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·综 述·
常见多重耐药菌的耐药机制及防治对策
杨平满1, 周建英2
(1. 临海市第一人民医院, 浙江临海317000; 2. 浙江大学医学院附属第一医院, 浙江杭州310003) 关键词:细菌; 多重耐药; 耐药机制; 耐药基因; 防治对策
中图分类号:R969. 3 文献标识码:A 文章编号:1005-4529(2006) 12-1434-04 细菌耐药性的产生是细菌基因突变积累的结果。抗菌药物压力起筛选耐药优势菌的作用, 是细菌耐药性发生的主要源动力。一种抗菌药物的使用可造成对其他药物耐药性的共选择, 一种细菌可通过多种机制对抗菌药物产生耐药。整合子作为细菌捕获和表达基因的可移动遗传元件, 能编码整合酶、负责基因重组、介导细菌遗传物质迁移的基因转位, 为细菌提供了一种适应抗菌药物环境压力的机制[1]。质粒的交换、转座子的转座作用、整合子及其他一些机制都有利于耐药基因在不同质粒或质粒与染色体间移动交换导致细菌单药耐药、多重耐药, 垂直传代、多菌种播散, 加快耐药株的形成、蔓延。随着抗菌药物、免疫抑制剂的应用和有创技术的开展, 细菌的耐药性不断增强, 普遍呈现出高度耐药、多重耐药的态势。了解常见耐药菌的多重耐药机制, 针对产生耐药性的各个环节, 及时采取相应的防治对策已成为当务之急。
1 常见革兰阴性杆菌的主要耐药机制
G -杆菌主要通过产生灭活酶、改变结合靶位、降低外膜通透性、产生主动外排、形成生物被膜等机制对抗菌药物产生耐药性。β-内酰胺酶(BLA ) 尤为重要, 其种类繁多, 按Amble r 分类划分为ClassA 、B 、C 、D 等类。ClassA 类酶主要有T EM 、S HV 等, 长期使用第3代头孢菌素(Ⅲ-CS ) 可选择出产超广谱BLA (ESBLs ) 。ESBLs 由质粒介导, 最早由大肠埃希菌(ECO ) 、肺炎克雷伯菌(K PN ) 产生, 能水解大多数β-内酰胺类药物。SHV -10、T EM -50、68同时具有ESBLs 和耐酶抑制剂的特点。驱动ESBL s 进化的选择压力通常归因于氧亚胺β-内酰胺类、喹诺酮类等药物的使用强度。β-内酰胺类可促使启动子上调突变, 可转座因子插入、ESBLs 基因拷贝数增加导致细菌高产ESBL s 。不同种属的细菌可通过接合、转导、转化、转座等方式获得耐药基因。头孢噻肟的滥用导致我国流行的ESBL s 亚型主要为CT X -M 型, 往往表现对头孢噻肟、头孢曲松高度耐药。铜绿假单胞菌(P A E ) 和鲍氏不动杆菌(A BA ) 的质粒上所携带的O XA 型ESBLs 基因通过质粒转化给肠杆菌科细菌, 不仅使氨苄西林和头孢菌素失效, 而且对苯唑西林和氯唑西林有高度水解活性。在我国>20%的K P N 产ESBLs , 主要由R 质粒上的转座子编码, 通-2006--过接合转移。由于基因转移, 1株细菌可同时产T EM 、SHV 、C TX -M 和O XA 型等ESBLs [2], 产ESBL s 菌株可同时产T EM 、S HV 型广谱酶及其他BL A (包括A mpC 酶) 。固有表达A mpC 酶, 它受染色体中amp 复合操纵子(包括5个不连锁基因ampC 、D 、R 、E 、G ) 调控, 一旦调控基因发生去阻遏突变细菌就可持续高产A mpC 酶。肠杆菌属细菌易被Ⅲ-CS 等选择产生A mpC 酶的去阻遏高表达, 氟喹诺酮类、氨基糖苷类和亚胺培南不诱导细菌产生A mpC 酶, 克拉维酸不仅不能抑制A mpC 酶反具有诱导产酶作用。K PN 染色体没有amp 操纵子结构、ECO 染色体缺ampF 基因不能被诱导表达Am pC 酶, 但可通过基因突变或获得A mpC 酶耐药质粒而高产A mpC 酶。可怕的是AmpC 酶基因一旦位于可移动质粒上, 容易播散流行并有可能进一步进化, 与ESBLs 一样往往也携带氨基糖苷类、磺胺类、四环素甚至喹诺酮类的耐药基因, 同时携带广谱酶甚至ESBL s 的情况也非常多见, 常常多重耐药。同时产ESBLs 、A mpC 酶菌株仅对碳青酶烯类敏感。整合子是耐药基因水平传播的重要因子, 捕获基因盒与抗菌药物的选择压力有关[3]。在不同的选择压力下, 整合子可通过多种形式捕获、整合和保留不同的耐药基因, 并能借助于转化、转导、接合跨菌属转移耐药基因, 可携带多个串联排列的基因盒借助于启动子介导多种耐药基因同时高表达, 是细菌、尤其G -杆菌多重耐药迅速发展的主要原因[4]。产酶株交叉耐药性的差异与各地用药习惯不同有关。1. 1 ECO 主要耐药机制是产ESBL s , 整合子等机制加速了多重耐药性的产生。随着抗菌药物的持续使用和耐药基因转移, 可出现T EM 、A mpC 型等多重BLA 活性, 还可能含有SHV 、O XA 型BLA 对抗菌药物产生多重耐药。对喹诺酮类的高耐药率可能与喹诺酮类应用太多、太滥有关。g y rA 和parC 突变、Acr A 的高表达可能是导致ECO 对喹诺酮类耐药的主要分子基础。g y rA 基因突变导致G y rA 酶空间结构改变及干拢喹诺酮-酶-DN A 相互作用产生对喹诺酮类低水平耐药, 若同时出现g yr B 突变使外膜通透性下降可出现高水平耐药, 伴par C 突变可使耐药性加重。gy rB 的等位基因nfxB 、no rB 、cf xB 和o fxB 的突变引起膜磷酯双分子层改变, 使O mpF 表达减少。A crA -A crB -T olC 多排泵可在野生型ECO 中表达, 受A cr R 、So xS 、RobA 及M arA B 调节。抗菌药物、酸碱环境和氧化还原状态均影响A rcA -A rcB -T o lC 的-诺酮内
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酯类、四环素类、氯霉素等药物, 还常伴有OmpF 的降低导致多重耐药。nfx B 接近O mpF 的结构基因, no rB 、cfxB 、o fxB 则接近于marA , marA 可通过调控数个远程基因影响细胞膜的通透性和主动外排泵形成多重耐药表型, 表现对头孢菌素、四环素和氯霉素交叉耐药。对四环素的耐药可由质粒介导诱导产生。tetA 、B 、K 介导四环素类外排泵、tetM 编码保护性蛋白均可减少四环素与核糖体的结合, 还可产酶灭活四环素。对氨基糖苷类耐药主要因产A M Es , r psL 突变可使链霉素不能与核糖体结合, mdfA 基因编码多药转运蛋白能输出卡那霉素的活性。rpoB 突变导致对利福平耐药, 还可存在红霉素钝化酶。整合子与耐药基因盒的接触会导致它们持续的选择[5], 临床分离的ECO 磺胺耐药基因至少与其他两种不同抗菌药物耐药基因相连。
1. 2 P AE 没有经典的高通道蛋白、外膜通透性差是PA E 对结构不同的多类抗菌药物固有耐药的重要原因。其他机制主要有:(1) 产生灭活酶, 如多种ESBL s 、A mpC 酶、A M Es 及碳青酶烯酶等。(2) 靶位改变, 如PBP 3, 4, 5改变使其对β-内酰胺类亲和力下降, 改变二氢叶酸合成酶使磺胺类结合力下降, Gy r A 亚基上83-87区域突变易致喹诺酮类耐药, g y rB 、pa rC 、pa rE 突变可使耐药性加重。(3) 外膜主动外排、外膜蛋白C 、D 、E 、F 等的缺失变异、膜透性降低及生物被膜作用均可导致对β-内酰胺类、喹诺酮类、氯霉素、四环素等耐药。主动外排是其固有耐药和获得性多重耐药的主要原因。PA E 已知的7类多重外排泵有各自的调节基因如mex R 、nfxB 等, 这些基因突变仅出现在g y rA 或parC 突变基础上, 引起外排泵表达增高。M exA -M ex B -O prM 广泛在于G -杆菌中, 其外排底物极为广泛, 是迄今发现的最具重要性的外排系统, 可在氟喹诺酮类、亚胺培南治疗过程中出现。M exX -M ex Y -OprM 使P A E 对氨基糖苷类具有显著的固有耐药性。喹诺酮类选择出的nfxC 突变株M e xE -M ex F -O pr N 活性增强常伴以O prD 明显降低, 因而可与碳青酶烯类交叉耐药。O prD 改变是PA E 对亚胺培南和美罗培南耐药的共同机制, 主动外排可导致美罗培南耐药而对亚胺培南无作用。低浓度亚胺培南可能通过抑制O prD 2的表达, 诱导BLA 高表达, 降低碳青酶烯类对PA E 体外抗菌活性[6]。应用碳青酶烯类是PA E 多重耐药的独立危险因素[7]。
1. 3 A BA A BA 对β-内酰胺类耐药主要是产各种类型的BL A , 如SH V -12、OX A 、V EB -1、PER -1等, 易经接合方式获得耐药性, 常有多种耐药质粒共存。也可由PBP 缺失和亲和力下降及外膜通透性降低等机制而致多重耐药。主要因产碳青酶烯酶、P BP 改变或外膜蛋白缺失对亚胺培南耐药, 头孢菌素的使用可选择出β-内酰胺类(包括碳青酶烯类) 的耐药性。gy rA 、pa rC 基因突变主动外排过度表达导致对喹诺酮类耐药, 对氨基糖苷类耐药主要是产A M Es 。ABA 可携带≥1种AM Es 基因甚至bla IM P 、bla OXA 等基因, 可借助整合子、转座子、质粒在种株间传播。
1. 4 SM A (嗜麦芽寡养单胞菌) 在抗菌药物的选择压力下, 多重耐药的SM A 有更大的生存空间, 亚胺培南、头孢他现[8]BL A , 如青霉素酶、L 2头孢菌素酶、L 1金属锌酶。L 1酶是介导SM A 耐药的主要因素, L 1、L 2酶可同时被亚胺培南等诱导产生, 往往对几乎所有的β-内酰胺类耐药。介导BLA 的质粒可在菌种间传播耐药性。对喹诺酮类、氨基糖苷类、氯霉素等耐药可能与菌膜通透性下降、主动外排及灭活酶的产生有关。
2 结核分支杆菌的耐药机制[9]
结核分支杆菌不存在质粒, 染色体编码基因突变是其耐药性的主要分子机制。IN H 、RF P 、SM 、PZ A 、EM B 、喹诺酮类及乙硫异烟胺耐药分别与katG 、ahpC 、inhA , rpoB , rpsL 、rr S , pncA , embB , rr S , gy rA 、gy rB , inhA 、e taA 等基因突变有关。多重耐药结核菌多由多种药物顺次选择突变靶基因所致, 少数由一个耐多药位点突变引起, >95%的基因突变直接由抗结核药物引起。不规范用药是其多重耐药的主因。3 常见革兰阳性球菌的耐药机制
3. 1 P RSP (耐青霉素肺炎链球菌) P RSP 耐青霉素基因位于染色体上, 主要通过转化方式获得, 转化过程受操纵子co mCDE 的调节, 环境因素可诱导细菌产生感受态而发生转化。由于获得外来DN A 片段pbp 基因改变, 至少有4种PBP 发生变化, 导致对β-内酰胺类耐药。PRSP 获得erm 基因, 能编码23S RNA 甲基酶导致靶位修饰与大环内酯类-林可酰胺类-链阳霉素类(M LS ) 亲和力下降。获得mef 基因后能编码一种能量依赖外排泵将14、15员环大环内酯类泵出胞外。少数大环内酯类耐药株与细菌核糖体50S 大亚基23S RN A 以及核糖体蛋白L4和L 22突变有关。我国以erm 介导为主, er m 基因常位于转座子上, 有利于耐药性的传播, 可携带其他耐药基因。P RSP 因为是PBP 改变所致, 就或多或少地涉及到头孢菌素等药物, 还可存在其他靶位改变、主动外排及生物被膜作用, 通常对青霉素类、四环素、大环内酯类、氯霉素、克林霉素、磺胺类及利福平等多重耐药。P RSP 的高耐药率在某种程度上与β-内酰胺类、大环内酯类等药物不合理应用有关。头孢曲松单剂治疗P RSP 血药浓度低于防突变浓度, 易于产生耐药[10]。
3. 2 M RSA (耐甲氧西林金黄色葡萄球菌) M RS A 对甲氧西林低水平耐药可由于质粒介导产生的BLA , 来自DN A 的转导、转化或其他类型DN A 插入; 少数由于PBP 过量表达与甲氧西林的亲和力下降所致。对甲氧西林高水平耐药主要由染色体介导, 结构基因mecA 编码P BP 2a 是金黄色葡萄球菌耐甲氧西林的主要分子基础。编码BLA 和PBP 2a 的基因与调控因子具有同源性[11], PBP 2a 的诱导和生成常与BL A 质粒的诱导激活相关。mecA 受其上游区mecRI (编码诱导因子M ecRI ) -mecI (编码抵制因子M ecI ) 调控, 在β-内酰胺类诱导后延迟表达P BP 2a ; 缺少mecRI -mecI 而有BLA 质粒, 可通过BL A 调控基因调控被β-内酰胺类即刻诱导表达PBP 2a , 并影响BLA 的产生; 少数缺少mecRI -mecI 基因及BL A 质粒者P BP 2a 可呈非诱导持续表达。PBP 2a 同样具有转P
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失活时, 能执行PBP 的细胞壁合成功能使细菌存活。而PBP 2a 对β-内酰胺类药物的亲和力很低, 对几乎所有的β-内酰胺类耐药。mecA 基因位于一个可移动元件SCCmec DN A 上, 这个元件由不同的整合子、转座子等组成, 分别编码不同的耐药基因。M RSA 均呈多重耐药性, 常携带多种耐药基因, 多种BL A 质粒的表达与红霉素相关耐药有关, 辅助基因fem A 、B 、C 、D 与mecA 基因协同使得M RSA 具有更高度的耐药性。对氨基糖苷类耐药主要因产A M Es , 也可由于基因突变导致靶位改变引起。对M LS 耐药主要由于产M LS 钝化酶或erm 基因编码甲基酶。r po B 基因突变导致对利福霉素类耐药, 由m rsA 基因编码的主动外排可导致大环内酯类耐药。pr aC 、gy rA 及其等位基因(nalA 、no rA 、nf xA 、cfx A ) 等的突变致靶位改变、外膜蛋白减少或主动外排造成喹诺酮类的耐药性。氯霉素酰基转移酶及主动外排导致对氯霉素耐药, 还可产生对氨苯甲酸与磺胺类药物竞争结合位点。少数金黄色葡萄球菌缺乏自溶酶, 对β-内酰胺类及万古霉素耐受。已知金黄色葡萄球菌编码PBP 2的基因与编码万古霉素耐药基因有关联, 其对万古霉素的耐药可能和PBP 及细胞壁的异常、假靶位增加或vanA 基因的转移有关。体外研究发现替考拉宁可引起金黄色葡萄球菌对万古霉素或替考拉宁耐药。在抗菌药物选择压力下, 金黄色葡萄球菌基因变异可能是菌株多重耐药的主要原因。M RSA 常发生于年老体弱、免疫低下、有开放性创伤或使用导管的住院患者, 与抗菌药物使用及感染控制措施等多种因素有关[12]。mecA 基因可以遗传、也可以通过转座水平传播, 含有mecA 基因质粒的水平转移及与染色体的基因整合是导致其广泛转移的分子基础。在mec 上的I s431mec 可吸引其他耐药因子整合到mec 片段中, 使mec 片段逐渐积累抗菌药物和其他耐药基因, 有利于起源于质粒的耐药基因可更稳定地遗传。mec 及其他相关基因可在转座子的作用下插入其他染色体或质粒中使耐药性迅速传播, 并可通过基因重组获得新的耐药性。金黄色葡萄球菌的某些质粒不能通过接合传递, 但其质粒或染色体基因也可通过噬菌体转导。多重耐药株的交叉感染不容忽视。
3. 3 EN T (肠球菌属) 由于膜孔蛋白通道狭窄对多数抗菌药物如头孢菌素固有药物, 对多数氨基糖苷类及克林霉素低水平固有耐药, 对喹诺酮类中度敏感或耐药, 可利用体内存在的外源性叶酸盐而对磺胺类耐药。肠球菌PBP 与大多数β-内酰胺类亲和力低下, 可产生大量低亲和力的P BP 或BL A 出现高水平耐青霉素, 还可获得产生对四环素、大环内酯类、红霉素、喹诺酮类、克林霉素等抗菌药物耐药。对氨基糖苷类高度耐药主要因产AM Es 。对糖肽类耐药主要与靶位改变亲和力下降有关, 其耐药表型主要有VanA 、B 、C 、D 、E5种, 分别由不同的基因簇编码。V anA 型对万古霉素、替考拉宁均耐药, 可在粪肠球菌、屎肠球菌中出现, 耐药基因位于T n1546及其类似转座子上, 可在肠球菌属中传播。vanB 基因位于染色体或质粒上, 通过共轭机制将耐药性传播, 可被万古霉素诱导(v anRB -vanSB 双组分调节系统转录活化) 耐。药。肠球菌属耐药基因可通过广谱宿主质粒、转座子、整合子、信息素-质粒系统接合转移。广谱宿主质粒可在肠球菌和其他G +球菌(如金黄色葡萄球菌、链球菌属) 之间转移耐药基因, 存在将万古霉素耐药性传递到毒力更强的细菌(如金黄色葡萄球菌) 的危险。pMG1样质粒广泛存在于屎肠球菌并与万古霉素等耐药性扩散有关。肠球菌属定植和获得性庆大霉素耐药与头孢菌素、氨基糖苷类使用有关, 肠球菌属感染常见于用过Ⅲ-CS 者。糖肽类、Ⅲ-CS 使用是促使VRE 增加的原因之一。亚胺培南的使用引发对氨苄西林耐药。4 对付细菌耐药性的途径和策略
4. 1 实行抗菌药物控制, 严格掌握适应证 不同地区、不同医院抗菌药物的耐药性差异有统计学意义, 主要与抗菌药物的使用和控制措施不同有关。严格预防、治疗用药的适应证, 防止抗菌药物在医疗及工农业生产中的滥用, 是防止和控制耐药的重要环节。必须结合当地情况确定禁用、限用药物, 采取严格的控制措施, 监控、限定抗菌药物的使用, 慎用可能会诱导细菌产生耐药的药物, 尽可能降低抗菌药物选择压力。
4. 2 重视病原学检查, 合理使用抗菌药物 送检细菌的同时, 参考经验治疗选用抗菌药物是合理用药的实用途径。尽早准确确定致病菌, 依据药敏结果用药是合理用药的关键。参考药敏将药物浓度、作用时间、抗菌活性和机体状况综合考虑, 根据药动学、药效学参数对时间/浓度依赖型药物执行不同的给药方案, 规范给药剂量、途径、间隔和疗程, 尽早改用高效、在感染部位能达到防突变浓度、直接作用于微生物靶位的药物, 必要时联用不同作用机制的敏感药物协同抗菌, 尽量关闭或缩小“突变选择窗”, 缩短血药浓度落在窗内的时间是减少耐药菌株产生的科学方法。由于抗菌压力不同, 细菌的耐药性不同, 药物在不同部位的浓度不同, 不同的耐药株、不同的感染部位、不同的机体状况和环境条件决定不同的用药方案, 不能照搬指南或教科书, 应强调尽早足量个体化用药。滥用和使用不足(剂量、疗程、抗菌活性) 均易选择出细菌的耐药性, 疗程过长耐药概率增大。2005年美国(A T S /IDSA ) H AP 指南指出, 近期抗菌药物使用史是产生多重耐药的高危因素, 应尽量避免使用(包括同类) 。
4. 3 建立耐药监控体系, 控制耐药菌传播 根据当地细菌耐药性的变迁, 近期感染病原菌及耐药状况指导经验用药, 有利于延缓细菌产生耐药性。提高临床检测水平, 全面连续监测耐药变化, 加强监管和人员培训, 争取全民参与, 及时采取有效的感染控制措施是综合防控耐药菌流行的基本要素。耐药基因的水平转移是临床菌株耐药性扩散的主要途径[1]。用乙醇消毒液洗手是最重要最有效的感染控制措施, 使用手套和隔离衣也可减少耐药株水平传播。对多重耐药菌株要象对待烈性传染病菌那样予以严格隔离[8], 及时切断传播, 减少耐药菌交叉感染。
4. 4 开发抗耐药新药, 灭活破坏耐药基因 任何抗菌药物使用后迟早都会产生耐药性, 最合理的用药也不能避免。开、克
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服细菌耐药性的有效途径。根据细菌的耐药机制可筛选开发对灭活酶稳定的药物及有效的酶抑制剂、膜通道剂、主动外排泵抑制剂, 可对药物进行结构改造和修饰获取抗耐药药物。阿贝卡星由地贝卡星引进保护基团所合成, 对AM Es 更稳定, 抗菌活性明显增强。利奈唑胺、雷莫拉宁、达托霉素及喹奴普汀-达福普汀等分别作用不同靶点, 增强了对G +球菌的抗菌活性。加替沙星等含有氟、具有P arC 和G yr A 双重靶位, 不易产生耐药。Ⅲ-CS 抗阳性菌活性弱, 易筛选出M RSA 和多重耐药肠球菌属[12]。亚胺培南缺少疏水性的苯环或杂环侧链结构, 有一独特的反式结构的羟乙基侧链, 具有耐泵、耐酶特点及抑酶效应, 能经穿孔素(po rin ) 通道快速穿透菌膜同时与菌内PBP 1, 2, 3结合通过不同机制迅速灭菌, 不诱导耐药菌株出现
[13]
取综合措施。合理用药十分重要、预防交叉感染不容忽视。
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4. 5 总结经验成果, 推行优化抗菌治疗策略
4. 5. 1 降阶梯治疗策略 “塔拉戈纳策略”等[14]认为, 对重症感染需尽早作经验性治疗。主张初期选择能覆盖所有可能引起感染病原菌的广谱药物实施“猛击”, 确保杀灭致病菌, 尽早根据药敏结果选用针对性强、尽量窄谱的药物“降阶梯”治疗。多项研究证实“降阶梯治疗策略”有助于避免产生耐药性, 并可减少资源使用。
4. 5. 2 轮换用药策略 集中单一用药容易产生选择性压力, 而且遗传学上耐药机制的相互关系可以造成对其他药物的耐药性。抗菌处方“标准化、单一化”是危险的。碳青酶烯类是目前公认的治疗产ESBLs 、A mpC 酶菌株感染的可靠药物, 但也不能作为普遍的首选加以推荐和长期使用。策略性轮换用药, 不仅可降低导致耐药的选择压力, 其依据是恢复调节基因发生突变理论。研究发现抗菌药物的轮换使用有助于消除耐药菌的耐药性[15], 可明显降低与感染相关的病死率及医院感染的发生率。在耐药性监测的基础上, 有计划地轮换用药可能是减少抗菌药物耐药的有效方法。
4. 5. 3 联合抗菌策略 防止耐药性传播最确切的方法是彻底清除耐药菌, 细菌多重耐药性的出现决定了联合用药的必然。个体化联用不同作用机制的抗菌药物除增加覆盖面、取得协同抗菌效应外, 还可缩小突变选择窗, 减少细菌耐药性的产生。DO T S 已被证明是预防耐药结核病的最有效措施[9]。限制用药与联合用药的目标是一致的。对P A E 、M RSA 、A BA 等高度耐药菌多主张联合治疗。抗假单胞菌的β-内酰胺类与氟喹诺酮类联合治疗P A E , 可阻止耐药性的产生。应用超声、弱电流破坏生物被膜, 联合渗透性强的药物抗菌可提高疗效。关键要掌握指征, 科学、合理应用。应避免高诱导作用的亚胺培南与Ⅲ-CS 联合[16]。EPIC 建议局部与全身联合预防治疗可作为一项危重病治疗指南[14], 但局部用药易产生耐药, 尚不主张普遍推荐。
总之, 耐药基因经过传代、转移、扩散以及不断变异可通过多种机制及其相互作用形成复杂的耐药性。耐药基因在不同菌株间传播是导致耐药性播散和难以预测的重要原因。控,
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常见多重耐药菌的耐药机制及防治对策
杨平满1, 周建英2
(1. 临海市第一人民医院, 浙江临海317000; 2. 浙江大学医学院附属第一医院, 浙江杭州310003) 关键词:细菌; 多重耐药; 耐药机制; 耐药基因; 防治对策
中图分类号:R969. 3 文献标识码:A 文章编号:1005-4529(2006) 12-1434-04 细菌耐药性的产生是细菌基因突变积累的结果。抗菌药物压力起筛选耐药优势菌的作用, 是细菌耐药性发生的主要源动力。一种抗菌药物的使用可造成对其他药物耐药性的共选择, 一种细菌可通过多种机制对抗菌药物产生耐药。整合子作为细菌捕获和表达基因的可移动遗传元件, 能编码整合酶、负责基因重组、介导细菌遗传物质迁移的基因转位, 为细菌提供了一种适应抗菌药物环境压力的机制[1]。质粒的交换、转座子的转座作用、整合子及其他一些机制都有利于耐药基因在不同质粒或质粒与染色体间移动交换导致细菌单药耐药、多重耐药, 垂直传代、多菌种播散, 加快耐药株的形成、蔓延。随着抗菌药物、免疫抑制剂的应用和有创技术的开展, 细菌的耐药性不断增强, 普遍呈现出高度耐药、多重耐药的态势。了解常见耐药菌的多重耐药机制, 针对产生耐药性的各个环节, 及时采取相应的防治对策已成为当务之急。
1 常见革兰阴性杆菌的主要耐药机制
G -杆菌主要通过产生灭活酶、改变结合靶位、降低外膜通透性、产生主动外排、形成生物被膜等机制对抗菌药物产生耐药性。β-内酰胺酶(BLA ) 尤为重要, 其种类繁多, 按Amble r 分类划分为ClassA 、B 、C 、D 等类。ClassA 类酶主要有T EM 、S HV 等, 长期使用第3代头孢菌素(Ⅲ-CS ) 可选择出产超广谱BLA (ESBLs ) 。ESBLs 由质粒介导, 最早由大肠埃希菌(ECO ) 、肺炎克雷伯菌(K PN ) 产生, 能水解大多数β-内酰胺类药物。SHV -10、T EM -50、68同时具有ESBLs 和耐酶抑制剂的特点。驱动ESBL s 进化的选择压力通常归因于氧亚胺β-内酰胺类、喹诺酮类等药物的使用强度。β-内酰胺类可促使启动子上调突变, 可转座因子插入、ESBLs 基因拷贝数增加导致细菌高产ESBL s 。不同种属的细菌可通过接合、转导、转化、转座等方式获得耐药基因。头孢噻肟的滥用导致我国流行的ESBL s 亚型主要为CT X -M 型, 往往表现对头孢噻肟、头孢曲松高度耐药。铜绿假单胞菌(P A E ) 和鲍氏不动杆菌(A BA ) 的质粒上所携带的O XA 型ESBLs 基因通过质粒转化给肠杆菌科细菌, 不仅使氨苄西林和头孢菌素失效, 而且对苯唑西林和氯唑西林有高度水解活性。在我国>20%的K P N 产ESBLs , 主要由R 质粒上的转座子编码, 通-2006--过接合转移。由于基因转移, 1株细菌可同时产T EM 、SHV 、C TX -M 和O XA 型等ESBLs [2], 产ESBL s 菌株可同时产T EM 、S HV 型广谱酶及其他BL A (包括A mpC 酶) 。固有表达A mpC 酶, 它受染色体中amp 复合操纵子(包括5个不连锁基因ampC 、D 、R 、E 、G ) 调控, 一旦调控基因发生去阻遏突变细菌就可持续高产A mpC 酶。肠杆菌属细菌易被Ⅲ-CS 等选择产生A mpC 酶的去阻遏高表达, 氟喹诺酮类、氨基糖苷类和亚胺培南不诱导细菌产生A mpC 酶, 克拉维酸不仅不能抑制A mpC 酶反具有诱导产酶作用。K PN 染色体没有amp 操纵子结构、ECO 染色体缺ampF 基因不能被诱导表达Am pC 酶, 但可通过基因突变或获得A mpC 酶耐药质粒而高产A mpC 酶。可怕的是AmpC 酶基因一旦位于可移动质粒上, 容易播散流行并有可能进一步进化, 与ESBLs 一样往往也携带氨基糖苷类、磺胺类、四环素甚至喹诺酮类的耐药基因, 同时携带广谱酶甚至ESBL s 的情况也非常多见, 常常多重耐药。同时产ESBLs 、A mpC 酶菌株仅对碳青酶烯类敏感。整合子是耐药基因水平传播的重要因子, 捕获基因盒与抗菌药物的选择压力有关[3]。在不同的选择压力下, 整合子可通过多种形式捕获、整合和保留不同的耐药基因, 并能借助于转化、转导、接合跨菌属转移耐药基因, 可携带多个串联排列的基因盒借助于启动子介导多种耐药基因同时高表达, 是细菌、尤其G -杆菌多重耐药迅速发展的主要原因[4]。产酶株交叉耐药性的差异与各地用药习惯不同有关。1. 1 ECO 主要耐药机制是产ESBL s , 整合子等机制加速了多重耐药性的产生。随着抗菌药物的持续使用和耐药基因转移, 可出现T EM 、A mpC 型等多重BLA 活性, 还可能含有SHV 、O XA 型BLA 对抗菌药物产生多重耐药。对喹诺酮类的高耐药率可能与喹诺酮类应用太多、太滥有关。g y rA 和parC 突变、Acr A 的高表达可能是导致ECO 对喹诺酮类耐药的主要分子基础。g y rA 基因突变导致G y rA 酶空间结构改变及干拢喹诺酮-酶-DN A 相互作用产生对喹诺酮类低水平耐药, 若同时出现g yr B 突变使外膜通透性下降可出现高水平耐药, 伴par C 突变可使耐药性加重。gy rB 的等位基因nfxB 、no rB 、cf xB 和o fxB 的突变引起膜磷酯双分子层改变, 使O mpF 表达减少。A crA -A crB -T olC 多排泵可在野生型ECO 中表达, 受A cr R 、So xS 、RobA 及M arA B 调节。抗菌药物、酸碱环境和氧化还原状态均影响A rcA -A rcB -T o lC 的-诺酮内
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酯类、四环素类、氯霉素等药物, 还常伴有OmpF 的降低导致多重耐药。nfx B 接近O mpF 的结构基因, no rB 、cfxB 、o fxB 则接近于marA , marA 可通过调控数个远程基因影响细胞膜的通透性和主动外排泵形成多重耐药表型, 表现对头孢菌素、四环素和氯霉素交叉耐药。对四环素的耐药可由质粒介导诱导产生。tetA 、B 、K 介导四环素类外排泵、tetM 编码保护性蛋白均可减少四环素与核糖体的结合, 还可产酶灭活四环素。对氨基糖苷类耐药主要因产A M Es , r psL 突变可使链霉素不能与核糖体结合, mdfA 基因编码多药转运蛋白能输出卡那霉素的活性。rpoB 突变导致对利福平耐药, 还可存在红霉素钝化酶。整合子与耐药基因盒的接触会导致它们持续的选择[5], 临床分离的ECO 磺胺耐药基因至少与其他两种不同抗菌药物耐药基因相连。
1. 2 P AE 没有经典的高通道蛋白、外膜通透性差是PA E 对结构不同的多类抗菌药物固有耐药的重要原因。其他机制主要有:(1) 产生灭活酶, 如多种ESBL s 、A mpC 酶、A M Es 及碳青酶烯酶等。(2) 靶位改变, 如PBP 3, 4, 5改变使其对β-内酰胺类亲和力下降, 改变二氢叶酸合成酶使磺胺类结合力下降, Gy r A 亚基上83-87区域突变易致喹诺酮类耐药, g y rB 、pa rC 、pa rE 突变可使耐药性加重。(3) 外膜主动外排、外膜蛋白C 、D 、E 、F 等的缺失变异、膜透性降低及生物被膜作用均可导致对β-内酰胺类、喹诺酮类、氯霉素、四环素等耐药。主动外排是其固有耐药和获得性多重耐药的主要原因。PA E 已知的7类多重外排泵有各自的调节基因如mex R 、nfxB 等, 这些基因突变仅出现在g y rA 或parC 突变基础上, 引起外排泵表达增高。M exA -M ex B -O prM 广泛在于G -杆菌中, 其外排底物极为广泛, 是迄今发现的最具重要性的外排系统, 可在氟喹诺酮类、亚胺培南治疗过程中出现。M exX -M ex Y -OprM 使P A E 对氨基糖苷类具有显著的固有耐药性。喹诺酮类选择出的nfxC 突变株M e xE -M ex F -O pr N 活性增强常伴以O prD 明显降低, 因而可与碳青酶烯类交叉耐药。O prD 改变是PA E 对亚胺培南和美罗培南耐药的共同机制, 主动外排可导致美罗培南耐药而对亚胺培南无作用。低浓度亚胺培南可能通过抑制O prD 2的表达, 诱导BLA 高表达, 降低碳青酶烯类对PA E 体外抗菌活性[6]。应用碳青酶烯类是PA E 多重耐药的独立危险因素[7]。
1. 3 A BA A BA 对β-内酰胺类耐药主要是产各种类型的BL A , 如SH V -12、OX A 、V EB -1、PER -1等, 易经接合方式获得耐药性, 常有多种耐药质粒共存。也可由PBP 缺失和亲和力下降及外膜通透性降低等机制而致多重耐药。主要因产碳青酶烯酶、P BP 改变或外膜蛋白缺失对亚胺培南耐药, 头孢菌素的使用可选择出β-内酰胺类(包括碳青酶烯类) 的耐药性。gy rA 、pa rC 基因突变主动外排过度表达导致对喹诺酮类耐药, 对氨基糖苷类耐药主要是产A M Es 。ABA 可携带≥1种AM Es 基因甚至bla IM P 、bla OXA 等基因, 可借助整合子、转座子、质粒在种株间传播。
1. 4 SM A (嗜麦芽寡养单胞菌) 在抗菌药物的选择压力下, 多重耐药的SM A 有更大的生存空间, 亚胺培南、头孢他现[8]BL A , 如青霉素酶、L 2头孢菌素酶、L 1金属锌酶。L 1酶是介导SM A 耐药的主要因素, L 1、L 2酶可同时被亚胺培南等诱导产生, 往往对几乎所有的β-内酰胺类耐药。介导BLA 的质粒可在菌种间传播耐药性。对喹诺酮类、氨基糖苷类、氯霉素等耐药可能与菌膜通透性下降、主动外排及灭活酶的产生有关。
2 结核分支杆菌的耐药机制[9]
结核分支杆菌不存在质粒, 染色体编码基因突变是其耐药性的主要分子机制。IN H 、RF P 、SM 、PZ A 、EM B 、喹诺酮类及乙硫异烟胺耐药分别与katG 、ahpC 、inhA , rpoB , rpsL 、rr S , pncA , embB , rr S , gy rA 、gy rB , inhA 、e taA 等基因突变有关。多重耐药结核菌多由多种药物顺次选择突变靶基因所致, 少数由一个耐多药位点突变引起, >95%的基因突变直接由抗结核药物引起。不规范用药是其多重耐药的主因。3 常见革兰阳性球菌的耐药机制
3. 1 P RSP (耐青霉素肺炎链球菌) P RSP 耐青霉素基因位于染色体上, 主要通过转化方式获得, 转化过程受操纵子co mCDE 的调节, 环境因素可诱导细菌产生感受态而发生转化。由于获得外来DN A 片段pbp 基因改变, 至少有4种PBP 发生变化, 导致对β-内酰胺类耐药。PRSP 获得erm 基因, 能编码23S RNA 甲基酶导致靶位修饰与大环内酯类-林可酰胺类-链阳霉素类(M LS ) 亲和力下降。获得mef 基因后能编码一种能量依赖外排泵将14、15员环大环内酯类泵出胞外。少数大环内酯类耐药株与细菌核糖体50S 大亚基23S RN A 以及核糖体蛋白L4和L 22突变有关。我国以erm 介导为主, er m 基因常位于转座子上, 有利于耐药性的传播, 可携带其他耐药基因。P RSP 因为是PBP 改变所致, 就或多或少地涉及到头孢菌素等药物, 还可存在其他靶位改变、主动外排及生物被膜作用, 通常对青霉素类、四环素、大环内酯类、氯霉素、克林霉素、磺胺类及利福平等多重耐药。P RSP 的高耐药率在某种程度上与β-内酰胺类、大环内酯类等药物不合理应用有关。头孢曲松单剂治疗P RSP 血药浓度低于防突变浓度, 易于产生耐药[10]。
3. 2 M RSA (耐甲氧西林金黄色葡萄球菌) M RS A 对甲氧西林低水平耐药可由于质粒介导产生的BLA , 来自DN A 的转导、转化或其他类型DN A 插入; 少数由于PBP 过量表达与甲氧西林的亲和力下降所致。对甲氧西林高水平耐药主要由染色体介导, 结构基因mecA 编码P BP 2a 是金黄色葡萄球菌耐甲氧西林的主要分子基础。编码BLA 和PBP 2a 的基因与调控因子具有同源性[11], PBP 2a 的诱导和生成常与BL A 质粒的诱导激活相关。mecA 受其上游区mecRI (编码诱导因子M ecRI ) -mecI (编码抵制因子M ecI ) 调控, 在β-内酰胺类诱导后延迟表达P BP 2a ; 缺少mecRI -mecI 而有BLA 质粒, 可通过BL A 调控基因调控被β-内酰胺类即刻诱导表达PBP 2a , 并影响BLA 的产生; 少数缺少mecRI -mecI 基因及BL A 质粒者P BP 2a 可呈非诱导持续表达。PBP 2a 同样具有转P
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失活时, 能执行PBP 的细胞壁合成功能使细菌存活。而PBP 2a 对β-内酰胺类药物的亲和力很低, 对几乎所有的β-内酰胺类耐药。mecA 基因位于一个可移动元件SCCmec DN A 上, 这个元件由不同的整合子、转座子等组成, 分别编码不同的耐药基因。M RSA 均呈多重耐药性, 常携带多种耐药基因, 多种BL A 质粒的表达与红霉素相关耐药有关, 辅助基因fem A 、B 、C 、D 与mecA 基因协同使得M RSA 具有更高度的耐药性。对氨基糖苷类耐药主要因产A M Es , 也可由于基因突变导致靶位改变引起。对M LS 耐药主要由于产M LS 钝化酶或erm 基因编码甲基酶。r po B 基因突变导致对利福霉素类耐药, 由m rsA 基因编码的主动外排可导致大环内酯类耐药。pr aC 、gy rA 及其等位基因(nalA 、no rA 、nf xA 、cfx A ) 等的突变致靶位改变、外膜蛋白减少或主动外排造成喹诺酮类的耐药性。氯霉素酰基转移酶及主动外排导致对氯霉素耐药, 还可产生对氨苯甲酸与磺胺类药物竞争结合位点。少数金黄色葡萄球菌缺乏自溶酶, 对β-内酰胺类及万古霉素耐受。已知金黄色葡萄球菌编码PBP 2的基因与编码万古霉素耐药基因有关联, 其对万古霉素的耐药可能和PBP 及细胞壁的异常、假靶位增加或vanA 基因的转移有关。体外研究发现替考拉宁可引起金黄色葡萄球菌对万古霉素或替考拉宁耐药。在抗菌药物选择压力下, 金黄色葡萄球菌基因变异可能是菌株多重耐药的主要原因。M RSA 常发生于年老体弱、免疫低下、有开放性创伤或使用导管的住院患者, 与抗菌药物使用及感染控制措施等多种因素有关[12]。mecA 基因可以遗传、也可以通过转座水平传播, 含有mecA 基因质粒的水平转移及与染色体的基因整合是导致其广泛转移的分子基础。在mec 上的I s431mec 可吸引其他耐药因子整合到mec 片段中, 使mec 片段逐渐积累抗菌药物和其他耐药基因, 有利于起源于质粒的耐药基因可更稳定地遗传。mec 及其他相关基因可在转座子的作用下插入其他染色体或质粒中使耐药性迅速传播, 并可通过基因重组获得新的耐药性。金黄色葡萄球菌的某些质粒不能通过接合传递, 但其质粒或染色体基因也可通过噬菌体转导。多重耐药株的交叉感染不容忽视。
3. 3 EN T (肠球菌属) 由于膜孔蛋白通道狭窄对多数抗菌药物如头孢菌素固有药物, 对多数氨基糖苷类及克林霉素低水平固有耐药, 对喹诺酮类中度敏感或耐药, 可利用体内存在的外源性叶酸盐而对磺胺类耐药。肠球菌PBP 与大多数β-内酰胺类亲和力低下, 可产生大量低亲和力的P BP 或BL A 出现高水平耐青霉素, 还可获得产生对四环素、大环内酯类、红霉素、喹诺酮类、克林霉素等抗菌药物耐药。对氨基糖苷类高度耐药主要因产AM Es 。对糖肽类耐药主要与靶位改变亲和力下降有关, 其耐药表型主要有VanA 、B 、C 、D 、E5种, 分别由不同的基因簇编码。V anA 型对万古霉素、替考拉宁均耐药, 可在粪肠球菌、屎肠球菌中出现, 耐药基因位于T n1546及其类似转座子上, 可在肠球菌属中传播。vanB 基因位于染色体或质粒上, 通过共轭机制将耐药性传播, 可被万古霉素诱导(v anRB -vanSB 双组分调节系统转录活化) 耐。药。肠球菌属耐药基因可通过广谱宿主质粒、转座子、整合子、信息素-质粒系统接合转移。广谱宿主质粒可在肠球菌和其他G +球菌(如金黄色葡萄球菌、链球菌属) 之间转移耐药基因, 存在将万古霉素耐药性传递到毒力更强的细菌(如金黄色葡萄球菌) 的危险。pMG1样质粒广泛存在于屎肠球菌并与万古霉素等耐药性扩散有关。肠球菌属定植和获得性庆大霉素耐药与头孢菌素、氨基糖苷类使用有关, 肠球菌属感染常见于用过Ⅲ-CS 者。糖肽类、Ⅲ-CS 使用是促使VRE 增加的原因之一。亚胺培南的使用引发对氨苄西林耐药。4 对付细菌耐药性的途径和策略
4. 1 实行抗菌药物控制, 严格掌握适应证 不同地区、不同医院抗菌药物的耐药性差异有统计学意义, 主要与抗菌药物的使用和控制措施不同有关。严格预防、治疗用药的适应证, 防止抗菌药物在医疗及工农业生产中的滥用, 是防止和控制耐药的重要环节。必须结合当地情况确定禁用、限用药物, 采取严格的控制措施, 监控、限定抗菌药物的使用, 慎用可能会诱导细菌产生耐药的药物, 尽可能降低抗菌药物选择压力。
4. 2 重视病原学检查, 合理使用抗菌药物 送检细菌的同时, 参考经验治疗选用抗菌药物是合理用药的实用途径。尽早准确确定致病菌, 依据药敏结果用药是合理用药的关键。参考药敏将药物浓度、作用时间、抗菌活性和机体状况综合考虑, 根据药动学、药效学参数对时间/浓度依赖型药物执行不同的给药方案, 规范给药剂量、途径、间隔和疗程, 尽早改用高效、在感染部位能达到防突变浓度、直接作用于微生物靶位的药物, 必要时联用不同作用机制的敏感药物协同抗菌, 尽量关闭或缩小“突变选择窗”, 缩短血药浓度落在窗内的时间是减少耐药菌株产生的科学方法。由于抗菌压力不同, 细菌的耐药性不同, 药物在不同部位的浓度不同, 不同的耐药株、不同的感染部位、不同的机体状况和环境条件决定不同的用药方案, 不能照搬指南或教科书, 应强调尽早足量个体化用药。滥用和使用不足(剂量、疗程、抗菌活性) 均易选择出细菌的耐药性, 疗程过长耐药概率增大。2005年美国(A T S /IDSA ) H AP 指南指出, 近期抗菌药物使用史是产生多重耐药的高危因素, 应尽量避免使用(包括同类) 。
4. 3 建立耐药监控体系, 控制耐药菌传播 根据当地细菌耐药性的变迁, 近期感染病原菌及耐药状况指导经验用药, 有利于延缓细菌产生耐药性。提高临床检测水平, 全面连续监测耐药变化, 加强监管和人员培训, 争取全民参与, 及时采取有效的感染控制措施是综合防控耐药菌流行的基本要素。耐药基因的水平转移是临床菌株耐药性扩散的主要途径[1]。用乙醇消毒液洗手是最重要最有效的感染控制措施, 使用手套和隔离衣也可减少耐药株水平传播。对多重耐药菌株要象对待烈性传染病菌那样予以严格隔离[8], 及时切断传播, 减少耐药菌交叉感染。
4. 4 开发抗耐药新药, 灭活破坏耐药基因 任何抗菌药物使用后迟早都会产生耐药性, 最合理的用药也不能避免。开、克
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服细菌耐药性的有效途径。根据细菌的耐药机制可筛选开发对灭活酶稳定的药物及有效的酶抑制剂、膜通道剂、主动外排泵抑制剂, 可对药物进行结构改造和修饰获取抗耐药药物。阿贝卡星由地贝卡星引进保护基团所合成, 对AM Es 更稳定, 抗菌活性明显增强。利奈唑胺、雷莫拉宁、达托霉素及喹奴普汀-达福普汀等分别作用不同靶点, 增强了对G +球菌的抗菌活性。加替沙星等含有氟、具有P arC 和G yr A 双重靶位, 不易产生耐药。Ⅲ-CS 抗阳性菌活性弱, 易筛选出M RSA 和多重耐药肠球菌属[12]。亚胺培南缺少疏水性的苯环或杂环侧链结构, 有一独特的反式结构的羟乙基侧链, 具有耐泵、耐酶特点及抑酶效应, 能经穿孔素(po rin ) 通道快速穿透菌膜同时与菌内PBP 1, 2, 3结合通过不同机制迅速灭菌, 不诱导耐药菌株出现
[13]
取综合措施。合理用药十分重要、预防交叉感染不容忽视。
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4. 5 总结经验成果, 推行优化抗菌治疗策略
4. 5. 1 降阶梯治疗策略 “塔拉戈纳策略”等[14]认为, 对重症感染需尽早作经验性治疗。主张初期选择能覆盖所有可能引起感染病原菌的广谱药物实施“猛击”, 确保杀灭致病菌, 尽早根据药敏结果选用针对性强、尽量窄谱的药物“降阶梯”治疗。多项研究证实“降阶梯治疗策略”有助于避免产生耐药性, 并可减少资源使用。
4. 5. 2 轮换用药策略 集中单一用药容易产生选择性压力, 而且遗传学上耐药机制的相互关系可以造成对其他药物的耐药性。抗菌处方“标准化、单一化”是危险的。碳青酶烯类是目前公认的治疗产ESBLs 、A mpC 酶菌株感染的可靠药物, 但也不能作为普遍的首选加以推荐和长期使用。策略性轮换用药, 不仅可降低导致耐药的选择压力, 其依据是恢复调节基因发生突变理论。研究发现抗菌药物的轮换使用有助于消除耐药菌的耐药性[15], 可明显降低与感染相关的病死率及医院感染的发生率。在耐药性监测的基础上, 有计划地轮换用药可能是减少抗菌药物耐药的有效方法。
4. 5. 3 联合抗菌策略 防止耐药性传播最确切的方法是彻底清除耐药菌, 细菌多重耐药性的出现决定了联合用药的必然。个体化联用不同作用机制的抗菌药物除增加覆盖面、取得协同抗菌效应外, 还可缩小突变选择窗, 减少细菌耐药性的产生。DO T S 已被证明是预防耐药结核病的最有效措施[9]。限制用药与联合用药的目标是一致的。对P A E 、M RSA 、A BA 等高度耐药菌多主张联合治疗。抗假单胞菌的β-内酰胺类与氟喹诺酮类联合治疗P A E , 可阻止耐药性的产生。应用超声、弱电流破坏生物被膜, 联合渗透性强的药物抗菌可提高疗效。关键要掌握指征, 科学、合理应用。应避免高诱导作用的亚胺培南与Ⅲ-CS 联合[16]。EPIC 建议局部与全身联合预防治疗可作为一项危重病治疗指南[14], 但局部用药易产生耐药, 尚不主张普遍推荐。
总之, 耐药基因经过传代、转移、扩散以及不断变异可通过多种机制及其相互作用形成复杂的耐药性。耐药基因在不同菌株间传播是导致耐药性播散和难以预测的重要原因。控,