MTT法在抗真菌药敏实验中的应用

第24卷第6期2003年12月暨南大学学报（医学版）

（Medicine Edition ）JournaI of Jinan University VoI.24No.6

Dec. 2003

!"" 法在抗真菌药敏实验中的应用

张

晶1，林

晨1，岑颖洲2，沈伟哉1，刑莹莹2，

静1，李小兰1

江振友1，袁桂秀1，韦

（暨南大学1. 医学院微生物与免疫学教研室；2. 生命科学技术学院化学系，广东广州510632）［摘

要］目的：研究MTT 法在抗真菌药敏实验中的应用。方法：采用美国临床实验室标准化委

员会（NCCLS ）推荐方案测定两性霉素B 和伊曲康唑对5种常见真菌（白色念珠菌、光滑念珠菌、季也蒙念珠菌、申克孢子丝菌和石膏样小孢子癣菌）的最低抑菌浓度（MIC ），终点判定分别采用NC-对两法进行比较。结果：CLS 推荐的直接观察法和MTT 法，MTT 法与常规直接观察法进行MIC 终点判定所得结果具有很好的一致性。MTT 法测得的A 值与接种菌量具有正相关性。两性霉素B 与伊曲康唑对丝状真菌和念珠菌都具有很好的抑制作用，MTT 法测得的A 值随药物浓度的增加而显著降低。结论：准确，且可量化，因而可以很好的替MTT 法较之常规直接观察法结果更为客观、代肉眼观察法来判定真菌药敏试验的终点。

［关键词］真菌药敏实验；MTT 法；最低抑菌浓度；NCCLS 方案［中图分类号］R446.5

［文献标识码］A

［文章编号］1000-9965（2003）06-0036-05

近年来，随着免疫抑制剂的广泛应用，导管插管的普遍开展，广谱抗生素的大量应用，烧伤抢救、放射治疗、器官移植广泛进行，特别是免疫缺陷患者，尤其是艾滋病患者的不断增加，真菌病的发病率有逐渐增加的趋势。自美国国家临床实验室标准化委员会（NationaI Committee

分别于1997年推出了《关于酵母菌的液体培养基稀释for CIinicaI Laboratory Standards ，NCCLS ）

抗真菌药敏试验方案》（M27-A ）和1998年推出《产孢丝状真菌的液基稀释抗真菌药敏实验参

［1，2］

后，标准化的真菌药敏实验已经逐步普及起来。目前临床对真菌药敏实考方案》（M38-P ）

验结果判断常规采用肉眼观察法。MTT 法由于可通过测得A 值对结果进行量化分析，较之肉

眼观察法更为客观、灵敏，易于进行统计分析，因而具有更大的临床应用价值。本研究采用（minimum inhibitory concentration ，判定，并与常MTT 法对临床常见真菌进行最低抑菌浓度MIC ）规直接观察法进行比较，以便了解MTT 法在抗真菌药敏实验中的应用情况。

#

#. #

材料与方法

菌种

白色念珠菌（C. albicans ，、申克孢子丝菌（S. schenckii ）、石膏样小孢子癣菌ATCC10231）（T. gupseum ），为暨南大学医学院微生物教研室收藏菌种。

［收稿日期］2003-06-13

［基金项目］国家自然科学基金项目（20172020）省自然科学基金项目（粤科基（2001）广东省重点基金项目10号-010401）

（013203）

［作者简介］张

晶（1976-），女，硕士研究生，研究方向：感染与免疫. 通讯联系人：林

晨. TeI （020）85220257.

第6期张晶等：MTT 法在抗真菌药敏实验中的应用

37

光滑念珠菌（C. glabrata ，、季也蒙念珠菌（C. guiliermondii ，系广州市ATCC2001）ATCC6260）孙逸仙纪念医院皮肤科真菌室席艳丽教授赠送菌株。1. 2

抗真菌药物

两性霉素B （Amp1otericin B ）购自Sigma 公司，伊曲康唑（Itraconazoie ，ICZ ）西安杨森制药公司出品。用质量分数100%二甲基亚砜（DMSO ）将两种药物溶解，然后用无菌蒸馏水制备成质量浓度1280! 存于-20C 冰箱备用。g /mL 溶液，1. 3培养基

［3］

沙氏培养基、马铃薯培养基、（pH 7. 0，RPMI -1640液体培养基0. 165moi /L MOPS 缓冲液）。

1.4

MTT 试剂

购自美国Amresco 公司，用pH 7.2PBS 配制成5mg /mL ，0. 22! m 滤器过滤除菌，4C 避光保存。

真菌接种液的制备

各受试念珠菌株在沙氏培养基上转种2次，以确保其纯度和生长力，培养温度自始至终为

1. 5

选择直径大于1mm 的菌落5个，将其用质量分数为0.85%的无菌盐水35C 。经241培养后，

制成悬液。用血细胞计数板计数孢子，调整含菌量，使集落形成单位（coiony forming unit ，CFU ）再稀释10倍，为1X 106~5X 106/mL 。接种时用RPMI -1640培养液将其稀释200倍后，CFU 调至0.5X 103~2.5X 103/mL 。

丝状菌株需在马铃薯葡萄糖琼脂培养基上30C 活化并纯化7c 后，取质量分数为0. 85%的无菌盐水1mL 加入培养7c 的培养皿中，用巴氏吸管轻轻抽吸，将菌悬液吸至无菌试管中，静置3~5min 后，取上部匀质液体（含孢子或孢子囊孢子和菌丝片断），在振荡器上振荡15s 。用血细胞计数板计数，调节CFU 为0.4X 106~5X 106/mL 。再将上述菌悬液用RPMI -1640稀释50倍得2倍最终含菌量（CFU 为0.4X 104~5X 104/mL ）的菌悬液备用。为保证试验准确性做菌落计数，取0.01mL 上述菌悬液接种于改良沙氏琼脂平皿中，每天观察，计数菌落。1. 6接种

用RPMI -1640培养液采用倍比稀释法稀释抗真菌药物，使成8~0. 16! g /mL 的系列倍比质量浓度。于96板每行1~10列孔内加入系列稀释药液100! 同时做3行复孔。第11孔为L ，阴性对照；阴性对照孔不加。置12孔为阳性对照。加入已制备的真菌溶液100! L 于各孔中，湿盒内孵育。念珠菌35C 孵育241，丝状菌30C 孵育481。1. 7

终点判定

直接观察法：孵育结束后，肉眼观察结果，首先观察阳性对照孔内若出现浑浊沉淀，即示真菌在该条件下生长良好，再确定阴性孔内无沉淀，示无任何微生物污染，再从高至低浓度逐个检查真菌被抑制生长情况。伊曲康唑由于具有拖尾现象，以开始出现微混的孔（即阳性对照孔被抑制达80%以上的孔）的药物质量浓度作为其MIC ，对两性霉素B 的MIC 则以菌完全被抑制的药液质量浓度为MIC 终点。

于孵育结束前3~41，每孔加入MTT 液10! 继续培养3~41后，吸出上清100MTT 法：L ，

加入二甲基亚砜（DMSO ）震荡5min 后，用酶标仪（BioRAD 450型微孔板判读仪）测L ，100! L ，!

吸光度A （测量波长570nm ，参考波长655nm ）。同样以被抑制达80%的孔的药液质量浓度作

38

暨南大学学报（医学版）2003年

为伊曲康唑的MIC ，以完全被抑制的孔最低药物质量浓度作为两性霉素B 的MIC 终点。

为确保实验结果的准确性和可重复性，本实验结果均为3次实验的重复结果。

2

2.1

结果

直接观察法与MTT 法测定抗真菌药物MIC 结果的比较

表1真菌C. albicans C. glabrata C. guiliermondii S. schenckii T. gupseum

肉眼法与MTT 法测定MIC 结果

Amphotericin B 直接观察法0.250.1250.250.50.5

MTT 法0.250.1250.250.250.5

直接观察法0.1250.50.1250.250.5

g /mL !

本实验依照NCCLS 推荐方案M27-A 和

（Amphotericin B ）和伊M38-P 测定两性霉素B

曲康唑（Itraconazole ）对5种常见真菌（白色念

珠菌、光滑念珠菌、季也蒙念珠菌、申克孢子丝菌和石膏样小孢子癣菌）的MIC 值，判定结果分别采用直接观察法和MTT 法，结果显示，除两种药物对申克孢子丝菌的MIC 和伊曲康唑对白色念珠菌的MIC 均有一个浓度倍比的差异外，两种方法所得MIC 完全一致。结果如表1。2.2

接种菌量对MTT 测定结果的影响为探讨菌量与MTT

形成甲

的

Itraconazole

MTT 法0.0630.50.1250.50.5

值的相关分析

参数r P

C. albicans 0.7690.010

C. glabrata 0.8170.000

C. guiliermondii

0.9520.000

S. schenckii 0.5650.028

T. gupseum 0.9160.000

2.3用MTT 法对两性霉素 与伊曲康唑抑菌效果比较

选用两性霉素B 和伊曲康唑测定它们对5种常见真菌的抑菌效果，根据MTT 法测的A 值算得两性霉素B 和伊曲康唑各浓度对5种真菌的抑制率。

抑制率=（1-测定孔A 值/阳性对照孔A 值）见图2、>100%，3。

法在抗真菌药敏实验中的应用

（

F

，

死

量

的的

40

暨南大学学报（医学版）2003年

极大的应用前景。

［参考文献］

［1］王文莉，郑玮清，李若瑜等. 采用NCCLS M27-A 方案微量法检测念珠菌对抗真菌药物的敏感性［J ］. 中

国检验医学杂志，（2）：2001，24107-108.

［2］孙志坚，李若瑜，李东明等. 产孢丝状真菌NCCLS 药敏试验方法的应用［J ］. 中华检验医学杂志，2001，24

（1）：43-44.

［3］NATIONAL COMMITTEE FOR CLINICAL LABORATORY STANDARDS. Reference Method for Broth Diiution Anti-［M ］fungai Sesceptibiiity Testing of Yeast Tentative Standard M27-T . Pennsyivania ：NCCLS ，1995：1-22. ［4］MOSMANN T. Rapid coiorimetric assay for ceiiuiar growth and survivai ：appiication to proiiferation and cytotoxicity

［J ］（1-2）：assays . Immunoi Methods ，1983，6555-63.

［5］SARGENT J M ，TAYLOR C G. Appraisai of the MTT assay as a rapid test of chemosensitivity in acute myeioid

［J ］（2）：ieukaemia . Br J Cancer ，1989，60206-210.

［6］TELLIER R ，KRAJDEN M ，GRIGORIEW G A ，et ai. Innovative end -point determination system for antifungai sus-［J ］（8）：ceptibiiity testing of yeasts . Antimicrob Agents Chemother ，1992，361619-1625.

［7］JAHN B ，MARTIN E ，STUEBEN A ，et ai. Susceptibiiity testing of Candida aibicans and Aspergiiius species by a

（4，simpie microtiter menadione -augmented 3-5-dimethyi -2-thiazoiyi ）-2，5-diphenyi -2H -tetrazoiium ［J ］（3）：bromide assay . J Ciin Microbioi ，1995，33661-667.

［8］王文莉，王端礼，李若瑜等. 酵母菌的NCCLS 方案药敏试验方法及其应用［J ］. 中华医学检验杂志，1997，

（2）：411812-1814.

Study of MTT assay for antifungal susceptibility testing

ZHANG Jing 1，LIN Chen 1，CEN Ying -zhou 2，SHEN Wei -zai 1，XING Ying -ying 2，

JIANG Zhen -you 1，YUAN Gui -xiu 1，WEI Jing 1，LI Xiao -ian 1

（1. Medicai Coiiege ；2. Coiiege of Life Science and Technoiogy ，Jinan University ，Guangzhou 510632，China ）

［Abstract ］Aim ：To study MTT assay in the appiication of antifungai susceptibiiity testing. Meth-ods ：antifungai susceptibiiity testing of amphotericin B and Itraconazoie for 5normai fungai strains （C. aibicans ，S. schenckii ，C. giabrata ，C. guiiiermondii and T. gupseum ）were performed by reference

. The minimum inhibitory con-method of Nationai Committee for Ciinicai Laboratory Standard （NCCLS ）

（MIC ）were determined by MTT assay and routine direct observing assay separateiy. These centration

MIC vaiues from two assay were compared with each other. Results ：The MTT assay and routine direct observing to determine endpoint are good identicai. The ! vaiues of MTT assay has good correiativity with numbers of viabie fungi. The resuits showed that the fungi were inhibited significantiy in the presence of Amphotericin B or Itraconazoie. The ! vaiues of MTT assay decreased asg the increase of the concentra-tion of antifungai drugs. Conclusion ：MTT assay is more objective ，more precise than routine direct ob-serving ，then it can repiace routine direct observing assay to determine antifungai endpoint.

［Key words ］antifungai susceptibiiity testing ；MTT ；minimum inhibitory concentration （MIC ）；reference method of NCCLS

［责任编辑：李弘］

MTT法在抗真菌药敏实验中的应用

作者：作者单位：

张晶， 林晨， 岑颖洲， 沈伟哉， 刑莹莹， 江振友， 袁桂秀， 韦静， 李小兰

张晶,林晨,沈伟哉,江振友,袁桂秀,韦静,李小兰(暨南大学医学院微生物与免疫学教研室,广东,广州,510632)， 岑颖洲,刑莹莹(暨南大学生命科学技术学院化学系,广东,广州,510632)

暨南大学学报(自然科学与医学版)

JOURNAL OF JINAN UNIVERSITY（NATURAL SCIENCE & MEDICINE EDITION）2003,24(6)14次

刊名：英文刊名：年，卷(期)：被引用次数：

参考文献(8条)

1. Tellier R;KRAJDEN M;GRIGORIEW G A Innovative end-point determination system forantifungal susceptibility testing of yeasts 1992(08)

2. Sargent J M;TAYLOR C G Appraisal of the MTT assay as a rapid test of chemosensitivityin acute myeloid leukaemia 1989(02)

3. Mosmann T Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: application toproliferation and cytotoxicity assays 1983(1-2)

4. 王文莉;王端礼;李若瑜 酵母菌的NCCLS方案药敏试验方法及其应用 1997(02)

5. Jahn B;MARTIN E;STUEBEN A Susceptibility testing of Candida albicans and Aspergillusspecies by a simple microtiter menadione-augmented 3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide assay[外文期刊] 1995(03)

6. National committee for clinical laboratory standards Reference Method for BrothDilution Antifungal Sesceptibility Testing of Yeast Tentative Standard M27-T 19957. 孙志坚;李若瑜;李东明 产孢丝状真菌NCCLS药敏试验方法的应用[期刊论文]-中华检验医学杂志2001(01)

8. 王文莉;郑玮清;李若瑜 采用NCCLS M27-A方案微量法检测念珠菌对抗真菌药物的敏感性[期刊论文]

-中华检验医学杂志 2001(02)

引证文献(14条)

1. 王晓慧. 刘伟. 李若瑜 申克孢子丝菌体外药敏试验研究近况[期刊论文]-中国真菌学杂志 2009(2)2. 杨继君. 陈兴平 外排泵基因在白念珠菌生物膜耐药性产生中的作用[期刊论文]-中国皮肤性病学杂志 2008(9)

3. 郑憧娇. 赵恕. 张虹 抗真菌药物体外药敏试验方法的比较[期刊论文]-中国微生态学杂志 2008(3)4. 滕炳会. 于长平. 邱勇. 张克伟 用MTT法检测抗真菌药物对白念珠菌的敏感性[期刊论文]-医学理论与实践 2008(2)

5. 杨继君. 陈兴平 白念珠菌生物膜形成不同时期对氟康唑的敏感性[期刊论文]-华中科技大学学报(医

学版) 2007(6)

6. 滕炳会. 于长平. 邱勇. 吴梅. 张克伟 念珠菌三种体外药敏试验方法的比较研究[期刊论文]-中国麻风皮肤病杂志 2007(10)

7. 滕炳会. 于长平. 杜文莉. 张克伟 43株念珠菌分离鉴定和药敏试验研究[期刊论文]-预防医学论坛2007(8)

8. 王莉. 赵俊英. 徐薇. 蒋大林. 汪莉 口服伊曲康唑在人角质层抗念珠菌活性的研究[期刊论文]-首都医科大学学报 2006(6)

9. 史淑娟 消炎痛抑制白色念珠菌菌丝形成的实验研究[学位论文]硕士 2006

10. 夏志刚 中药外用治疗马拉色菌性皮肤病的临床观察与药敏研究[学位论文]硕士 2006

11. 房世杰. 朱静. 汪旭 维生素K3在MTT比色法检测真菌数量中的剂量关系探讨[期刊论文]-中国临床药理学与治疗学 2005(12)

12. 林晨. 张晶. 沈伟哉. 岑颖洲. 江振友 枸骨叶不同溶媒萃取物对二种念珠菌作用的研究[期刊论文]-中国人兽共患病杂志 2005(9)

13. 龚晓霖. 储怡星. 范基农. 姜敏. 娄峥 真菌感染及其药敏试验方法[期刊论文]-检验医学 2005(1)14. 郭以河. 张闽峰. 孟家榕 MTT法体外药敏试验研究进展及临床应用[期刊论文]-东南国防医药2005(1)

本文链接：http://d.g.wanfangdata.com.cn/Periodical_jndxxb200306008.aspx

第24卷第6期2003年12月暨南大学学报（医学版）

（Medicine Edition ）JournaI of Jinan University VoI.24No.6

Dec. 2003

!"" 法在抗真菌药敏实验中的应用

张

晶1，林

晨1，岑颖洲2，沈伟哉1，刑莹莹2，

静1，李小兰1

江振友1，袁桂秀1，韦

（暨南大学1. 医学院微生物与免疫学教研室；2. 生命科学技术学院化学系，广东广州510632）［摘

要］目的：研究MTT 法在抗真菌药敏实验中的应用。方法：采用美国临床实验室标准化委

员会（NCCLS ）推荐方案测定两性霉素B 和伊曲康唑对5种常见真菌（白色念珠菌、光滑念珠菌、季也蒙念珠菌、申克孢子丝菌和石膏样小孢子癣菌）的最低抑菌浓度（MIC ），终点判定分别采用NC-对两法进行比较。结果：CLS 推荐的直接观察法和MTT 法，MTT 法与常规直接观察法进行MIC 终点判定所得结果具有很好的一致性。MTT 法测得的A 值与接种菌量具有正相关性。两性霉素B 与伊曲康唑对丝状真菌和念珠菌都具有很好的抑制作用，MTT 法测得的A 值随药物浓度的增加而显著降低。结论：准确，且可量化，因而可以很好的替MTT 法较之常规直接观察法结果更为客观、代肉眼观察法来判定真菌药敏试验的终点。

［关键词］真菌药敏实验；MTT 法；最低抑菌浓度；NCCLS 方案［中图分类号］R446.5

［文献标识码］A

［文章编号］1000-9965（2003）06-0036-05

近年来，随着免疫抑制剂的广泛应用，导管插管的普遍开展，广谱抗生素的大量应用，烧伤抢救、放射治疗、器官移植广泛进行，特别是免疫缺陷患者，尤其是艾滋病患者的不断增加，真菌病的发病率有逐渐增加的趋势。自美国国家临床实验室标准化委员会（NationaI Committee

分别于1997年推出了《关于酵母菌的液体培养基稀释for CIinicaI Laboratory Standards ，NCCLS ）

抗真菌药敏试验方案》（M27-A ）和1998年推出《产孢丝状真菌的液基稀释抗真菌药敏实验参

［1，2］

后，标准化的真菌药敏实验已经逐步普及起来。目前临床对真菌药敏实考方案》（M38-P ）

验结果判断常规采用肉眼观察法。MTT 法由于可通过测得A 值对结果进行量化分析，较之肉

眼观察法更为客观、灵敏，易于进行统计分析，因而具有更大的临床应用价值。本研究采用（minimum inhibitory concentration ，判定，并与常MTT 法对临床常见真菌进行最低抑菌浓度MIC ）规直接观察法进行比较，以便了解MTT 法在抗真菌药敏实验中的应用情况。

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材料与方法

菌种

白色念珠菌（C. albicans ，、申克孢子丝菌（S. schenckii ）、石膏样小孢子癣菌ATCC10231）（T. gupseum ），为暨南大学医学院微生物教研室收藏菌种。

［收稿日期］2003-06-13

［基金项目］国家自然科学基金项目（20172020）省自然科学基金项目（粤科基（2001）广东省重点基金项目10号-010401）

（013203）

［作者简介］张

晶（1976-），女，硕士研究生，研究方向：感染与免疫. 通讯联系人：林

晨. TeI （020）85220257.

第6期张晶等：MTT 法在抗真菌药敏实验中的应用

37

光滑念珠菌（C. glabrata ，、季也蒙念珠菌（C. guiliermondii ，系广州市ATCC2001）ATCC6260）孙逸仙纪念医院皮肤科真菌室席艳丽教授赠送菌株。1. 2

抗真菌药物

两性霉素B （Amp1otericin B ）购自Sigma 公司，伊曲康唑（Itraconazoie ，ICZ ）西安杨森制药公司出品。用质量分数100%二甲基亚砜（DMSO ）将两种药物溶解，然后用无菌蒸馏水制备成质量浓度1280! 存于-20C 冰箱备用。g /mL 溶液，1. 3培养基

［3］

沙氏培养基、马铃薯培养基、（pH 7. 0，RPMI -1640液体培养基0. 165moi /L MOPS 缓冲液）。

1.4

MTT 试剂

购自美国Amresco 公司，用pH 7.2PBS 配制成5mg /mL ，0. 22! m 滤器过滤除菌，4C 避光保存。

真菌接种液的制备

各受试念珠菌株在沙氏培养基上转种2次，以确保其纯度和生长力，培养温度自始至终为

1. 5

选择直径大于1mm 的菌落5个，将其用质量分数为0.85%的无菌盐水35C 。经241培养后，

制成悬液。用血细胞计数板计数孢子，调整含菌量，使集落形成单位（coiony forming unit ，CFU ）再稀释10倍，为1X 106~5X 106/mL 。接种时用RPMI -1640培养液将其稀释200倍后，CFU 调至0.5X 103~2.5X 103/mL 。

丝状菌株需在马铃薯葡萄糖琼脂培养基上30C 活化并纯化7c 后，取质量分数为0. 85%的无菌盐水1mL 加入培养7c 的培养皿中，用巴氏吸管轻轻抽吸，将菌悬液吸至无菌试管中，静置3~5min 后，取上部匀质液体（含孢子或孢子囊孢子和菌丝片断），在振荡器上振荡15s 。用血细胞计数板计数，调节CFU 为0.4X 106~5X 106/mL 。再将上述菌悬液用RPMI -1640稀释50倍得2倍最终含菌量（CFU 为0.4X 104~5X 104/mL ）的菌悬液备用。为保证试验准确性做菌落计数，取0.01mL 上述菌悬液接种于改良沙氏琼脂平皿中，每天观察，计数菌落。1. 6接种

用RPMI -1640培养液采用倍比稀释法稀释抗真菌药物，使成8~0. 16! g /mL 的系列倍比质量浓度。于96板每行1~10列孔内加入系列稀释药液100! 同时做3行复孔。第11孔为L ，阴性对照；阴性对照孔不加。置12孔为阳性对照。加入已制备的真菌溶液100! L 于各孔中，湿盒内孵育。念珠菌35C 孵育241，丝状菌30C 孵育481。1. 7

终点判定

直接观察法：孵育结束后，肉眼观察结果，首先观察阳性对照孔内若出现浑浊沉淀，即示真菌在该条件下生长良好，再确定阴性孔内无沉淀，示无任何微生物污染，再从高至低浓度逐个检查真菌被抑制生长情况。伊曲康唑由于具有拖尾现象，以开始出现微混的孔（即阳性对照孔被抑制达80%以上的孔）的药物质量浓度作为其MIC ，对两性霉素B 的MIC 则以菌完全被抑制的药液质量浓度为MIC 终点。

于孵育结束前3~41，每孔加入MTT 液10! 继续培养3~41后，吸出上清100MTT 法：L ，

加入二甲基亚砜（DMSO ）震荡5min 后，用酶标仪（BioRAD 450型微孔板判读仪）测L ，100! L ，!

吸光度A （测量波长570nm ，参考波长655nm ）。同样以被抑制达80%的孔的药液质量浓度作

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暨南大学学报（医学版）2003年

为伊曲康唑的MIC ，以完全被抑制的孔最低药物质量浓度作为两性霉素B 的MIC 终点。

为确保实验结果的准确性和可重复性，本实验结果均为3次实验的重复结果。

2

2.1

结果

直接观察法与MTT 法测定抗真菌药物MIC 结果的比较

表1真菌C. albicans C. glabrata C. guiliermondii S. schenckii T. gupseum

肉眼法与MTT 法测定MIC 结果

Amphotericin B 直接观察法0.250.1250.250.50.5

MTT 法0.250.1250.250.250.5

直接观察法0.1250.50.1250.250.5

g /mL !

本实验依照NCCLS 推荐方案M27-A 和

（Amphotericin B ）和伊M38-P 测定两性霉素B

曲康唑（Itraconazole ）对5种常见真菌（白色念

珠菌、光滑念珠菌、季也蒙念珠菌、申克孢子丝菌和石膏样小孢子癣菌）的MIC 值，判定结果分别采用直接观察法和MTT 法，结果显示，除两种药物对申克孢子丝菌的MIC 和伊曲康唑对白色念珠菌的MIC 均有一个浓度倍比的差异外，两种方法所得MIC 完全一致。结果如表1。2.2

接种菌量对MTT 测定结果的影响为探讨菌量与MTT

形成甲

的

Itraconazole

MTT 法0.0630.50.1250.50.5

值的相关分析

参数r P

C. albicans 0.7690.010

C. glabrata 0.8170.000

C. guiliermondii

0.9520.000

S. schenckii 0.5650.028

T. gupseum 0.9160.000

2.3用MTT 法对两性霉素 与伊曲康唑抑菌效果比较

选用两性霉素B 和伊曲康唑测定它们对5种常见真菌的抑菌效果，根据MTT 法测的A 值算得两性霉素B 和伊曲康唑各浓度对5种真菌的抑制率。

抑制率=（1-测定孔A 值/阳性对照孔A 值）见图2、>100%，3。

法在抗真菌药敏实验中的应用

（

F

，

死

量

的的

40

暨南大学学报（医学版）2003年

极大的应用前景。

［参考文献］

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Study of MTT assay for antifungal susceptibility testing

ZHANG Jing 1，LIN Chen 1，CEN Ying -zhou 2，SHEN Wei -zai 1，XING Ying -ying 2，

JIANG Zhen -you 1，YUAN Gui -xiu 1，WEI Jing 1，LI Xiao -ian 1

（1. Medicai Coiiege ；2. Coiiege of Life Science and Technoiogy ，Jinan University ，Guangzhou 510632，China ）

［Abstract ］Aim ：To study MTT assay in the appiication of antifungai susceptibiiity testing. Meth-ods ：antifungai susceptibiiity testing of amphotericin B and Itraconazoie for 5normai fungai strains （C. aibicans ，S. schenckii ，C. giabrata ，C. guiiiermondii and T. gupseum ）were performed by reference

. The minimum inhibitory con-method of Nationai Committee for Ciinicai Laboratory Standard （NCCLS ）

（MIC ）were determined by MTT assay and routine direct observing assay separateiy. These centration

MIC vaiues from two assay were compared with each other. Results ：The MTT assay and routine direct observing to determine endpoint are good identicai. The ! vaiues of MTT assay has good correiativity with numbers of viabie fungi. The resuits showed that the fungi were inhibited significantiy in the presence of Amphotericin B or Itraconazoie. The ! vaiues of MTT assay decreased asg the increase of the concentra-tion of antifungai drugs. Conclusion ：MTT assay is more objective ，more precise than routine direct ob-serving ，then it can repiace routine direct observing assay to determine antifungai endpoint.

［Key words ］antifungai susceptibiiity testing ；MTT ；minimum inhibitory concentration （MIC ）；reference method of NCCLS

［责任编辑：李弘］

MTT法在抗真菌药敏实验中的应用

作者：作者单位：

张晶， 林晨， 岑颖洲， 沈伟哉， 刑莹莹， 江振友， 袁桂秀， 韦静， 李小兰

张晶,林晨,沈伟哉,江振友,袁桂秀,韦静,李小兰(暨南大学医学院微生物与免疫学教研室,广东,广州,510632)， 岑颖洲,刑莹莹(暨南大学生命科学技术学院化学系,广东,广州,510632)

暨南大学学报(自然科学与医学版)

JOURNAL OF JINAN UNIVERSITY（NATURAL SCIENCE & MEDICINE EDITION）2003,24(6)14次

刊名：英文刊名：年，卷(期)：被引用次数：

参考文献(8条)

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4. 王文莉;王端礼;李若瑜 酵母菌的NCCLS方案药敏试验方法及其应用 1997(02)

5. Jahn B;MARTIN E;STUEBEN A Susceptibility testing of Candida albicans and Aspergillusspecies by a simple microtiter menadione-augmented 3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide assay[外文期刊] 1995(03)

6. National committee for clinical laboratory standards Reference Method for BrothDilution Antifungal Sesceptibility Testing of Yeast Tentative Standard M27-T 19957. 孙志坚;李若瑜;李东明 产孢丝状真菌NCCLS药敏试验方法的应用[期刊论文]-中华检验医学杂志2001(01)

8. 王文莉;郑玮清;李若瑜 采用NCCLS M27-A方案微量法检测念珠菌对抗真菌药物的敏感性[期刊论文]

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引证文献(14条)

1. 王晓慧. 刘伟. 李若瑜 申克孢子丝菌体外药敏试验研究近况[期刊论文]-中国真菌学杂志 2009(2)2. 杨继君. 陈兴平 外排泵基因在白念珠菌生物膜耐药性产生中的作用[期刊论文]-中国皮肤性病学杂志 2008(9)

3. 郑憧娇. 赵恕. 张虹 抗真菌药物体外药敏试验方法的比较[期刊论文]-中国微生态学杂志 2008(3)4. 滕炳会. 于长平. 邱勇. 张克伟 用MTT法检测抗真菌药物对白念珠菌的敏感性[期刊论文]-医学理论与实践 2008(2)

5. 杨继君. 陈兴平 白念珠菌生物膜形成不同时期对氟康唑的敏感性[期刊论文]-华中科技大学学报(医

学版) 2007(6)

6. 滕炳会. 于长平. 邱勇. 吴梅. 张克伟 念珠菌三种体外药敏试验方法的比较研究[期刊论文]-中国麻风皮肤病杂志 2007(10)

7. 滕炳会. 于长平. 杜文莉. 张克伟 43株念珠菌分离鉴定和药敏试验研究[期刊论文]-预防医学论坛2007(8)

8. 王莉. 赵俊英. 徐薇. 蒋大林. 汪莉 口服伊曲康唑在人角质层抗念珠菌活性的研究[期刊论文]-首都医科大学学报 2006(6)

9. 史淑娟 消炎痛抑制白色念珠菌菌丝形成的实验研究[学位论文]硕士 2006

10. 夏志刚 中药外用治疗马拉色菌性皮肤病的临床观察与药敏研究[学位论文]硕士 2006

11. 房世杰. 朱静. 汪旭 维生素K3在MTT比色法检测真菌数量中的剂量关系探讨[期刊论文]-中国临床药理学与治疗学 2005(12)

12. 林晨. 张晶. 沈伟哉. 岑颖洲. 江振友 枸骨叶不同溶媒萃取物对二种念珠菌作用的研究[期刊论文]-中国人兽共患病杂志 2005(9)

13. 龚晓霖. 储怡星. 范基农. 姜敏. 娄峥 真菌感染及其药敏试验方法[期刊论文]-检验医学 2005(1)14. 郭以河. 张闽峰. 孟家榕 MTT法体外药敏试验研究进展及临床应用[期刊论文]-东南国防医药2005(1)

本文链接：http://d.g.wanfangdata.com.cn/Periodical_jndxxb200306008.aspx