酸浓度在480～620μ℃20
m in 即可反应。, 。另外, 有色缩合物
, 反应中间产物也可能通过其他形式的缩合形成
。该类反应的产物与反应过程分析
及探讨是否合理, 可采用红外及质谱方法进一步验证和确认。
显, 25表5 Table 5 Result of color reacti on under d i fferent te mpera ture and
reacti on ti m e
反应时间∥m in
Reacti on 1520253035
反应温度70℃反应温度80℃反应温度90℃
Reacti on
Reacti on
Reacti on
无色Col orless 无色Col orless 无色Col orless
无色无色无色无色
Col orless Col orless Col orless Col orless 无色无色无色浅紫浅紫
Col orless 浅紫Col orless 浅紫L ight pur p le 浅紫
Col orless
L ight pur p le L ight pur p le L ight pur p le L ight pur p le
注:β2苯丙氨酸标准液5m l; 茚三酮水溶液1m l; β2苯丙氨酸浓度540
μg/ml, pH 值6. 0。
Note:Standard liquid of β2phenylalanine is 5m l with 1m l ninhydrin s olu 2
ti on, 540μg/ml β2phenylalanine and pH 6. 0.
2. 2. 4 其他影响因素。茚三酮的不同溶剂对显色反应也有
影响。有研究表明, 茚三酮的丙酮溶液在80℃以上时显色较好, 而茚三酮的水溶液要在90℃以上时显色才明显。茚三酮的用量对显色反应的影响不大, 可选择5m l (或3m l ) 被测液与1m l (或0. 5m l ) 茚三酮溶液反应。测定时, 最好选择β2苯丙氨酸标准样与待测稀释液一同水浴, 这样可提高测定的准确度。此外, 当被测样品中含有其他氨基酸时也可与茚三酮发生显色反应, 从而影响测定结果。但在β2苯丙氨酸酶
[9]
安徽农业科学, Journal of Anhui Agri . Sci . 2008, 36(35) :15294-15296责任编辑 张杨林 责任校对 吴晓燕
比色法测定β2苯丙氨酸含量的研究
韩秋敏 (江苏食品职业技术学院生物工程系, 江苏淮安223003)
摘要 [目的]建立快速、准确的β2苯丙氨酸含量定量方法。[方法]依据α2氨基酸与茚三酮显色反应的原理, 对比色法定量检测β2苯
ββμ丙氨酸进行研究, 探讨2苯丙氨酸浓度、pH 值、反应温度和时间对显色反应的影响。[结果]当2苯丙氨酸浓度在480～620g/ml 时,
显色反应颜色变化明显且显色较稳定, 吸光值控制在0. 05～1. 00; 当pH 值在6～10时, 显色反应颜色变化明显; 当温度为90℃时, 加热
α20m in 左右即有明显的颜色变化。2氨基酸与茚三酮显色反应最适的反应条件为pH 值6. 0、温度90℃、反应时间25m in 。在480～620
μg/ml 范围内, β2苯丙氨酸含量与吸光值呈良好的线性相关关系。[结论]该方法具有操作简便、快速等特点, 适用于一般实验室的样品分析及β2苯丙氨酸转化过程中的产品检测。
β2关键词 苯丙氨酸; 茚三酮; 比色法
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中图分类号 Q 946. 819 文献标识码 A 文章编号 0517-6611(2008) 35-15294-03Study on the D eterm i n a tion of β2phenyl a l an i ne w ith Color im etr ic M ethod HAN Q iu 2m i n (Depart ment of B ioengineering, J iangsu Food Science College, Huaian, J iangsu 223003) Abstract [Objective]The rap id and accurate testing method of β2phenylalanine was researched . ]on the p rinci p le of color reacti on bet w een am ino acid and ninhydrin, many fact ors, such as β2phenylalanine and reaction ti m e, in the method of colori m etry deter m inati on of β2phenylalanine was studied . β2phenylalanine concen 2tration was the 480-620μg/ml, there was the obvious change in color and the abs or p tion value was contr olled among 0. 05t o 1. 00. W hen the pH value was in the change in color reacti on . W hen the temper 2ature was 90℃for 20m in heating, the col or change clear . The op of color reaction of α2am ino acid and ninhydrin was the pH value of 6. 0, the temperature of 90℃ti me . n range of 480-620μg/ml, β2phenylalanine concentration and absorp tion value was a good method was si m p le and convenient and could be app lied for the analysis of samp les in general and of 2phenylalanine during the p r ocess of p r oduct transfor mati on .
β2Key words N Colori metry
β2 氨基酸主要是作为自然界中特殊天然产物的组分存
[1]
在, 如肽、环肽、糖肽、寡肽、类碱和萜类等。这些含β2氨基酸结构的化合物对表现强的生物学和生理学特性是至关重要的, 因此, 含β2氨基酸结构的化合物是新药开发的母体结β2。苯丙氨酸(32phenylalanine ) 即32氨基232苯基-丙氨酸(32a m ino 232phenyl -alanine ) 是β2氨基酸中一种重要的氨
[3-6]
基酸, 具有重要的生物和医学用途。但是β2氨基酸在自构
然界中的丰度远小于α2氨基酸, 种类有限, 而且分离提取困难, 难以满足研究需要, 因此, 人工合成β2苯丙氨酸就逐渐成为研究热点, 主要有化学法和生物法。但由于化学法合成的反应步骤多、收率低、拆分效果差等原因, 所以用生物催化方
[4]
法制备光学纯的β2苯丙氨酸及其衍生物的研究备受青睐。在拆分制备光学纯β2苯丙氨酸过程中, 需建立快速、准确的
β2定量方法。苯丙氨酸本身不具颜色, 但通过茚三酮显色反应, 可以方便地对该物质进行定量测定。笔者对其影响因素等进行研究, 旨在为一般实验室的样品分析及拆分制备光学
纯β2苯丙氨酸过程中的产品检测提供参考。
1 材料与方法1. 1 材料
1. 1. 1 试验仪器。BS224S 电子天平(北京塞多利斯仪器系
[2]
1. 2 方法
1. 2. 1 溶液配制。缓冲溶液的制备:配制pH 值6. 0的Na 2HP O 4-NaH 2P O 4缓冲溶液
[7]
。β2苯丙氨酸标准液的配
制:用天平准确称取1. 0000g β2苯丙氨酸标准品, 溶于1L 缓冲溶液中。再采用逐级稀释法配得浓度为480、500、520、
570、620μg/ml 的β2苯丙氨酸标准液。茚三酮试剂的制备:称取0. 5g 茚三酮溶于100m l 水中得到浓度5g/L的茚三酮水溶液(由于茚三酮不稳定, 现配现用) 。
1. 2. 2 最佳波长的测定。固定pH 值、反应温度和时间、茚
三酮用量, 以540μg/ml 的β2苯丙氨酸标准液进行显色反应, 用分光光度计在370～580n m 范围内测其吸光度, 取吸光值最大且显色稳定的波长为显色波长。
1. 2. 3 标准曲线的绘制。分别吸取浓度480～620μg/ml
β2苯丙氨酸标准液5m l 于10m l 的比色管中, 各加入1m l 的茚三酮试剂, 加上塞充分摇匀。将其置于90℃下水浴25
m in, 冷却至室温, 用722型分光光度计在570n m 下测得其光
密度值。以标准液的光密度值和浓度作一标准曲线。
1. 2. 4 样品的测定。配制一定浓度的样品, 稀释样品浓度
于480～620μg/ml, 调pH 值为6. 0。按相同的反应条件进行反应和比色。由以上所得标准曲线对应查得待测稀释液的浓度即为β2苯丙氨酸待测液的浓度。为检验方法的准确性, 向每1m l 被测样品中分别加入20、40μg 的β2苯丙氨酸纯品检测β2苯丙氨酸的含量。
1. 2. 5 茚三酮显色反应的影响因素分析。①以不同浓度的
统有限公司) ; 722S 可见分光光度计(上海精密科学仪器有限公司) ; pHS 23C 精密pH 计(上海热电仪器有限公司) ;
CS5012SP 型超级数显恒温器(重庆慧达试验仪器有限公司)
β21. 1. 2 试剂。苯丙氨酸(国药集团化学试剂有限公司) ; 茚三酮(上海试剂三厂) ; Na 2HP O 4、NaH 2P O 4、氢氧化钠, 盐酸等试剂均为市售分析纯。
作者简介 韩秋敏(1976-) , 女, 山东高唐人, 硕士, 讲师, 从事生物化
学与分子生物学研究。
收稿日期 2008210213
β2苯丙氨酸在相同的条件下进行显色反应, 分析β2苯丙氨酸
浓度的影响。②以540μg/ml 的β2苯丙氨酸标准液在不同
pH 值下进行显色反应, 分析pH 值的影响。③以540μg/ml
的β2苯丙氨酸标准液在不同的温度及反应时间下进行显色反应, 分析温度及反应时间的影响。
36卷35期 韩秋敏 比色法测定β2苯丙氨酸含量的研究15295
2 结果与分析
2. 1 茚三酮显色反应结果
2. 1. 1 波长的选择结果。一定物质在一定波长下, 其消光
系数是一个定值。同一物质在不同波长下测得的消光系数不同, 消光系数值越大, 表示该物质对该波长的光吸收能力越强, 测定分析的灵敏度也越高
[8]
, 因此, 试验过程中要选取
消光系数值最大处的波长。由图1可知, 波峰处为570n m, 所以取570n m
为最佳吸收波长。
β2图2 苯丙氨酸的标准曲线
F i g . 2 St andard curve of β2phenyl al an i n e
表2 2of s ample
βon of
OD 570
μg/ml ∥
Concentrati on detected
519
540560
β2图1 苯
F i g . 1 Absorpti on map of d al an i n e
and n i n ⅠⅢ
0. 3240. 4570. 576
注:Ⅰ为β2苯丙氨酸待测稀释液; Ⅱ、Ⅲ为每1m l 分别加入了20、40μg
β2苯丙氨酸纯品的稀释液。
Note:Ⅰ. D iluent sa mp le of β2phenylalanine; Ⅱand Ⅲmean adding 20and
40μg diluent of pure β2phenylalanine in 1m l sa mp le .
2. 1. 2 根据茚三酮比色法测得的一
组数据(表1) 绘制标准曲线(图2) 。由结果可知, β2苯丙氨酸浓度在480～620μg/ml 范围内与茚三酮反应, 表现出由浅紫到紫色的颜色递增的变化, 此时底物浓度与吸光值具有良好的线性关系, 回归曲线方程为y =0. 0054x -2. 4185(x 表
2
示浓度; y 表示吸光度) , R =0. 9972。因此选定β2苯丙氨酸的反应浓度线性范围为480～620μg/ml 。
表1 不同β2苯丙氨酸标准液的光密度值
Table 1 O pti ca l den sity of di fferent st andard li qu i ds of β2phenyl 2
al an i n e
2. 2 茚三酮显色反应的影响因素分析结果
β22. 2. 1 苯丙氨酸浓度的影响。由表3可知, β2苯丙氨酸在浓度为480μg/ml 才可以和茚三酮的水溶液进行显色反应。
随β2苯丙氨酸浓度的变大, 显色逐渐变深。当浓度大于800μg/ml 时, 所显颜色过深且其光密度值超出量程。当β2苯丙氨酸浓度在480～620μg/ml 时, 颜色变化明显, 且显色较稳定, 吸光值控制在0. 05～1. 00范围内, 因此选定该浓度范围为测定范围。
β2表3 苯丙氨酸浓度对显色反应的影响
Table 3 Effects of β2phenyl a l an i n e concentrati on on color reacti on
β2μg/ml 苯丙氨酸浓度∥β2phenylalanine concentrati on
[***********]600620
颜色变化
Col or change
浅紫L ight pur ple
吸光值
Abs or p ti on value
0. 161
0. 2950. 3650. 4700. 5880. 6870. 8120. 927
浅紫浅紫浅紫紫色紫色紫色紫色
L ight pur ple L ight pur ple L ight pur ple Pur p le Pur p le Pur p le Pur p le
β2μg/ml 苯丙氨酸浓度∥β2phenylalanine concentrati on
[***********]800
颜色变化
基本无色Basicly col orless
OD 570
0. 0540. 1610. 4700. 9271. 7741. 9161. 997
注:90℃下水浴25m in, β2苯丙氨酸标准液5ml, 茚三酮水溶液1m l,
pH 值6. 0。表3～4同。
略带浅紫L ittle light pur ple
浅紫L ight pur ple 紫色Pur p le
蓝紫B luish vi olet 蓝紫B luish vi olet 蓝紫B luish vi olet
Note:Waterbath is conducted f or 25m in under 90℃, standard liquid of
β2phenylalanine is 5ml with ninhydrin 1m l and 6. 0pH. The sa me
as Table 3and 4.
2. 2. 2 pH 值的影响。由表4可知, 显色反应随pH 值的不
同, 颜色有明显的变化。pH 值过高、过低都不发生显色, 而
pH 值在6～10时, 颜色变化明显。溶液pH 值过高, 如pH 值
2. 1. 3 样品测定结果。将被测样品稀释后, 由该法检测浓
度为519μg/ml 。由表1可知, 当向每1m l 样品中多加入20、
40μg 的β2苯丙氨酸纯品时, 所测得的结果即落入相应的浓
在14以上, 即使加热也不显色, 主要原因是茚三酮在强碱性下极不稳定, 容易被强碱所分解, 且茚三酮的水溶液在碱性条件下溶液本身带有明显的淡黄色。在强酸性介质中, 虽然能增强茚三酮或1, 32茚三酮羟基的反应能力, 却大大降低了参与缩合反应的氨基、羟基等新核基团的活性, 使有色的缩合产物形成困难。因此pH 值选定在6左右较好, 此时基本
度区间。这说明该方法的准确度较高, 适于β2苯丙氨酸的定量检测。
15296 安徽农业科学 2008年
无颜色干扰且显色稳定。
表4 pH 值对显色反应的影响
Table 4 Effects of pH value on the color reacti on
pH 值
法拆分的乙酰化反应中, 无其他氨基酸, 故该影响因素可忽略不计。
3 讨论
OD 570
颜色变化
2无色Col orless 46
0. 0338紫色Pur p le 0. 196100. 47014
OD 570
pH 值颜色变化
(1) 由于该类反应尚未发现有文字记载, 其反应机理还
0. 535
需论定。笔者在参阅了一些文献资料的基础上, 对其反应机
理和过程进行分析。借鉴α2氨基酸与茚三酮反应。茚三酮溶液与氨基酸共热生成氨; 氨与茚三酮和还原性茚三酮反应, 生成蓝紫色化合物。该化合物颜色的深浅与氨基酸的含量成正比, 可通过测定570n m 处的光密度, 测定氨基酸的含[7]
量。茚三酮不仅与α2氨基酸作用, 也与某些β2氨基酸和伯、仲脂肪胺等作用, 生成相似的有色物质
。 (2) 颜色产物是通过缩合形成的, 推理β2苯丙氨酸与茚
[7]
无色Col orless
浅紫L ight pur ple 蓝紫B luish vi olet 0. 659无色Col orless -
注:β2苯丙氨酸浓度均为540μg/ml 。
Note:The concentrati on of β2phenylalanine is 540μg/ml .
2. 2. 3 温度及反应时间的影响。由表5可知, 温度和反应
时间对该显色反应的影响也很大。以浓度540μg/ml 的β2苯丙氨酸标准液在70℃进行显色发应时, 发现即使加热35
m in 也基本无颜色变化; 当温度为80℃时, 加热30m in 以上
三酮反应机理与α2氨但是这些机理并不包括反应的全过程, 各种, , 各种结构的有色物质参考文献
[1]VON NUSS BAU M F, SPI TE LLER P . β2a mino acids in nature in highlights
in bi oorganic che mistry:Methodsand applicati ons[M].W iley 2VCH,Wein 2hei m , 2004:63-89.
[2]SPI TE LLER P . β2a mino acids in natural pr oducts[C]//JUAR I STI E, S O 2
LOS HONOKV A . 2nd ed . Ne w Y ork:Enanti oselective synthesis of β2a mino acids . Ne w Y ork:John W iley, 2005:19-91. [3]NAG ANO Y, I KE DO K, F UJ I S H I M A A, et al . Novel anti 2Helicobacter pylori
antibi otics pr oduced by B acillus s p. [J].J Antibi ot, 2001, 54:934-947. [4]程菲. 外消旋苯丙氨酸及其衍生物的合成与手性拆分[D].上海:华东
师范大学, 2006:1-59. [5]KI N GST ON D G I . Tax ol, a molecular f or all seas on [J ].Che m Co mmun,
2001, 20:867-880. [6]ANDEREGG R J, B I E MANN K,MAN MADE A, et al . Mass s pectr o metric
peptide sequencing:Cycl ochl or otine [J ].Bi ol ogical Mass S pectr o metry, 2005, 6:129-134.
[7]王秀奇, 秦淑缘, 高天慧, 等. 基础生物化学实验[M].北京:高等教育出
版社, 1999:127-129, 278.
[8]陈钧辉, 陶力. 生物化学实验[M].北京:科学出版社, 2003:234-235. [9]王昂, 王丽丽, 仪宏, 等. 茚三酮比色法测定谷氨酸含量的研究[J ].中
国调味品, 2005(8) :50-52. [10]张振华. α2氨基酸与茚三酮显色反应影响因素的探讨[J ].邵阳高等
专科学校学报, 2000, 13(1) :42-44.
[11]唐明远. 关于茚三酮与氨基酸显色反应的探讨[J ].湖南农学院学报,
1981(2) :39-43. [12]G AO S Y . Deter minati on of the trace ele ment contents in plants using a 2
t o mic abs or pti on s pectr ophot o meter[J].Agricultural Science &Technol o 2gy, 2008, 9(2) :6-9.
[13]项雷文, 郑建兵. 双波长紫外吸收法测定L -苯丙氨酸含量[J ].氨
基酸和生物资源, 2002, 24(3) :69-71.
[11]
[10]
才有颜色变化; 而当温度为90℃时, 加热20m in 左右即有明显的颜色变化, 沸水加热时颜色变化也很明显。但考虑到蒸发的影响, 所以试验选用90℃作为最佳反应温度。在显色反应中, 说, 当β2苯丙氨酸浓度在480～620μ℃20
m in 即可反应。, 。另外, 有色缩合物
, 反应中间产物也可能通过其他形式的缩合形成
。该类反应的产物与反应过程分析
及探讨是否合理, 可采用红外及质谱方法进一步验证和确认。
显, 25表5 Table 5 Result of color reacti on under d i fferent te mpera ture and
reacti on ti m e
反应时间∥m in
Reacti on 1520253035
反应温度70℃反应温度80℃反应温度90℃
Reacti on
Reacti on
Reacti on
无色Col orless 无色Col orless 无色Col orless
无色无色无色无色
Col orless Col orless Col orless Col orless 无色无色无色浅紫浅紫
Col orless 浅紫Col orless 浅紫L ight pur p le 浅紫
Col orless
L ight pur p le L ight pur p le L ight pur p le L ight pur p le
注:β2苯丙氨酸标准液5m l; 茚三酮水溶液1m l; β2苯丙氨酸浓度540
μg/ml, pH 值6. 0。
Note:Standard liquid of β2phenylalanine is 5m l with 1m l ninhydrin s olu 2
ti on, 540μg/ml β2phenylalanine and pH 6. 0.
2. 2. 4 其他影响因素。茚三酮的不同溶剂对显色反应也有
影响。有研究表明, 茚三酮的丙酮溶液在80℃以上时显色较好, 而茚三酮的水溶液要在90℃以上时显色才明显。茚三酮的用量对显色反应的影响不大, 可选择5m l (或3m l ) 被测液与1m l (或0. 5m l ) 茚三酮溶液反应。测定时, 最好选择β2苯丙氨酸标准样与待测稀释液一同水浴, 这样可提高测定的准确度。此外, 当被测样品中含有其他氨基酸时也可与茚三酮发生显色反应, 从而影响测定结果。但在β2苯丙氨酸酶
[9]